JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

קלינית, מחסור באסטרוגן בנשים בגיל המעבר עלול להחמיר את השכיחות של שיבוש השומנים טרשת עורקים. הקמנו במודל למחסור באסטרוגן vivo על-ידי כריתת אופוקטומיה דו צדדית באמצעות חתך כפול-רוחבי-לרוחב ב-apoE-/- עכברים. מודל העכבר ישים לסינון טיפולי אסטרוגן אקסוגני של בעיות לב וכלי דם לאחר גיל המעבר.

Abstract

נשים שלאחר גיל המעבר נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות לב וכלי דם מאשר נשים טרום גיל המעבר. עכברים נקבה ovariectomized (OVX) בתצוגה הגמילה גדל נגעים טרשת עורקים העורקים בהשוואה לעכברים נקבה עם תפקוד השחלות שלמות. עם זאת, מעבדה מודלים מעורבים עכברים לקוי אסטרוגן עם מצב נוטה טרשת עורקים חסרים. גרעון זה הוא חיוני כי מחסור באסטרוגן קליני בנשים בגיל המעבר עלול להחמיר את השכיחות של שיבוש קיים מראש או מתמשך טרשת עורקים. במחקר זה, אנו להקים מודל vivo אסטרוגן לקוי של העכבר על ידי הניתוח הדו באמצעות שכפול באמצעות החתך הצדדי כפול ב אפוליפופרוטאין E (apoe)-/- עכברים. לאחר מכן נשווה את ההשפעות של 17β-estradiol ו פסבדו-הפסטודיסין (PPD) (פיטואסטרוגן) המנוהל באמצעות כפולת אגוזי לוז. אנו מוצאים כי למרות PPD מפעילה כמה השפעה על הפחתת משקל הגוף הסופי ופלזמה TG ב OVX apoE- עכברים, יש לו אנטי-טרשת עורקים ויכולות להגנה לב בדומה לעמיתו 17β-estradiol שלה. PPD הוא פיטואסטרוגן שדווחו להפעיל תכונות אנטי-סרטניים. כך, השיטה המוצעת ישימה לסינון פיטואסטרוגנים באמצעות המינהל הפראורלי להחליף עבור טיפול הורמונלי חלופי המסורתית בנשים לאחר גיל המעבר, אשר דווחו יש פוטנציאל למניעת השטרוגנטיות קיבולת. הממשל הפראורלי באמצעות כפולת אגוזי לוז אינו פולשני, והוא מהווה עיבוד נרחב לחולים רבים. מאמר זה מכיל צעד אחר צעד הפגנות של כריתת אושתנים דו צדדית דרך החתך כפול ולרוחב ב apoE-/- עכברים וperoral 17β-estradiol או החלפת הורמון האסטרוגן באמצעות התפשטות אגוזי לוז. השומנים פלזמה ניתוח תפקוד לב וכלי דם באמצעות האקו לעקוב.

Introduction

מחקרים אפידמיולוגיים וקליניים הראו כי נשים בגיל המעבר הם בסיכון גבוה במידה ניכרת של מחלות לב וכלי דם מאשר נשים טרום גיל1,2. טיפול הורמונלי החלפת (HRT) עשוי להפחית את הסיכון היחסי של מחלות לב וכלי דם 0.37-0.793. בין היתר סיבוכים, טרשת עורקים נגרמת על ידי מחלות לב וכלי דם היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם4. עם זאת, מעבדה מודלים מעורבים עכברים לקוי הצגת מצב נטייה טרשת עורקים חסרים. פרוטוקול זה מספק מודל העכבר vivo מחסור באסטרוגן להקרנה טיפולי אסטרוגן אקסוגני של בעיות לב וכלי דם לאחר גיל המעבר.

מחקרים קודמים מראים כי היישום של ovx ב טרשת עורקים מכרסמים האכילו דיאטה כולסטרול גבוה יכול לחקות נשים בגיל המעבר הסובלים טרשת עורקים5,6,7,8. מודל בעלי חיים ונוח הדומה למצב הטרשת עורקים בנשים בגיל המעבר הוא הבסיס למחקר אסטרוגן אקסוגני. כאן, החתך כפול מראש לרוחב של כריתת האווליטומיה הדו הוחל בחוסר טרשת עורקים מועדים בנוקאאוט E (apoe-/-) עכברים9,10. לעומת באמצע הבטן או החתך העצמי, החתך כפול ולרוחב הוא קל, פחות זמן לגזול שיטה שיכולה למנוע הדבקה חמורה של חלל הבטן ודלקת. המינהל הפראורלי באמצעות התפשטות אגוזי לוז (ראה שולחן החומרים) אינו פולשני ונוח, והוא מתאים באופן נרחב למצב ניהול לטווח ארוך11. השתלת הגלולה לאט שחרור הוא גם פופולרי6. עם זאת, שתלים מחמירים את השכיחות של זיהום במיוחד עכברים נתון OVX. מצבי ניהול אחרים שאינם פולשני, כגון gavage אוראלי ומינהל המים, יש גם החסרונות רבים. אוראלי gavage בדרך כלל עכברים לחץ ועלול לגרום לפציעה בוושט. ניהול ההורמון באמצעות מי השתייה מועיל מאוד; עם זאת, הוספת DMSO כמו אמולסיה הוא בלתי נמנע כמו אסטרוגני אקסוגניים אינם מסיסים במים. כאן, בחרנו peroral 17β-estradiol או החלפת הורמון האסטרוגן באמצעות התפשטות אגוזי לוז לניהול לטווח ארוך.

לאחרונה, את ההשפעה המועילה של HRT על מערכת לב וכלי דם של נשים בגיל המעבר כבר התחרו ביוזמת בריאות הנשים () מבחנים12. מצד אחד, אסטרוגן אקסוגני לבדו מפעיל השפעה מועילה על מערכת לב וכלי דם; לעומת זאת, הוא יכול לשלב עם אצטט הידרו הפרוגסטרון מידי כדי להגביר את הסיכון לאירועי לב וכלי דם. ברצינות רבה יותר, HRT עלול להוביל התקדמות הגידול בשד והרחם, ואפקט זה הגביל במידה ניכרת את השימוש בו13,14. עניין רב יותר התמקד השפעות לב וכלי דם של אסטרוגני אקסוגניים חסר פעילות mitotic בתאים סרטניים15,16,17. מחקרים מרובים בבני אדם ובעלי חיים מראים כי פיטואסטרוגנים עם מבנים דומים לזה של אסטרוגנים יכולים לשחק תפקיד מועיל בהגנה על לב וכלי דם15,18.

כך, מטרות העבודה הנוכחית הם (i) כדי לבנות מודל העכבר vivo מחסור באסטרוגן על ידי הניתוח הדו באמצעות לחיצה כפולה על גבי לרוחב כפול ב-apoE-/- עכברים ו-(ii) כדי להשוות את ההשפעות הגנה לב וכלי דם של perorally מנוהל 17β-estradiol ו פסבדו-דרך (PPD), באמצעות כפולת אגוזי לוז. 17β-estradiol הוא סוג אחד של אסטרוגן אקסוגני השייכת לנשים הורמונים מיניים6,11,19. PPD, סאפונין סטרואיד ופיטואסטרוגן מצמחים דיאוזורע , דווח בעבר להפעיל תכונות אנטי סרטניים20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל טיפול בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה והמכללה הרפואית של האיחוד בפקינג (הרשאה מספר: SYXK (בייג) 2013-0023). המקור של apoe- עכברים הוא C57BL/6j9,10.

1. כריתת אונוקטומיה דו צדדית באמצעות כפול-חתך לרוחב ב-apoE- עכברים

  1. בגמילה (גיל 28 ימים), מורדם נקבה apoE-/- C57BL/6j עכברים עם avertin (triרומטוזיס; 200 מ"ג/ק"ג; intraperitoneally).
    הערה: 32 apoe-/- עכברים חולקו באופן אקראי ל 4 קבוצות: מדמה, ovx, ovx/E2, ו ovx/PPD (n = 8 לכל קבוצה).
  2. מניחים את החיה בתנוחה מועדת על משטח חימום. החלת סיכה העין להגנת העין במהלך ההרדמה.
  3. לשמור על טמפרטורת הגוף בתוך 36 ± 0.5 ° c. ניהול 5 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של carprofen תת-עורי משכך כאבים להיבט הרוחבי של הצוואר של העכבר.
  4. לגלח 3 x 5 ס מ2 העכבר באזור מתוך הרכס כסל. לפני כיסוי בעל החיים עם 3 x 5 ס מ2 כירורגי הצמצם גיליון, לנקות את האזור מגולח ביסודיות עם יוד ולאחר מכן 70% אתנול. השתמש בכלים ובכפפות סטריליים במהלך הניסוי.
  5. השימוש מספריים מלקחיים לעשות חתך 1 ס מ לרוחב לקו האמצע ו 1 ס מ לרוחב הצלעות הקוסטל.
  6. מנתחים את רקמת העור. בעזרת מלקחיים
  7. השתמש במשקפת מבתר (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את רקמת השומן הלבנה בחלל הבטן.
  8. השתמש מיקרו מספריים ומיקרולקחיים לעשות חתך של 0.5 1 ס מ דרך fascia עד חלל הבטן הוא הגיע.
    הערה: לקבוצה הפועלת באמצעות התחזות, סגרו את הפצעים ישירות. תפר את שכבת השריר ואת העור בנפרד באמצעות תפר מונופינט.
  9. כאשר ניתן לראות את רקמת השומן הלבנה בחלל הבטן, תפסו את רקמת השומן בעזרת מלקחיים ובעדינות משוך אותו החוצה. ניתן לראות שחלה ורודה בצורת תות עטוף ברקמת אדיפוז בחלל הבטן.
  10. ליגייט הספינה הארוכה ביותר של 0.5-1 ס מ וקרן הרחם באמצעות תפר מונופינט. הסר את השחלה באמצעות מיקרו מספריים ומניחים את הרקמה הנותרת בחזרה לחלל הבטן.
    הערה: התופעות השליליות העיקריות לפעולת ה-OVX היא הארכה של השופכה המובילה לתמותה גבוהה בעכברים מופעלים בOVX. ניתן להימנע מכך על ידי זיהוי רקמות באמצעות מבתר.
  11. . סגרו את הפצעים תפר את שכבת השריר ואת העור בנפרד באמצעות תפר מונופינט.
  12. השימוש מספריים מלקחיים לעשות עוד חתך 1 ס מ לרוחב לקו האמצע ו 1 ס מ לרוחב הצלעות הקוסטל בצד השני. חזור על ההליך הנ ל (1.5 עד 1.11).
  13. . תן לחיה להתעורר מהרדמה בנפרד לשמור על העכבר ביום הראשון לאחר הניתוח.
  14. נקה או החלף את הכלוב לעתים קרובות במהלך שלב ההחלמה.
  15. כ 24 שעות לאחר הניתוח, ניהול אחר 5 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של carprofen תת-עורי משכך כאבים.

2. מינהל פרפה של 17β-אסטרדינול או PPD באמצעות ממרח אגוזי לוז

  1. מתמוסס ביסודיות 17β-estradiol או PPD בשמן שומשום, ולאחר מכן מערבבים את שמן הסומסום עם התפשטות אגוזי לוז (ראו טבלת חומרים). חלק יומי עבור כל 30 g העכבר מכיל 3 μg של 17β-estradiol או 15 μg של PPD, 4 μL של שמן שומשום, ו 60 מ ג של כפולת אגוזי לוז. להכין פלצבו עבור כל 30 g העכבר מכיל 4 μL של שמן שומשום ו 60 מ ג של כפולת אגוזי לוז.
    הערה: החלק היומי של המינהל של 17β-estradiol או PPD היה מבוסס על מחקרים קודמים6,11 וניסויים מוקדמים.
  2. שבוע לאחר OVX, להאכיל את העכברים עם דיאטה כולסטרול גבוה (1.25% כולסטרול, 0% המרה) עבור 12 שבועות. ערכת טיפול ניסיונית טיפוסית, כפי שהיא משמשת במחקר זה, מומחש באיור 1.
  3. 5 ימים לפני המינהל הפראורלי של התפשטות אגוזי לוז בשבוע 4, הרכבת עכברים לאכול את הפלצבו המכיל כ 30 מ ג לוז התפשטות עבור 2-5 עכברים עבור 5 ימים. הרכבת את העכברים בקבוצות בכלובים שלהם בבית במהלך 3 הימים הראשונים. מניחים את העכברים בכלובים נפרדים בימים הרביעי והחמישי של ההכשרה ומשרתים את החלק היומי כדי להידמות למצב הניסיוני.
  4. במהלך 9 השבועות האחרונים, מניחים את העכברים בכלובים נפרדים ולאחר מכן מגישים חלק יומי בחלק התפשטות אגוזי לוז עבור כל אירוע האכלה.
    הערה: מגישים חלק יומי המכיל 17β-estradiol (0.1 mg · ק"ג-1) או PPD (0.5 mg · ק"ג-1) באמצעות התפשטות אגוזי לוז ב ovx/E2 ו-ovx/בקבוצה PPD בהתאמה; מגישים חלק יומיומי המכיל התפשטות אגוזי לוז ללא הורמונים בקבוצת שאם ו-OVX.

3. קביעת אינטימה-עובי מדיה ותפקוד לב באמצעות מערכת מיקרוטרקול

  1. בדיקת אולטרה-גוניות
    1. יום אחד לפני סיום, לבחון את עובי התקשורת intima ותפקוד הלב באמצעות מערכת סאונד מיקרוטרקול (ראה טבלת חומרים) כפי שתוארה בעבר21.
    2. לפני בדיקה, לתת לכל עכבר 200 mg/ק"ג הזרקת הצפק של avertin (triרומטוזיס) כמו הרדמה (n = 8 עכברים לכל קבוצה).
    3. גלח בזהירות את שיער הצוואר של כל עכבר. החל ג'ל שידור חם אולטרסאונד ליבראלי כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית.
    4. לקבל תמונות ultrasonographic בסיסית של השורש אבי העורקים בסדר העורקים עם הראש 30 MHz לסרוק במוקד 12.7 מ"מ ברזולוציה של 40 μm.
    5. השתמש באלקטרוקרדיוגרפיה עם תצורה מובילה II לניטור.
    6. ללכוד את הזכות בתמונות ציר ארוך של אבי העורקים העולה, קשת אבי העורקים, וענף עורק העורקים בזרוע במטוס אחד סיסטולה (איור 3).
  2. מדידות של אינטימה-מדיה ועובי רובד מקסימלי
    1. להתאים את המרחק בין מתמר לאתר העורקים בקלות כדי לקבל תמונות ברורות.
    2. לאחסן לולאה של 10 s cine דיגיטלית עבור בדיקה לא מקוונת על מערכת ניתוח תמונה.
    3. בחרו תמונה מיטבית של מסגרת ההקפאה באולטרסאונד באופן ידני למדידות נוספות. בדוק את התמונות בעקמומיות המשנית של העורקים העולים. אם ניתן לראות את הפלאק במעלה העורקים העולה, למדוד את עובי הרובד המקסימלי. אם לא ניתן לראות את הפלאק במעלה העורקים העולה, למדוד את ה-IMT המקסימלי.
    4. למדוד את IMT (מרחק בין ממשק כלי הדם לומיאל לבין הממשק המדילי-האדוטי). מדידת עובי הרובד המקסימלי (המרחק העבה ביותר בין הגבול של לומן כלי הדם לבין השכבה האדוירית).
    5. ממוצע הנתונים מתוך שלושה אתרי הנגע (איור 3).
  3. קביעת תפקוד הלב לקוי באמצעות אקוקרדיוגרפיה
    הערה:     לבחון את תפקוד הלב באמצעות האקו באמצעות מערכת סאונד מיקרוטרקול, כפי שמתואר בעבר22.
    1. מכוונים קרן אולטרה סאונד לכיוון הלב, ליד שרירי הלסת.
    2. השג הדמיה דו-מימדית. מבוססת קילוהרץ
    3. לבצע בתוך האקו vivo החזה של החדר השמאלי באמצעות לסרוק 30 MHz הראש.
    4. למדוד את הפרמטרים המשויכים לתפקוד הלב באופן דיגיטלי מפני מדידת מצב M.
    5. ממוצע הנתונים מתוך שלושה עד חמישה מחזורי לב (שולחן 1).
  4. שינויים בפנים ובמתבונן
    1. לצורך אימות של השונות התוך-משקיף, לנתח את הנתונים על ידי אופרטור אחד בשני מקרים שונים.
    2. להערכת ההבדלים בין המתבונן, לנתח את הנתונים על ידי אופרטור אחר.

4. משקל גוף שבועי מדידה הכולל פלזמה כולסטרול (TC) וטריגליצרידים (TG) הגדרה

  1. מדידת משקל גוף שבועי
    1. מדידת משקולות הגוף פעם בשבוע משבוע -1 עד שבוע 12.
      הערה: n = 8 עכברים לכל קבוצה.
  2. הכנת פלזמה
    1. לפני איסוף דגימות דם דרך ניקוב תאיים, להכין מזרקים וצינורות. השתמש ב-EDTA כנוגד קרישה. הוסף 10 μL של 0.5 M EDTA ל 2 מזרק mL, ולהוסיף 8 μL של 0.5 M EDTA לכל 1.5 mL שפופרת.
    2. בשבוע 12, אחרי לילה מהיר, מורדם העכברים עם avertin (triרומטוזיס; 200 mg/ק"ג; intraperitoneally).
      הערה: n = 3 עכברים לכל קבוצה.
    3. הכינו את אזור החזה הגחוני. עם 70% אתנול
    4. השימוש במספריים ומלקחיים כדי לפתוח את חלל החזה ולחתוך את הצלעות עד שהלב הפועם נחשף.
    5. הכנס את המחט של 25 גרם לחדר הימני. מנושף לאט עד שהדם מתחיל. לזרום לתוך המזרק
      הערה: אנו משתמשים מזרקים חד פעמיים במצב סטרילי עם 25 גרם מחטים (ראה לוח חומרים).
    6. . המשך ללחוץ בזהירות, אפילו לחץ אם לא נראה דם, מקם מחדש את המחט ושאיפה חוזרת.
    7. השאר עכברים מורדם עמוקות לפני איסוף נפח הדם הנדרש. בדרך כלל, ניתן לאסוף עד 1 מ ל של דם. המתת החסד העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם תחת זה מצב עמוק הרדמה.
    8. הפיפטה דגימות דם לתוך צינורות 1.5 mL ולהפוך את הדם ביסודיות כדי להבטיח ערבוב EDTA לתוך הדם. . ואז הצב דגימות דם על הקרח מיד
    9. דגימות צנטריפוגה עבור 20 דקות ב 400 x g ב 4 ° c בתוך 30 דקות של אוסף.
    10. אסוף את הסופרנטנט בזהירות. מחלקים ומאחסנים דגימות פלסמה ב-80 ° c.
  3. בניית עקומות סטנדרטיות למדידת תוכן TC או TG
    1. עבור עקומת התקן TC, להכין ריכוזים שונים של תקני כולסטרול: 0 ממול/L, 0.52 ממול/l, 1.03 mmol/L, 2.07 m מול/L, 4.14 mmol/L, 6.20 m מול/L, 8.27 m מול/L ו-10.34 mmol/L. מדידה מנת יתר עבור כל תקן כולסטרול. הגדרת מנת יתר ממוצעת עבור כל תקן כולסטרול. כערך הציר האנכי (Y), קבע את הריכוז כערך הציר האופקי (X). צור עקומה סטנדרטית באמצעות תוכנה סטטיסטית.
    2. עבור עקומת TG, הכינו ריכוזים שונים של תקני TG: 0 ממול/L, 0.45 ממול/l, 0.90 m מול/L, 1.81 m מול/L, 3.62 mmol/L, 5.42 m מול/L, 7.23 m מול/L ו-9.04 mmol/L. מדידה למנת יתר עבור כל תקן TG. הגדר מנת יתר ממוצעת עבור כל תקן TG כערך הציר האנכי (Y); קביעת הריכוז כערך הציר האופקי (X). צור עקומה סטנדרטית באמצעות תוכנה סטטיסטית.
      הערה: התאמת עקומה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים (4-pl) שימש לבניית העקומה הסטנדרטית במחקר הנוכחי. בדוק את עקומת התקן לפני מדידת דגימות פלזמה ולוודא r2 גדול מ 0.995.
  4. מדידת תוכן TC
    1. סמן את בקבוק מגיב הצבע (25 mL) מערכת שיטת TC בתור "פתרון עבודה TC".
    2. מערבולת את דגימות הקירור לזמן קצר. הכנת דילול: 20 μL של פלזמה ב-80 μL של מים מזוקקים. . לקצר את המערבולת
    3. הוסף 2.5 μL של תקני כולסטרול (5.17 mmol/L) או 2.5 μL של פלזמה מדולל או 2.5 μL של מים מזוקקים (ריק) לבארות המתאימות של צלחת 96-באר. מומלץ לTriplication.
    4. לכל הבארות, הוסף 250 μL של מגיב הצבע.
    5. מודקון ב 37 ° c עבור 10 דקות.
    6. הפוך את הקורא המיקרו-לוחית והרשה 10 דקות להתחמם.
    7. להסיר את הצלחת (ים) מן החממה ולקרוא את הקורא מיקרופלייט ב 510 nm. ודא כי שום בועות או אבק נמצאים בבארות microtiter או בתחתית הצלחת, בהתאמה.
    8. חשב את הריכוז TC כדלקמן:
      המשך TC = רמת כולסטרול × (דגימת פלזמה ממנת יתר)/(תקן כולסטרול למנת יתר-ריק O. D)
  5. מדידת תוכן TG
    1. סמן את בקבוק מגיב הצבע (25 מ ל) מערכת שיטת TG כ-"פתרון העבודה TG".
    2. מערבולת את דגימות הקירור לזמן קצר.
    3. הוסף 2.5 μL של התקנים TG (2.26 mmol/L) אל או 2.5 μL של פלזמה מדולל או 2.5 μL של מים מזוקקים (ריק) לבארות המתאימות של צלחת בגודל 96. מומלץ לTriplication.
    4. לכל הבארות, הוסף 250 μL של מגיב הצבע.
    5. מודקון ב 37 ° c עבור 10 דקות.
    6. הפוך את הקורא המיקרו-לוחית והרשה 10 דקות להתחמם.
    7. להסיר את הצלחת (ים) מן החממה ולקרוא את הקורא מיקרופלייט ב 510 nm.
      הערה: ודא כי הם לא בועות או אבק נמצאים בבארות microtiter או בתחתית הצלחת.
    8. חשב את הריכוז TG כדלקמן:
      המשך TG. = המשך התקנים של TG (דגימת פלזמה)/(תקן TG-למנת יתר)

5. En ניתוח פנים של הנגעים טרשת עורקים אבי העורקים

  1. בידוד וכריתה של העורקים
    1. בשבוע 12, אחרי לילה מהיר, מורדם העכברים עם avertin (triרומטוזיס; 200 mg/ק"ג; intraperitoneally). המתת החסד העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם תחת זה מצב עמוק הרדמה.
      הערה: השתמשנו בשלושה עכברים לכל קבוצה.
    2. הכינו את אזור החזה הגחוני. עם 70% אתנול השימוש במספריים ומלקחיים כדי לפתוח את חלל החזה ולחתוך את הצלעות עד שהלב הפועם נחשף.
    3. ממלאים מזרק 50 mL עם מלוחים באגירה פוספט ב-pH 7.4 (ראה לוח חומרים). הוסף 25 גרם מחט לתוך החדר השמאלי לחתוך את האטריום הימני כדי למנוע לחץ גבוה מן perfusion.
    4. בצע את הפרזיה באתרו בקצב הזרימה של 0.05-0.08 mL/min. לקלוט נוזל היתוך עם רקמות.
    5. הסרת צלעות והריאות חלל החזה עם מספריים מלקחיים. ואז, לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את האיברים בתוך לתצוגה טובה יותר של אבי העורקים.
    6. להסיר את העורקים על ידי החזקת הלב עם המיקרולקחיים והפרדת העורקים מעמוד השדרה.
      הערה: כאשר מבתר ליד הענפים פרפור הכליות, לחתוך עמוק באמצעות מיקרו מספריים כדי למנוע נזק העורקים.
    7. תקן את הלב ואת העורקים עבור 48 h ב 4% פאראמפורמלדהיד. אחסן את הaortas בתמיסת מלח בטמפרטורת החדר או ב-2-8 ° c למשך מספר שעות.
      הערה: הליך זה יקל על הניקוי.
  2. הכנת העורקים
    1. . תסיר את הלב הסירו בזהירות את הרקמות האדוaortas מתוך השימוש במיקרולקחיים ובמיקרומיקרוטרים מתחת לstereomicroscope. השתמש תמיסת מלח כדי לשמור על הרקמה לחות במהלך הניקוי.
      הערה: היזהר לא לקרוע או לגנוב את העורקים וכמה ענפים חשובים, כגון עורק בלתי מקובל, שמאל עורק הראש המשותף, והשאיר עורק ריחי.
    2. ולנתק את כל העורק. השמאלי של העורק
    3. חותכים את העקמומיות החיצונית דרך העורק החיצוני, ואז לעורק הראש המשותף השמאלי ולאחר מכן לעורק התת-ממדי השמאלי.
    4. לחתוך לפתוח לאורך העקמומיות הפנימית של החלק העולה לתחתית החלק הבטן.
    5. להצמיד את העורקים שטוח על גיליון פלסטיק שחור להחיל תמיסת מלח כדי לשמור על aortas מפני ייבוש.
  3. דימוי של אזור האינטימיות של העורקים
    1. צלם תמונות של aortas face עם מיקרוסקופ סטריאו. כלול סרגל קנה מידה מילימטר בתמונות כדי לכייל מדידות.
    2. כלול את השער ואת אזורי החזה באותה תמונה ואת אזור הבטן באחר. שמירת תמונות כ-JPEG או TIFF.
      הערה: אזור הקשת הוא מן הצומת של שריר הלב עד 3 מילימטר מעורק ריחי שמאל, אזור החזה הוא 3 מ"מ מעבר לעורק ריחי שמאל העורק האחרון, ואת אזור הבטן הוא עורק הבינקוסטל האחרון כדי כסל סתעפות.
  4. קוונפיקציה של הנגע טרשת עורקים-en השיטה הפנים
    1. כיול
      1. פתח את התמונה עם תוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים), עבור לכיול המרחבי ובצע את ההוראות.
      2. שנה את יחידות ההתייחסות ל-mm על-ידי מיקום הסרגל מעל הקו.
    2. דידה
      1. הגדר כיול נכון עבור כל תמונה.
      2. מדידת 3 מ"מ על הסרגל.
      3. קשת ואזור החזה מדידה: מתווה את אזור הקשת מהצומת של שריר הלב כדי 3 מ"מ מתוך העורק ריחי השמאלי ואת האזור החזה מ 3 מ"מ מעבר לעורק התת-ממדי השמאלי לעורק הבינקוסטל האחרון. מעקב אחר נגעים בקשת ובאזור בית החזה ולהסתכל על העורקים דרך המיקרוסקופ.
      4. מדידה באזור הבטן: מתווה את אזור הבטן מקצה אזור החזה ועד הביפריון כסל. מעקב אחר נגעים באזור הבטן ולהסתכל על אבי העורקים דרך המיקרוסקופ.
      5. לחשב את אזור הנגע יחסית למשטח הפנימי של העורקים.
      6. בדיקת קוונפיקציה דרך משקיף שני העיוור לקבוצות הלימוד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ערכת טיפול ניסיונית טיפוסית, כפי שהיא משמשת במחקר זה, מומחש באיור 1. בגמילה (גיל 28 ימים), נקבה apoE-/- C57BL/6j עכברים היו מורדם withavertin (triרומטוזיס; 200 מ"ג/ק"ג; intraperitoneally). עכברים היו בקיעים OVX או הדמה מופעל דרך חתך 1 ס מ. שבוע לאחר OVX הדו, העכברים האכילו דיאטה כולסטר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המתודולוגיה המתוארת כאן היא מודל העכבר דמוי שיבוש השומנים טרשת עורקים לראות נשים בגיל המעבר. הוא מתועד היטב כי מחסור באסטרוגן בנשים בגיל המעבר יכול להחמיר את השכיחות של מראש קיים או מתמשך היפרכולסטרולמיה עם מורכבות בהדרגה atherosclerostic נגעים נפוצים1. כדי לחקות את המצב הנוטה טרשת ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81202526 כדי J.X.), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81302769 ל-בולשיט), הקרן העירונית של מדעי הטבע של בייג (47144226 ל-בולשיט), הדוקטורט הסיני קרן המדע (20110490325 ל-J.X.) והקרן ללימודי משרד החינוך של סין (20121106120031-בולשיט).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
17β-estradiol, >98%Sigma-AldrichE8875-250MGEstrogen
Disposable syringes (with 25 G needles)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0.5*19TWLBCardiac bleeding
High-cholesterol mouse dietHuafukang Bio-TechnologyN/A1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging SystemVisualSonicsVevo®770Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLPreparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella)FerreroN/AMedium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifierDohegan Optical Company Inc.N/AAssistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4SIGMAP3813Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate ReaderTecanInfinite M1000Plasma TC and TG determination
PseudoprotodioscinShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oilSigma-AldrichS3547-1LDissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Eye protection during anesthesia
Stereo microscopeMCALONMCL-6STVImage of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifugeSIGMA1-14KPreparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-5GPreparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA110-1Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA111-1Plasma TC determination

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved