הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.

Abstract

המתואר כאן הוא פרוטוקול ה-PCR כדי גנוטיפ העובר בשלב הגאולה של האנתוזואן לאחר הדלקת הקרום האנוטזיס מבלי להקריב את חיי החיה. בעקבות הפריה חוץ גופית ו-de-jellying, הזיטים מורשים להתפתח 24 שעות בטמפרטורת החדר כדי להגיע לשלב מוקדם עד באמצע הגאולה. העוברים הגאוטרולה מונחים לאחר מכן על מיטת ג'ל בצלחת פטרי המכילה מי ים. תחת מיקרוסקופ מבתר, מחט טונגסטן משמש בניתוח להפריד משבר רקמת הבורג מעובר כל. העוברים לאחר הניתוח מורשים להירפא ולהמשיך בפיתוח. דנ א גנומית מופק מרסיס רקמות מבודדים משמש כתבנית ל-PCR ספציפי לוקוס. ה-גנוטיפ ניתן לקבוע בהתבסס על גודל מוצרי ה-PCR או נוכחות/היעדרות של מוצרי PCR ספציפיים של allele. העוברים לאחר הניתוח ממוינים לאחר מכן לפי ה-גנוטיפ. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים שיוקרנו, אך הדבר מחייב את השעה 4 – 5 h. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות הסתרה מתוך אוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים ומאפשר ניתוח של פנוטיפים במהלך הפיתוח.

Introduction

החברה מייצגת קבוצה מגוונת של בעלי חיים הכוללים מדוזה, אלמוגים וכלניות ים. הם דיפלותקיעות, המורכב מעור ומעור, המופרדים על-ידי מטריצה מיגלנת (מזוגליא). Cנדבך היא קבוצת אחיות לסוגז בילוניה, שאליה מודלים מסורתיים של בעלי חיים כגון דרוסוהילה ומיוז שייכים ל- ¹. בנוסף, הסטייה מהקטריה-בילוניה התרחשה בתקופה הקדם-קמברנית². ככזה, מחקרים השוואתיים של בילנים ובילואים חיוניים לקבלת תובנות לגבי הביולוגיה של הקדמון המשותף העדכני ביותר שלהם. לאחרונה, גנומיקה השוואתית גילה כי הקטנים ו bilaterians חולקים הרבה גנים ערכת הכלים התפתחותיים כגון חריץ ו bhlh, רומז כי אבותינו המשותפים כבר היו אלה גנים³. עם זאת, התפקיד של גנים אלה ההתפתחותית הקדמון המשותף האחרון של Cנדבך ו Bilateria הוא זהובה פחות הבין היטב. כדי לטפל בבעיה זו, חשוב ללמוד כיצד לתפקד הגנים העמוקים הללו בתוך הקטרים.

אחד המודלים הגנטיים המתעוררים . הגנום שלה יש רצף³, ומגוון של כלים גנטיים, כולל שורסטינו-בתיווך גנים הסתרה, meganuclease-תיווך טרנסגנזה, ו CRISPR-Cas9-בתיווך גן knockins ו הסתרה, זמינים כעת לשימוש בחיה זו. בנוסף לכך , התפתחות ההתפתחות של הניפה מובנת באופן יחסי. במהלך הembryogenesis, הגסטרוציה מתרחשת על ידי הגבנות⁴, והעובר מתפתח לזחל בשחייה חופשית. לאחר מכן, הפלולה הופך לפוליפ סלוח עם פה וזרועות מעומות. הפוליפ גדל ומגיע לבגרות מינית.

Crispr-Cas9-בתיווך מוטגנזה ממוקדת המשמש כעת שימוש באופן שגרתי כדי ללמוד את התפקוד הגנטי בתוך להיות סטלה vectensis^5,6,^7,8,9. כדי ליצור מוטציות הנוקאאוט ב ne, קוקטייל המכיל לוקוס ספציפי מדריך יחיד rnas ו endonuclease Cas9 חלבון מוזרק תחילה לתוך ביצים לא מופרות או מופרות לייצר חיות מייסד F0 בדרך כלל להראות פסיפס. F0 בעלי חיים מוגשים לאחר מכן לבגרות מינית ועברו אחד עם השני כדי לייצר אוכלוסייה F1, תת קבוצה של אשר עשוי להיות מוטציות הנוקאאוט⁶. לחילופין, בוגרת מינית בעלי חיים F0 יכול להיות חצה עם חיות מסוג פראי כדי ליצור heterozygous בעלי חיים f1, ו f1 הטרוזיטים כי לשאת את אלל הנוקאאוט בתוך מקום העניין יכול אז להיות חצה אחד עם השני כדי לייצר הצאצאים F2, אחד ברבעון מהם צפויים להיות. מוטציות בנוקאאוט⁵ שתי הגישות דורשות שיטה לזיהוי מוטציות הסתרה מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית. הפוליפ זרועות ניתן להשתמש כדי לחלץ דנ א גנומית עבור גנוהקלדה^6,7. עם זאת, במקרים שבהם הפונקציה ההתפתחותית של גן העניין היא להיחקר ועוברי מוטציה אינם מגיעים לשלב הפוליפ (כלומר, עקב הפרשות הזחל הקשורות למוטציה), יש לזהות מוטציות הסתרה בתחילת האירוע. המתואר כאן הוא פרוטוקול PCR המבוסס על בעלי חיים בודדים בשלב הגסטרולה מבלי להקריב את בעל החיים, אשר מאפשר זיהוי של מוטציות נוקאאוט מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים להיות מוקרן, אבל זה מינימלית דורש 4-5 h.

Protocol

1. אינדוקציה של השאיפה, הפריה חוץ גופית , ו-דה-jellying

1. שמירה על שלפוחית הזרע בתוך מי ים עם מליחות של 12 חלקים לאלף (ppt) בחשיכה ב -16 ° c, האכלה artemia מדי יום.
2. ביום לפני הבהיית השראה, מניחים בעלי חיים בחממה בטמפרטורה ובשליטה קלה. לתכנת את החממה כך שבעלי החיים ייחשפו ל -8 מעלות של אור ב -25 ° c. אופציונלי: האכילו חתיכה קטנה (< 1 מ"מ³) של צדפה לבעלי חיים בודדים לפני הצבת אותם לתוך החממה כדי לשפר את ההשריץ.
3. השאירו את החיות בחממה במשך 1 h ב -16 ° c.
4. הסר את בעלי החיים מהאינקובטור והשאר אותם על שחקן ספסל עם אור בטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר השאיפה. ההשמה מתרחשת בדרך כלל בתוך 1.5-2 h הבאה.
5. אם הזכרים והנקבות מצויים במכולות שונות, מניחים חבילות ביצים מהמכולה הנשית לתוך מכולה גברית המכילה זרע באמצעות פיפטה העברה שקצהו נחתך כדי להגדיל את הפתח כך שהביצים לא ניזוקו על-ידי לחץ מכני במהלך עברת. לאפשר לביצים להיות מופרות על ידי השארת אותם במיכל זכר לפחות 15 דקות.
6. דה-ג'לי חבילות הביצית במי ים המכילים 3% ציסטאין (pH 7.4) על צלחת פטרי או בשפופרת של 15 מ ל. בעדינות מתפרעים על שייקר עבור 12 דקות.
7. השתמש בפיפטה פלסטי כדי לפרק את הגושים ולהמשיך להיות מתפרעים לעוד 2-3 דקות עד לחלוטין דה-ג'אליאד.
8. להסיר את ציסטאין על ידי החלפת המדיה עם מי ים טריים לפחות 5x.
9. שמרו את הביצים המוופרות על צלחת פטרי מזכוכית ב -16 ° c או RT.

2. הסרה כירורגית של רקמת הבורג מעובר הגסטרולה

1. להכין מאגר הפקת ה-DNA המורכב של 10 mM טריס-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.3% Tween20, 0.3% NP40, ו 1 מ"ג/mL פרוטטינואז K. שימוש 20 מ ל של מאגר החילוץ לכל העובר. מערבבים היטב על ידי vortexing ו סדרת מחלקים את המאגר לתוך צינורות PCR.
2. מתמוסס 1% התעורר במי ים ויוצקים אותו צלחת פטרי כדי לכסות את הקרקעית. מגניב על שחקן ספסל. להכין מיטת ג'ל יוצקים מי ים טריים כדי לכסות את מיטת ג'ל בצלחת פטרי.
3. העבר 24 h לאחר הפריה (hpf) עוברים (שלב מוקדם עד באמצע הבמה) לתוך צלחת פטרי המכילה מיטת ג'ל agarose.
4. הכנס מחט טונגסטן למחזיק מחט לחטא על ידי לטבול את קצה המחט באלכוהול (70% או יותר) והצבת אותו להבה כדי לשרוף את האלכוהול.
5. תחת מיקרוסקופ מבתר (ב 20x כדי 40x ההגדלה), להשתמש במחט טונגסטן כדי לעשות דיכאון על מיטה agarose על ידי הסרת פיסת משטח על גבי גודל של העובר כדי להיות מניפולציות, ומניחים את העובר על הדיכאון עם לרוחב שלה צד כלפי מטה כדי להגביל את תנועת העובר עבור ניתוח מיקרו.
6. השתמש במחט טונגסטן כדי בניתוח בוהן פיסת של רקמת הבורג הממוקם מול הפתיחה אוראלי בלייסטופה. בדרך כלל מספיקה הבורג השלישי לרבע של הרקמה העוברה לאורך ציר הפה-הבורג.
7. השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר את רקמת הבורג המבודד (ב< 2 מ ל) לצינור PCR המכיל 20 מ ל של מאגר חילוץ DNA.
8. להעביר את העובר אחרי הניתוח לתוך היטב המכיל לפחות 500 mL של מי ים טריים בצלחת 24 או 96-באר.
9. חזור על שלבים 2.4 – 2.8 עבור מספר העוברים לפי הצורך.
10. מניחים את הצלחת היטב המכילה העוברים לאחר הניתוח בחממה ב -16 ° צ' או RT עד השלמת הגנוהקלדה.

3. הוצאת דנ א גנומית ו-PCR הקלדה

1. בקצרה לסובב את צינורות ה-PCR המכיל את מאגר החילוץ DNA ורקמות עובריות מבודדים באמצעות מיני צנטריפוגה (למשל ב 2,680 x g עבור 10 s).
2. כדי לחלץ דנ א גנומית של עוברים בודדים, מודפת את צינורות ה-PCR ב 55 ° c עבור 3 h. מערבולת עבור 30 כל 30 דקות כדי להבטיח התמוטטות של גושי תאים ולשפר את הליזה תאים.
3. מודטה את צינורות ה-PCR ב 95 ° צ' עבור 5 דקות כדי להשבית את האבטחה K.
4. לשמור על תמציות gDNA ב 4 ° צ' או על קרח, ומיד להמשיך ל-PCR.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי הצבת תמציות gDNA במקפיא של 20 ° c.
5. הגדר תגובת PCR באמצעות gDNA חילוץ כתבנית כדי להגביר את מקור גנומית של עניין.
   1. אם האללים שונים במיקום הריבית שונים בגודלם, כך שהפרש הגודל ניתן לזיהוי על ידי האלקטרופורזה בג ג'ל, עיצוב קבוצה אחת של התחל כדי להגביר את היקום כולו.
   2. לחילופין, השתמש בצבעי היסוד של allele היוצרים מוצרים PCR רק בנוכחות האלל המסוים; למשל, על ידי עיצוב פריימר הנקשר לאזור המכיל מוטציות הכניסה/מחיקה.
   3. השתמש ב-20 מ ל התגובה האופיינית ל-PCR כדלקמן: 5 מ ל של תמציות gDNA, 8 מ ל של nuclease-מים ללא תשלום, 4 מ ל של מאגר PCR, 0.2 מ ל של 10mM dNTPs, 0.6 מ ל של DMSO, 1 מ מ של 10 מ"מ בהילוך קדמי, 1 מ ל של 10 מ"מ תחל , ו 0.2 מ ל של דנ א פולימראז (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ניתן להשתמש בצבעי יסוד מרובים בתגובת PCR. למשל, אחד לשלב הקדמי האוניברסלי ושני התחל הפוך הספציפי האחרון ניתן לשלב, כל עוד שני התחל לאחור נועדו לייצר מוצרים PCR בגדלים שונים, כך הנוכחות/העדר של שני האללים יכול להיות חד משמעית שנקבע על ידי ג'ל אלקטרופורזה (ראה סעיף תוצאות מייצג).
6. הפעל אלקטרופורזה בג ג'ל כדי לקבוע את הגודל והנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR. כוונן את מצבם של האלקטרופורזה בג ג'ל (למשל, אחוז ג'ל מעלה, V/cm ומשך) בהתאם לגודל הצפוי של מוצרי ה-PCR.
7. השתמש בתוצאות מ-PCR לגבי הגודל והנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר שלאחר ניתוח. לדוגמה, אם האללים שונים צפויים ליצור מוצרי PCR בגדלים שונים, השתמש בנתוני הגודל כדי להקצות את ה-גנוטיפ עבור כל עובר. אם נעשה שימוש בצבעי היסוד הספציפיים של allele, יש להשתמש בנתונים בנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר.
8. מיון עוברים לפי גנוטיפ.

תוצאות

הגנום Ne, סטלה יש לוקוס יחיד המקודד חלבון מקודמן עבור GLWamide נוירופפטיד. שלוש הנוקאאוט של המוטציות בלוקוס זה (glw^-a, glw^-b, ו -glw-^c) דווחו בעבר⁵. ארבעה זכרים heterozygous נושאת אלל פראי (+) ו הנוקאאוט אלל glw^-cב glwamide לוקוס (גנוטיפ: +/glw

Discussion

המתואר כאן פרוטוקול PCR על מנת גנוטיפ בודד העובר כלנית ים מבלי להקריב את החיה. הביצים המוופרות מורשות להתפתח בעקבות ההשאיפה והדה-מיולים. האזור הבורג של העובר כל גאורולה הוא הוסר בניתוח, ואת רקמת הבורג המבודד משמש להפקת DNA הבאים גנומית, בעוד העוברים שלאחר ניתוח שנותרו לרפא ולהמשיך בפיתוח. תמצ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’