תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

Summary

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

Abstract

פיתחנו שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק (GVs). התרבות התא חיידקי חשוב להבנת הפונקציה של תאים חיידקיים בסביבה הטבעית. בגלל ההתקדמות הטכנולוגית, ניתן לגלות פונקציות שונות של תאים חיידקיים במפלס התא היחיד בתוך מרחב סגור. GVs הם תאים מיקרו בגודל כדורי מורכב מולקולות השומנים האמפיפילי והוא יכול להכיל חומרים שונים, כולל תאים. במחקר זה, תא חיידקי בודד הועבר 10 – 30 יקרומטר gvs על ידי שיטת העברת droplet ו-gvs המכיל תאים חיידקיים היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע הזכוכית. השיטה שלנו היא שימושית להתבוננות בצמיחה בזמן אמת של חיידקים בודדים בתוך GVs. אנו מתורבתים Es, האנתכיה קולי (E. coli) תאים כמודל בתוך gvs, אבל שיטה זו ניתן להתאים לסוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש בשיטה שלנו בתחומי המדע והתעשייה של מיקרוביולוגיה, ביולוגיה, ביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

Introduction

התרבות של תאים חיידקיים ברמה תא אחד קיבל את תשומת הלב הגוברת. התאים חיידקי בקטריאלי ברמת תא בודד בתוך שטח מוגבל יכול להבהיר פונקציות חיידקיים כגון השונות פנוטימית^1,2,3,4, התנהגות התא^5, מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן ,} בן שמונה ^{, 9}, ו עמידות לאנטיביוטיקה^10,11. בגלל ההתקדמות האחרונה בטכניקות התרבות, ניתן להשיג את התרבות של חיידקים בודדים בתוך מקום מוגבל, כגון שבב היטב^4,7,8, ג'ל droplet^12,13 , והמים בשמן (W/O) droplet^5,11. כדי לקדם הבנה או ניצול של תאים חיידקיים בודדים, יש צורך בהתפתחויות טכניות נוספות של טכניקות טיפוח.

שלפוחיות המחקים את קרום התא הביולוגי הן תאים כדוריים המורכב ממולקולות אמפיפיליות ויכולות להכיל חומרים שונים. שלפוחיות מסווגים לפי גודל וכוללות שלפוחיות קטנות (SVs, קוטר < 100 ננומטר), שלפוחיות גדולות (LVs, < 1 μm), ושלפוחיות ענק (GVs, > 1 μm). SVs או LVs משמשים בדרך כלל כנשאים לתרופות בשל הזיקה לקרום התא הביולוגי¹⁴. GVs יש גם שימש כמערכת הכור עבור הבנייה של פרוטותאים¹⁵ או מלאכותי תאים¹⁶. כימוס של תאים ביולוגיים לתוך gvs דווח^17,18, ולכן gvs להראות פוטנציאל כמערכת תרבות התא כאשר בשילוב עם מערכת הכור.

כאן, יחד עם וידאו של הליכים ניסיוניים, אנו מתארים כיצד GVs יכול לשמש ככלי תרבות התא הרומן¹⁹. GVs המכילים חיידקים נעשו על ידי שיטת ה-droplet העברת²⁰ והיו מקיבוע על קרום נתמך על זכוכית כיסוי. השתמשנו במערכת זו כדי להתבונן בגידול חיידקי ברמה של תא בודד בתוך GVs בזמן אמת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת GVs המכיל תאים חיידקיים על ידי שיטת העברת Droplet

1. הכנת פתרונות מניות ליפיד של 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC, 10 מ"מ, 1 מ ל) ו-1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספולאטאנאמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן)-2000] (biotin-יתד-DSPE, 0.1 מ"מ, 1 מ ל) בכלורופורם/ מתנול פתרון (2/1, v/v) ולאחסן את המניה ב-20 ° c.
2. הכנת תמיסת שמן המכילה שומנים בדם
   1. יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (איור 1b (i)).
   2. להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את הסרט desiccator עבור 1 h כדי לאדות לחלוטין את הממס אורגני (איור 1b (ii)).
      הערה: יש צורך לאדות את הממס האורגני בתוך מכסה המנוע.
   3. הוסף 200 μL של שמן מינרלי (0.84 g/mL, טבלת חומרים) לבקבוקון זכוכית (איור 1b (iii)).
   4. עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטרה סאונד (120 W) עבור לפחות 1 h (איור 1b (iii)). הריכוזים הסופיים של POPC ו biotin-יתד-DSPE הם 1 מ"מ ו 0.002 מ"מ, בהתאמה.
3. טרום תרבות של תאים חיידקיים
   1. החיידק הקולי לתוך מדיום 1x ליברות (1 גרם שמרים לחלץ, 2 g bacto טריטונים, ו 2 גרם נתרן כלוריד ב 200 mL של מים מיוהים) מ לוחית LB ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 12 – 14 h (לילה).
   2. לאחר הדגירה, לאסוף 20 μL של פתרון התרבות ולהעביר ל 1.98 mL של טריים 1x בינוני LB, ותרבות התאים שוב עבור 2 h.
   3. בדוק את הדחיסות האופטית ב600 nm (OD₆₀₀) ערך של פתרון טרום תרבות (מוכן בשלב 1.3.2). יש להשתמש בפתרון טרום תרבות של OD₆₀₀ = 1.0 – 1.5.
4. הכנת פתרונות המים החיצוניים והפנימיים של GVs
   1. התמוססות גלוקוז ב-1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית החיצוני של GVs. הכן 20 מ ל של פתרון גלוקוז מניות (500 mM).
   2. לדלל את התמיסה הגלוקוז במניה עם מדיום 1x ליברות 200 מ"מ (שולחן 1).
   3. מתמוסס התמוססות ב 1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית פנימי של GVs. הכינו 20 מ ל של מניות הפתרון של סוכרוז (500 מ"מ).
   4. לערבב את הפתרון טרום תרבות (OD₆₀₀ = 1.0 – 1.5), סוכרוז פתרון (500 mM), ו 1X LB בינונית (טבלה 1). ה-OD הסופי₆₀₀ ערך של הפתרון התרבותי צריך להיות 0.01 – 0.015 והריכוז האחרון של סוכות צריך להיות 200 מ"מ.
      הערה: . תדאג להימנע מלחץ אוסמוטי יש צורך לאזן את הריכוז בין הפתרון הפנימי והחיצוני.
5. הכנת המים בשמן (W/O) טיפות המכילות תאים חיידקיים
   1. הוסף 2 μL של הפתרון הפנימי מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.4) כדי 50 μL של פתרון שמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם POPC ו biotin-יתד-DSPE) בצינור פלסטיק 0.6 mL (איור 1b (iv)).
   2. אמולסיה של שני הרכיבים בצינור הפלסטיק על-ידי הקשה על הצינור באמצעות יד (איור 1b (v)).
6. היווצרות של GVs המכיל תאים חיידקיים
   1. הוסף 50 μL של הפתרון החיצוני מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.2) בצינור פלסטיק של 1.5 mL (איור 1b (vi)) ושכבה בעדינות 150 μl של פתרון השמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם popc ו BIOTIN-יתד-dspe) על המשטח של מימית החיצונית (איור 1b (vii)). מיכל הדגימה בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° c) במשך 10 – 15 דקות בדוק כדי לוודא כי הממשק של השמן ופתרונות מימית הוא שטוח.
   2. הוסף 50 μL של הפתרון של W/O droplet (מוכן בשלב 1.5.2) על הממשק של השמן ואת התמיסה מימית באמצעות פיפטה (איור 1b (viii)).
   3. צנטריפוגה את שפופרת הפלסטיק 1.5 mL (משלב 1.6.2) עבור 10 דקות ב 1,600 x g ב RT ב צנטריפוגה שולחן עבודה (איור 1b (ix)). לאחר צנטריפוגה, לאכול את השמן (השכבה העליונה) מצינור פלסטיק 1.5-mL בעקבות הצינורות, ולאסוף את GVs המכיל תאים חיידקיים (איור 1b (x)).

2. הכנת מערכת תצפית GV (מערכת תרבות התא חיידקי)

1. הכנת שלפוחיות קטנות (SVs) לקונסטרוקטי ng ממברנה בילייר נתמכת
   1. יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (באמצעות הרכב השומנים זהה משמש הכנה GV בשלב 1.1).
   2. להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את המדגם הזה desiccator עבור 1 h כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.
   3. הוסף 200 μL של הגלוקוז 200 mM ב 1x בינונית LB (הפתרון החיצוני מימית של GVs) לבקבוקון זכוכית.
   4. עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטראסוניות (120 W) עבור לפחות 1 h.
   5. הכינו SVs על ידי שיטת ההבלטה²¹ באמצעות הבלטת ממד מיני קרום פוליקרבונט עם 100 בגודל נקבובית ננומטר.
2. הכנת תא בעבודת יד
   1. מקדחה חור 7 מ"מ עם אגרוף חלול על אטם כפול פנים (10 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ).
   2. הדבק את החותם כפול פנים עם החור על זכוכית כיסוי (30 מ"מ x 40 מ"מ, עובי 0.25 – 0.35 mm).
3. הכנת קרום bilayer נתמך על הזכוכית המכסה בחור של התא
   1. הוסף 30 μL של פתרון SV לחור של התא (מוכן בסעיף 2.2) ו דגירה ב RT עבור 30 דקות.
   2. בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.
4. השתק של GVs על ה הממברנה הנתמכת על הזכוכית המכסה בחור החדר
   1. הצג 10 μL של neutravidin עם הפתרון החיצוני מימית של GVs (1 מ"ג/mL) לתוך החור ו-דגירה ב RT עבור 15 דקות.
   2. בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.
   3. הוסף את כל הפתרון המכיל GVs (מוכן בשלב 1.6.3) לתוך החור של התא וחותם עם זכוכית כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ, עובי 0.13 – 0.17 מ"מ) (איור 2b).
5. התבוננות מיקרוסקופית של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs
   1. הגדר מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים עם מיקרוסקופ הפוך מצויד בצמצם 40x/0.6 מספרית (NA) העדשה האובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך (איור 2b).
   2. מניחים את התא על מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים (איור 2b). דגירה של GVs המכיל תאים חיידקיים בחדר במצב סטטי עבור 6 h ב 37 ° c.
   3. ללכוד ולהקליט תמונות מיקרוסקופ של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs כל 30 דקות באמצעות מדעית מתכת משלימה תחמוצת מוליכים למחצה (sCMOS) מצלמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת GVs המכיל תאים חיידקיים בודדים באמצעות שיטת ה-droplet העברה (איור 1). איור 1a מראה תמונה סכמטית של המשקעים של gvs המכילים חיידקים. W/O טיפות המכילים חיידקים מועברים על פני מי השמן (מונאולד מונואולייר) ממשק ידי צנטריפוגה כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא אחד בתוך GVs. שיטה פשוטה זו כרוכה ביצירת GVs המכיל תאים חיידקיים ברמה תא יחיד באמצעות שיטת ה-droplet העברה. לעומת גישות אחרות להשגת GVs המכיל תאים חיידקיים, שיטה זו יש שני יתרונות: (אני) זה קל לפתח, ו (ii) נפח קטן (2 μL) של פתרון לדוגמה נדרש כדי להכין את G...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bactotryptone	BD Biosciences	211705
Chloroform	Wako Pure Chemicals	032-21921
Cover glass (18 × 18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	custom-order	thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge	Hi-Tech Co.	ATT101	swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm)	Nitoms	T4613
Glass vial	AS ONE	6-306-01	Durham fermentation tube
Glucose	Wako Pure Chemicals	049-31165
Inverted microscope	Olympus	IX-73
Methanol	Wako Pure Chemicals	133-16771
Microscopic heating stage system	TOKAI HIT	TP-110R-100
Mineral oil	Nacalai Tesque	23334-85
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Objective lens	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes	Avanti Polar Lipids	610005	pore size 100 nm
sCMOS camera	Andor	Zyla 4.2 plus
Sodium chloride	Wako Pure Chemicals	191-01665
Sucrose	Wako Pure Chemicals	196-00015
Ultrasonic bath	AS ONE	ASU-3D
Yeast extract	BD Biosciences	212750
0.6 mL lidded plastic tube	Watson	130-806C
1.5 mL lidded plastic tube	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline	Avanti Polar Lipids	850457P	POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	Biotin-PEG-DSPE