החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

Abstract

גרעין הג הצדדי הוא תחנת הממסר הראשונה למידע החזותי. ממסר נוירונים של הגרעין התלמי הזה לשלב קלט מתאי גנגליון רשתית ולהקרין אותו קליפת הראייה. בנוסף, ממסר הנוירונים לקבל עירור מלמעלה למטה מן הקליפה. שני תשומות ההתרגשות העיקריים לנוירונים בממסר שונים במספר היבטים. כל תא עצב ממסר מקבל קלט מתוך מספר סינפסות retinogeniculate בלבד, שהם מסופים גדולים עם אתרי שחרור רבים. זה משתקף על ידי עירור חזק זהובה, הנוירונים ממסר לקבל, מתאי גנגליון הרשתית. הסינפסות Corticogeniculate, לעומת זאת, הן פשוטות יותר עם כמה אתרי שחרור וחוזק סינפטית חלש יותר. שתי הסינפסות שונות גם בפלסטיות הסינפטית לטווח קצר. לסינפסות retinogeniculate יש הסתברות גבוהה לשחרר וכתוצאה מכך להציג דיכאון לטווח קצר. לעומת זאת, corticogeniculate הסינפסות יש הסתברות שחרור נמוך. סיבים Corticogeniculate לחצות את גרעיני התלתלמי לפני הכניסה לגרעין הגנוקה לרוחב. המיקומים השונים של הגרעין הטרתלמי הציקולאני (הרוסטרולי מתוך גרעין הג הצדדי) ומערכת האופטית (ונקטרו-מהצד מגרעין הג הצדדי) מאפשרים מגרה corticogeniculate או retinogeniculate בנפרד עם אלקטרודות של גירוי מסחטות. זה הופך את הגרעין לרוחב מצוי באזור המוח האידיאלי שבו שני סינפסות מרגש עם תכונות שונות מאוד גישו על אותו סוג תא, ניתן ללמוד בו זמנית. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את ההקלטה מהעברת נוירונים ולבצע ניתוח מפורט של הפונקציה retinogeniculate ואת corticogeniculate סינפציה בפרוסות מוח חריפה. המאמר מכיל פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הדור של פרוסות מוח חריפה של הגרעין הגניקה לרוחב ושלבים עבור ההקלטה פעילות מהעברת הנוירונים על ידי גירוי מערכת האופטית וסיבים corticogeniculate בנפרד.

Introduction

ממסר נוירונים של גרעין הג לרוחב לשלב ולהעביר מידע חזותי לקליפת הראייה. נוירונים אלה מקבלים קלט מרגש של התאים גנגליון באמצעות הסינפסות retinogeniculate, אשר מספקים את הכונן העיקרי ה, הכולל את הדחף המרכזי לנוירונים. בנוסף, ממסר הנוירונים מקבלים כניסות מהנוירוטית מנוירונים באמצעות corticogeniculate הסינפסות. יתר על כן, ממסר הנוירונים לקבל תשומות מעכבות של האינטרנוירונים מקומיים ו GABAergic נוירונים של הגרעין של רטיקולאריס thalami¹. הגרעין ברטיקולריס thalami נמצא כמו מגן בין תלמוס לקליפת המוח, כך שסיבים מקרינים מקליפת התלמוס ובכיוון ההפוך, חייבים לעבור דרך הגרעין רטיקולאריס thalami².

כניסות retinogeniculate ו corticogeniculate תשומות להציג תכונות סינפטית נפרדות^3,4,5,6,7,8. כניסות retinogeniculate טופס מסופים גדולים עם מספר אתרי שחרור^9,10. לעומת זאת, כניסות corticogeniculate מציגות מסופים קטנים עם אתרי שחרור בודדים⁷. בנוסף, הסינפסות retinogeniculate ביעילות כונן פוטנציאל הפעולה של הנוירונים ממסר למרות מהווה רק 5-10% של כל הסינפסות על ממסר נוירונים^3,8,11. Corticogeniculate הסינפסות, לעומת זאת, משמש מאפטור של שידורי retinogeniculate על ידי שליטה על פוטנציאל הממברנה של ממסר נוירונים^12,13.

אלה שני תשומות ההתרגשות העיקריים להעברת הנוירונים הם גם שונה מבחינה פונקציונלית. אחד ההבדל הבולט הוא דיכאון לטווח קצר של הסינפסות retinogeniculate ואת ההנחיה לטווח קצר של הסינפסות corticogeniculate^3,5,8. הפלסטיות הקצרת-טווח מתייחס לתופעה שבה משתנה חוזק הסינפטית כאשר הסינפסה פעילה שוב ושוב תוך פרק זמן של מספר אלפיות-שניה ועד מספר שניות. ההסתברות לשחרור סינפטית היא גורם חשוב המשמש לפלסטיות לטווח קצר. סינפסות, עם הסתברות שחרור נמוך הראשונית, להציג הקלה לטווח קצר עקב הצטברות של Ca^{2 +} ב preסינפסה ולכן עלייה בהסתברות השחרור נצפתה על פעילות חוזרת. לעומת זאת, הסינפסות עם הסתברות שחרור גבוה להציג בדרך כלל דיכאון לטווח קצר עקב דלדול של שלפוחיות מוכנות ושלפוחית¹⁴. בנוסף, הפחתת רגישות של קולטנים פוסט-סינפטית תורמת הפלסטיות לטווח הקצר בכמה סינפסות הסתברות גבוהה מהדורה^8,15. הסתברות גבוהה לשחרור והפחתת הרגישות של α-אמינו-3-הידרוxy-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (אמפא) קולטנים תורמים לדיכאון הבולט לטווח קצר של הסינפסות retinogeniculate. לעומת זאת, ההסתברות לשחרור נמוך מהווה את ההנחיה לטווח הקצר של הסינפסות הcorticogeniculate.

בעכברים, המערכת האופטית נכנסת לגרעין של הג הצדדי (dLGN) מהאתר של קודולצלעות, בעוד שסיבים corticogeniculate נכנסים לתוך ה-dLGN rostroventrally. המרחק בין שני הקלטים מאפשר לחקור את המאפיינים הפרטניים של שני כניסות מרגש שונות מאוד אל אותו תא. כאן, אנו בונים על ולשפר את שיטת הניתוח שתוארה בעבר, שבו סיבים retinogeniculate והוא נשמר בפרוסות מוח חריפה³. אנו, לאחר מכן, לתאר את החקירה אלקטרופיסיולוגית של העברת נוירונים וגירוי של retinogeniculate וסיבים corticogeniculate עם אלקטרודות לתוך הגירוי. לבסוף, אנו מספקים פרוטוקול למילוי של נוירונים ממסר עם ביוציטוטין וניתוח אנטומי הבאים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי פאנל הפיקוח הממשלי על ניסויים בבעלי חיים של ריינלנד-פפאלץ.

1. פתרונות

1. תמיסת חיתוך
   1. כדי להפחית את ההתרגשות, הכינו פתרון מבוסס כולין לשימוש במהלך הניתוח כפי שהוצג כאן (ב-mM): 87 נארל, 2.5 KCl, 37.5 כולין כלוריד, 25 נחקו₃, 1.25 נה₂פו₄, 0.5 Cacl₂, 7 mgcl_2, ו ₂₅ גלוקוז. הכינו את פתרון הניתוח פחות משבוע לפני הניסוי.
2. פתרון הקלטה
   1. הכנת נוזל מלאכותי מוחין השדרה (ACSF) פתרון המכיל (ב mM): 125 הנאקל, 25 נחקו₃, 1.25 נה₂PO4, 2.5 Kcl, 2 קא2, 1 mgcl₂, ו 25 גלוקוז. להוסיף 50 μM D-APV ו-10 μM SR 95531 הידרוברומיד כדי לחסום N-מתיל-D-aspartate (NMDA) ובהתאם לקולטנים,_בהתאמה .
3. פתרון תאיים
   1. להכין פתרון תאיים המכיל (ב מ): 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, ו 0.1 D-600 (מתיונין הידרוכלוריד). להתאים את ה-pH ל 7.3 עם CsOH. סנן, משתמש ואחסן את פתרון המניה ב-20 ° c עד השימוש.

2. חיתוך והרכבה

1. הכינו שני תאי פרוסה, שמהם הוא מלא 100 mL של פתרון החיתוך והשני עם 100 mL של פתרון ההקלטה. מניחים את שני הספלים לתוך אמבט מים (37 ° c) ובועה את הפתרונות עם קרבוסג'ן לפחות 15 דקות לפני הקרע.
2. למלא גביע פלסטיק עם 250 mL של כמעט קרח קר (אך לא קפוא) פתרון חיתוך. בועה עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני השימוש.
3. ממלאים צלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ x 20 מ"מ), שבה יבוצע ניתוח המוח, עם פתרון החיתוך הקר. מניחים פיסת נייר סינון לתוך המכסה של צלחת פטרי.
4. . תירגע בחדר הניתוח של הרטט
5. הכשלי עכבר עם 2.5% isofלבנה, למשל, בכלוב העכבר. ברגע העכבר אינו מגיב צביטה זנב, לערוף את העכבר ליד לשד צוואר הרחם ולטבול את הראש לתוך הפתרון לקרע קר קרח בבסיס של צלחת פטרי.
6. חותכים את העור של הראש מקאואל אפי ולשמור אותו לצד האצבעות כדי לחשוף את הגולגולת. כדי להוציא את המוח הקדמי, לחתוך תחילה את הגולגולת יחד עם האמצע האחורי הקדמי, ולאחר מכן לחתוך שתי פעמים יותר דרך תפר המונונאליות ואת התפר כבשה (איור 1A).
7. הסירו את הגולגולת בין תפר העור ותפר העור כגון המוח נחשף. חותכים את נורת הריח ומפרידים את המוח הקדמי מהמוח עם להב דק (איור 1B). מסירים את המוח מהגולגולת עם מרית דקה ומניחים אותו על נייר הסינון במכסה של צלחת פטרי.
   הערה: שלבים 2.6 ו 2.7 יש לבצע מהר ככל האפשר כדי להפחית את מוות התאים.
8. כדי לשמור על שלמות החושים הסנסוריים והחושיים לרכיב ה-dLGN בפרוסת המוח, הפרידו בין שתי האונות בעזרת זווית של 3/5 ° (איור 1C,D). מייבשים את המישורים המנייביים של שתי ההמיספרות על ידי הצבת אותם על נייר הסינון ולאחר מכן הדבק אותם אל השלב החותך בזווית של 10-25 ° מהמטוס האופקי (איור 1E).
9. הניחו את הבמה במרכז מגש המתכת, ושופכים בעדינות את שאר הפתרון לחיתוך קר הקרח לתוך מגש המאגר. בצע צעד זה בזהירות מכיוון שזרימה חזקה עשויה להסיר את המוח המודבק (איור 1F).
10. מניחים את מגש המאגר לתוך מגש מלא קרח, אשר מסייע לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך הניתוח. גזור 250 יקרומטר פרוסות עם להב תער במהירות של 0.1 מ"מ/s ומשרעת של 1 מ"מ.
11. שמרו פרוסות בתא המעצר מלאות בתמיסה לחיתוך חמצן ב-34 ° c לערך 30 דקות ולאחר מכן הניחו לפרוסות להתאושש בפתרון ההקלטה ב-34 ° c לעוד 30 דקות.
12. לאחר ההחלמה, להסיר את התא המחזיק את הפרוסה מאמבט מים ולשמור פרוסות בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש בניסויים.

3. אלקטרופיזיולוגיה

1. משוך את הפיפטות באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט ולאחר מכן לפולר. שמרו על עמידות ההקלטה ב-3-4 MΩ. משוך את הפיפטות הגירוי באותו פרוטוקול, אך שבור מעט את הקצה לאחר שהוא מושך להגדיל את הקוטר. ממלאים את ההקלטה בעזרת התמיסה התאיים והביולוציטין, תוך כדי מילוי הרטט עם פתרון ההקלטה.
2. מניחים את הפרוסות בתוך חדר ההקלטה ומאפשרות באופן רציף את הפרוסות בעזרת פתרון הקלטה מחמצן ב-RT. בדוק את כל הפרוסות ובחר את אלה שמציגים מערכת אופטית ללא שינוי.
3. המחש את הפרוסה והתאים במיקרוסקופ זקוף המצויד בניגוד הפרעות אינפרא-אדום (IR-DIC) וידאו מיקרוסקופ.
   הערה: ממסר הנוירונים הם הבדיל בין interneurons על ידי גודל הסומה הגדול שלהם יותר הדנדריטים העיקרי (סניפים המתעוררים מן הסומה). אינטרנוירונים להציג מורפולוגיה דו-קוטבית עם הסומה קטן.
4. הניחו את הפיפטה הגירוי על הפרוסה לפני שאתם מקליטים את התא עם הפיפטה המוקלט. כדי לחקור את הסינפסות retinogeniculate למקם את הצינורות הגירוי ישירות על מערכת האופטית, שם סיבי אקסון מתאים גנגליון הרשתית הם ארוזות (איור 2a). כדי לנתח את הסינפסות corticogeniculate, הציבו את האלקטרודה המעוררת על הגרעין של ראקולאריס thalami, שהוא בצמוד ל-dLGN (איור 2B).
5. לאחר שפיפטה ההקלטה שקוע לתוך פתרון ההקלטה, להחיל 5 וולט הצעד מתח כדי לפקח על ההתנגדות הפיפטה. הגדר את הפוטנציאל המחזיק ב-0 mV ובטל את הפוטנציאל הנגדי כך שהזרם המחזיק הוא 0 pA.
6. גש לתא עם הפיפטה המוקלט. בזמן הפעלת לחץ חיובי כאשר הפיפטה נמצא במגע ישיר עם קרום התא, לשחרר את הלחץ החיובי, ולהגדיר את הפוטנציאל המחזיק-70 mV. החלת לחץ שלילי קל כדי לאפשר את קרום התא להצמיד את הזכוכית לצינורות כגון החותמות של ג'יגה אוהם (עמידות > 1 GΩ). לפצות את הקיבולת של הצנרת ולפתוח את התא על ידי יישום של פולסים בלחץ שלילי.
7. כדי לחקור את הפונקציה סינפטית, להחיל 0.1 ms הפולסים הנוכחיים (ca. 30 μA) דרך הפיפטה גירוי. אם לא נצפו תגובות סינפטית, ייתכן שיהיה צריך להחליף את הפיפטות הגירוי. היזהרו בזמן הצבת הפיפטות הגירוי לתנוחה אחרת, כך שהתא המוקלט לא יאבד.
   הערה: בהקלטות לדוגמה המוצגות באיור 2, הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר, נחקר על-ידי עירור הסיבים האופטיים או סיבי הcorticogeniculate פעמיים עם 30 אלפיות השנייה של מרווחי הגירוי. היחס מזווג הדופק (PPR) חישב על ידי חלוקת משרעת של הזרם השני מרגש פוסט-סינפטית (EPSC) על ידי זה של EPSC הראשון (EPSC₂/epsc₁). כל פרוטוקול גירוי חזר 20 פעמים. משרעת EPSC נמדדו מתוך הזרמים הממוצעים של 20 מטאטא. מרווח הזמן בין כל חזרה היה לפחות 5 s כדי למנוע הפלסטיות לטווח קצר הנגרמת על ידי חזרות.
8. עקוב אחר התנגדות הסדרה ברציפות על-ידי החלת צעד מתח 5-mV. רק להשתמש בתאים עם התנגדות הסדרה קטן יותר 20 MΩ לניתוח.

4. תיוג ביולוציטין

1. שמור על תצורת התאים השלמה לפחות 5 דקות כדי לאפשר דיפוזיה של ביוציטוטין לתוך הדנדריטים הדידיטים.
2. לאחר ההקלטה, להסיר בעדינות את הפיפטה מתא כך הסומה לא נהרס.
   הערה: אם יותר מתא אחד נרשם בפרוסה אחת, יש להתרחק ממנו בצורה מספקת מהתאים השכנים שלהם. ודא שהדנדריטים מתאים שונים אינם מפריעים זה לזה במהלך ההדמיה.
3. הכינו לוחית של תרבית תאים באורך 24 שעות. ממלאים כל טוב עם 300 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית). הקפד לא לזהם שום דבר עם הב, כי יהיה במגע עם הפרוסות להיות מוקלט.
4. העבירו את הפרוסות מתא ההקלטה ללוח הכולל את המשטח עם פיפטה גומי ותקנו את הפרוסות בלילה. ודא שהפיפטה תמיד מנועה מהזיהום בה,
   התראה: תמיד לבש כפפות והשתמש במכסה כימי כשאתה מתמרן את השימוש בלגון.
5. לאחר שהוא מתקן פרוסות לילה בתוך המטה, החליפו את הכדורגלן עם תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS). אחסן את הפרוסות ב-PBS ב-4 ° צ' לעיבוד עתידי (פחות מ 2 שבועות).
6. שטוף את הפרוסות באמצעות הערוץ החדש 3 פעמים (10 דקות כל כביסה).
7. חסימת אתרי קשירה לא ספציפיים על-ידי הדיסת הפרוסות בפתרון החסימה (0.2% שאינו מוגדר על-ידי החלפת שקעים ו-5% סרום בקר בערוץ PBS) עבור 2 h ב-RT על שייקר מסלולית.
8. מחק את פתרון החסימה. מודלת את הפרוסות עם streptavidin-אלקסה 568 מדולל לתוך פתרון חסימת (1:1000) ב 4 ° c לילה על שייקר מסלולית.
9. להיפטר פתרון נוגדן ולשטוף פרוסות 3 פעמים עם PBS עבור 10 דקות ב RT על שייקר מסלולית. שטוף את הפרוסות בעזרת מי ברז לפני ההרכבה.
10. שימו את הפרוסות מעכבר אחד על מגלשת זכוכית אחת. ודא שהתאים המוכתמים נמצאים על המשטח העליון של הפרוסות. לספוג את המים סביב פרוסות עם רקמות ולאחר מכן להשאיר את הפרוסות להתייבש במשך כ 15 דקות.
11. החל שתי טיפות של מדיום הרכבה בכל פרוסה. הר שמיכות בשקופית מבלי לייצר בועות אוויר.
12. אחסנו את הפרוסות המסומנות ב-4 ° c לאחר הדמיה בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד.

5. הדמיה סלולרית ושיחזור

1. סרוק פרוסות בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד והשתמש בתוכנה המשויכת לניתוח.
2. להלהיב את הזריחה ב 561 ננומטר.
3. תמונה הפרוסות עם 0.7 מפתח נומרי (NA), המטרה טבילה בשמן.
4. התאימו את התא המיועד באמצע התצוגה והחילו הגדלה של 2.5 פעמים.
5. רינדור הנתונים של מחסנית Z כדי לסרוק את תא העצב כולו עם הפרמטרים הבאים: פורמט = 2,550 x 2,550 פיקסלים, תדר סריקה = 400 Hz, Z מספר = 40. Voxel גודל היה סביב 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 μm3.
6. Semi-באופן אוטומטי לעקוב אחר הנוירונים באמצעות תוכנת שחזור עצבי (למשל, NeuronStudio). דוגמה לעצב-על של ממסר מעקב תלת-ממדי מוצג באיור 3D.

תוצאות

הכנת הפרוסה של dLGN המכיל את המסלולים retinogeniculate מוצג תחת מטרה 4x (איור 2). Axons של תאים גנגליון ברשתית צרור יחד במערכת האופטית (איור 2). הפיפטה המעוררת הונחה על מערכת האופטית כדי לגרום retinogeniculate סינפקה-תיווך הנוכחי (איור 2A) ועל הגרעי...

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול משופר המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר³, אשר מאפשר את החקירה של ההסתברות הגבוהה של הסינפסות retinogeniculate הסתברות נמוכה של שחרור corticogeniculate הסינפסות מאותה פרוסה. זה חשוב מאוד מאז שני כניסות אלה אינטראקציה אחד עם השני כדי לווסת את שידור האות החזותי: כניסות retinogeniculate הם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist