JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר את השימוש במיגרפיה תיל כדי להעריך את המתח האיזוגרפי של העורקים המסריים מבודדים מעכברים, עם שיקול מיוחד של האפנון על ידי גורמים שפורסמו מתאי האנדותל ורקמות השומן הפריסקולרית.

Abstract

היענות משתנה של כלי הדם לגירויים פתופסלוגיים תורמת לפיתוח מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם ומטבולית. התפקוד הטיפולי של האנדותל מייצג את האשם הגדול ביותר של העורקים המוגברת והצמצם המשופר של העורק. רקמת אדיפוז (שומן) המקיפים את העורקים ממלאים תפקידים חשובים בוויסות הרפיה התלויה באנדותל ו/או התכווצות של תאי השריר החלקים והחלק של כלי הדם. ניתן להעריך את הקשר בין האנדותל לבין רקמות השומן הפריסקולרית, הvivo לשעבר באמצעות כלי דם נטענים על-ידי מערכת תיל מיאלואידית. עם זאת, יש להקים הגדרות אופטימליות עבור עורקים הנגזרים מבעלי חיים ממינים שונים, גילאים, רקעים גנטיים ו/או מצבים פתופסלוגיים.

Introduction

הפסקות והתכווצות של עורקים מושגת על ידי מרפה והתכווצויות, בהתאמה, של תאי שריר החלק שלהם כלי דם. שינויים בתגובתיות כלי דם של עורקים קטנים תורמים לרגולציה הומאטית של לחץ דם עורקי על ידי עצבים אוטונומית והורמונים המצויים בדם (למשל, catecholamines, אנגיוטנסין II, סרוטונין, ואסיסין). ברמה המקומית, התגובות כלי הדם של תאים שרירים חלקה מאופנן על ידי אותות מתאי האנדותל של האינטימה ואת רקמת השומן סביב העורקים (איור 1).

האנדותל הוא לא רק מכשול פסיבי, אלא גם משמש כמשטח להחלפת אותות בין הדם לבין תאי השריר החלקים הבסיסיים של כלי הדם. על ידי שחרור חומרים vasoactive שונים, האנדותל ממלא תפקיד קריטי בשליטה המקומית של התגובות בצליל כלי הדם1. לדוגמה, בתגובה לאצטילכולין, אנדותל תחמוצת החנקן סטנדרטים (אנוש) מופעל באנדותל כדי לייצר תחמוצת החנקן (NO), אשר משרה הרפיה של שריר החלק הבסיסי של כלי הדם על ידי הפעלת guanylyl cyclase מסיסים (ממפקדת הסטארגייט) 2. חומרים אחרים של ה-vasoactive כוללים את המוצרים של הציקלוחמצן (לדוגמה, פרוסטוליב ותרובוק2), ליפוקסיז'אז (למשל, 12-הידרויואיאוטיות חומצות, 12-HETE), ו ציטוכרום P450 מונקסיג'סים (Hete ו חומצות שורש החומצה, EETs), מינים החמצן תגובתי (ROS), ו פפטידים vasoactive (למשל, אנדותאלין -1 ו אנגיוטנסין II), והגורמים היפרקטליזציה הנגזרת (EDHF)3. שומרים על הטון המקומי. של מנוע4,5.

תפקוד לקוי של האנדותל מאופיין בפגם בvasodilatation התלוי באנדותל6, סימן ההיכר של הזדקנות כלי הדם7. עם הגיל, היכולת של אנדותל לקדם את vasodilatation היא מופחתת בהדרגה, בשל בעיקר לירידה ללא זמינות ביולוגית, כמו גם ביטוי בלתי תקין ותפקוד של אנוש באנדותל ובמפקדת הסטארגייט בתאי שריר כלי הדם חלק8 , מיכל בן 10 , 10. מופחתת ללא זמינות ביולוגית הפקת ביוציטורים בעלי תלות אנדותל,11,12. בעורקים הישנים, חוסר תפקוד אנדותל גורם היפרפלזיה בתקשורת, כפי שניכר על ידי עליות המסומנים בעובי הקיר, מספר הגרעין המדיאלי, אשר מזכירים את העיבוי העורקים ביתר לחץ דם וטרשת עורקים נצפתה אצל האדם חולים13,14. בנוסף, התנאים הפתופסלוגיים כגון השמנה, סוכרת או יתר לחץ דם להאיץ את ההתפתחות של בתפקוד אנדותל15,16.

רקמת השומן הפריסקולרית (PVAT) משחררת adipokines רבים להסדיר מבנה כלי דם ופונקציה17. השפעת האנטי-כועית של pvat מתווכת על ידי גורמים מרגיעים, כגון adiponectin, לא, חמצן מימן מימן גופריתי18,19,20. עם זאת, בהתאם למיקום ואת המצב פתופסולוגי, PVAT גם יכול לשפר את התגובות הקונקטילה בעורקים שונים21. החומרים הפרו-כוללים המיוצרים על ידי כולל אנגיוטנסין-II, לפטין, רסיסטין, ו-ROS22,23.  ברוב המחקרים על כלי דם בודדים, PVAT מ נחשב תמיכה מבנית פשוטה עבור ובכך הוסר במהלך הכנת מקטעי הטבעת של כלי הדם. מאחר שאדיפוז מייצגת גורם סיכון בלתי תלוי ליתר לחץ דם וכלי דם, הקשורים לבעיות לב וכלי דם24, יש לשקול את pvat מ סביב כלי הדם כאשר חוקרים את התגובתיות של עורקים שונים.

מערכות מיוגרפיה רב התיל השתמשו באופן נרחב כדי לחקור את פונקציות העושות של מגוון כלי דם, כולל העורקים, mesenteric, כליות, הירך, המוח ואת עורק כלילי25,26. הפרוטוקולים המתוארים במסמך זה ישתמשו במיגרפיה תיל כדי להעריך תגובתיות כלי דם בעורקים מצע מבודדים מדגמי עכבר ששונו גנטית, עם דגש מיוחד על אפנון על ידי pvat.

Protocol

כל החיות ששימשו למחקר שלהלן סופקו על ידי יחידת חיות המעבדה של הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת הונג קונג. התקבל אישור אתי מהוועדה המחלקתי על שימוש בבעלי חיים מעבדתיים להוראה ומחקר (אל-מע: 4085-16).

1. ההכנות

  1. הכנת תרופות
    1. אחסן סמים כראוי כאמור בגליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) מיד לאחר קבלתן. מפזר את התרופות בצורת אבקה ממיסים כמו פתרונות ריכוז גבוה ולאחר מכן סדרת מחלקים עבור אחסון ב-20 ° c.
      הערה: רוב התרופות מומס במים מזוקקים כדי להכין את פתרונות המניה; חימום או sonication עשוי להידרש עבור תרופות מסוימות. אם הסמים אינם מתמוססים לחלוטין במים, ירידה של 1 מ NaOH ניתן להוסיף, בעוד עבור תרופות בסיסיות טיפה של הHCl 1 M ניתן להשתמש. תרופות הידרופובי יכול להיות מומס ב dimethylsulfoxide (DMSO) או אתנול מוחלט. במקרים האחרונים, הריכוז האחרון של האמבט (ב-M) צריך להיות מוכר ושליטה מתאימה צריך להתבצע כדי לשלול את ההשפעות של ממיסים.
    2. לפני הניסוי, לפזר את התרופה ali, (הטבלה של חומרים) ב-krebs-ביקרבונט פתרון (krebs) המכיל 115 מ"מ הנאל, 4.6 Mm kcl, 2.5 Mm cacl2, 1.17 mm mgso4, 1.17 מ"מ KH2PO4, 25 מ"מ נחקו3, 11.1 מ"מ D-גלוקוז ו 0.01 MM EDTA, pH 7.4.
    3. לעקומות מצטברות של תגובת ריכוז, הכינו את המניות ופתרונות העבודה של תרופות שונות באמצעות דילול סדרתי (שולחן 1).
  2. התקנת הכלי
    1. כיול מתמר הכוח עבור כל הערוצים לפני השימוש במערכת מיוגרפיה בכל יום, או בכל פעם שהמערכת הועברה.
      הערה: תהליך הכיול המפורט משתנה בהתאם לדגם. באופן כללי, משקל דו גרם מוחל על הלסתות ואת הכוח המתאים צריך 9.81 ± 0.1 mN. אם הקריאה מבוטלת על-ידי יותר מ-0.1 mN, יש לכייל מחדש את התמר. עבור המערכת הנמצאת בשימוש בפרוטוקול הנוכחי (עיין בטבלת החומרים) ערכי ההפעלה עבור מתמר הכוח במהלך הכיול צריכים להיות בין 3000 ל-3500. אם הערך של המותמר גבוה או נמוך יותר, יש להחליף את מתמר הכוח.
    2. התאם ויישר את תומך ההרכבה בכל תא. שימוש רציף וחוזר על החדר מיוגרף עלול לגרום לחוסר התאמה של התמיכה הגוברת, הדורשת הסתגלות מזדמנים לפני ניסויים כדי להבטיח שהלסתות יהיו מיושרות כראוי.
      הערה: יש צורך בתשומת לב מיוחדת בעת התאמת התמיכה הגוברת כאשר מפרידי הכוח רגישים מאוד ושבריריים.
    3. לעבור על תנורים וגז (95% O2 ו 5% CO2) לפחות 30 דקות לפני הניסוי כדי לאפשר את התאים ואת המאגרים להיות מחומם עד 37 ± 0.1 ° c ו משקל עם תערובת הגז.
      1. בדוק את הטמפרטורה על המדחום כדי להבטיח את הדיוק של התנור. ניתן לשנות את הטמפרטורה כדי להפעיל ניסויים בקירור או בהתחממות. אם הטמפרטורה אינה נכונה בהתאם להגדרה, החל את פונקציית ההיסט של המחשב כדי להגדיל או להקטין את ההגדרות כדי להגיע לטמפרטורה הנדרשת.
    4. בסוף הניסוי, לנקות את כל התאים ולכבות את החימום, כמו גם את הגז הפועל לכיוונון.
      1. אל תכבה את הגז לפני כל הנוזל בחדר נשאב מתוך המערכת, אחרת החומצה/מים מזוקקים עלול להקיא ולהגיע לחדר העוגב במהלך השימוש הבא.
      2. כדי לנקות את התאים של התיל מיוגרף, הדרך היעילה ביותר היא לבצע לשטוף חומצה באמצעות פתרון חומצה אצטית מדולל. נקו את הקצה ואת החלק הפנימי של התאים עם משטח כותנה.
      3. לאחר השטיפה, שטפו את התאים ביסודיות עם מים מזוקקים. נגב את החלק החיצוני של התאים עם מטלית רטובה כדי להסיר מלח יבש. אתנול יכול לשמש גם אם סמים הידרופובי שימשו במהלך הניסוי.
      4. דוגמה לתהליך הכביסה הוא כדלקמן. ממלאים את התאים עם 8% חומצה אצטית תמיסה ומודלת עבור 2 דקות. השתמש במוליך עם כותנה משופעת כדי לנקות מכנית את משטח תא הפלדה. הימנע ממגע עם החלק האלומיניום של היוגרף.
      5. מייבשים את חומצת החומץ ושוטפים את החדר המיוגרף ותומכים מספר פעמים עם מים מזוקקים ויבשים את המשטחים באמצעות נייר סופג או מכשיר טיפים לכותנה.
  3. חיתוך טבעות עורקי העורקים המיוטרתית
    הערה: בעלי חיים המשמשים את המחקר הנוכחי היו תזונה גבוהה שומן האכיל הגברים Adipo-SIRT1 עכברים וסוג פראי כאלה כפקדים. כל חיה שקלה כ 45 g בזמן הניסויים.
    1. המתת חסד העכבר על ידי הזרקת הצפק תוך פנטוברביטל נתרן (50 מ"ג/ק"ג).
    2. עם מספריים כירורגית מלקחיים, לבצע באמצע קו הניתוח כדי לחשוף את תכולת הבטן.
    3. לאסוף את הארקייד מצע לתוך צלחת פטרי מצופה סיליקון.
    4. הפיצו והצמד למטה את רשת מצע בצלחת פטרי כדי לחשוף את הסתעפות המצע המעי ואת רקמת החיבור מישאל.
    5. תחת מיקרוסקופ (10x), ועם מספריים דקים ומלקחיים, מנתחים בזהירות את הסביבה של רקמות החיבור. הימנע מפגיעה ברובד האדוייתי. לחילופין, ניתן לשמור את רקמת השומן הסובבת סביב כלי הדם לצורך ניסוי (במידת הצורך).
    6. באמצעות מספריים ומלקחיים עדינים, בלו את הענפים המשניים של עורקים מצע בתוך מאגר קרבס קר.
      הערה: על כל חוקר להיות בעל ערכת ניתוח משלו, מיתרים וארכופים. כלים אלה יש לשמור כראוי ולנקות בכל פעם לאחר הניסוי כמו תרופות מסוימות קשה לשטוף משם שאריות יכולים לדבוק בהם.
      1. שמרו את כלי הדם בתוך מאגר קרבס קר תוך הפרדת רקמות החיבור הסובבות, כולל PVAT מ. במהלך הטיפול בכלי הדם, היה עדין למנוע פגיעה מיותרת באנדותל.
      2. אם הניסוי כולל את המחקר של PVAT, לשמור על 1.5 כדי 2 בקוטר מילימטר של PVAT מ סביב כלי הדם. לחילופין, ניתן להוסיף את אותן כמויות של רקמות האדיפוז בכל חדר להתנסות.
    7. אופציונלי הסירו את האנדותל מכלי הדם הגזור כפקד כדי להעריך את התלות האנדותל של התגובות. כדי להסיר את האנדותל בעדינות. על ידי העברת חוט או שיער
    8. חותכים את כלי הדם מוכן לעיל לתוך טבעות קטנות (~ 2 מילימטר אורך) ולשים אותם בצלחת פלסטיק מלא של גז (95% O2 ו 5% CO2) מאגר krebs עבור בעקבות הרכבה לתוך התאים של חוט מיוגרף27.
    9. העבירו את טבעות הספינה לחדר מיוגרף הממוקם מתחת למיקרוסקופ. הטבעות צריכות להיות ממוקמות באופן שווה, כאשר העליון והתחתון מקביל. תיל החיבור (40 μm) צריך להיות מוכן לאחרונה כמו תרופות יכול לאגד את המחרוזות.
    10. הפתיל הטבעת כלי הדם על אורך מתאים (2 ס מ) של התיל ומאובטח ללסת אחת של התא הגובר על ידי כדי לתקן את העמדה.
    11. להעביר חוט השני דרך הטבעת ועוגן ללסת הנגדית.
    12. עם טבעות משורשר ומאובטחת ללסתות קאמרית, הר את התא אל ההתקנה מיוגרף ולהפוך את הבורג מיקרומטר בכיוון השעון כדי להזיז את החוטים קרוב זה לזה עד הקריאה כוח בממשק המשתמש המתאים לחדר רכוב הוא אפס או פשוט להלן.
      הערה: החוט המצורף ללסת העליונה צריך להיות באורך מינימלי כדי להבטיח שהמתח יוכל להיות מחובר במלואו לגלאי.
    13. באמצעות ה37 לפחות 30 דקות לפני היישום הראשון של כוח באמצעות המיקרומטר הניתן לכוונון.
    14. להעריך את הכדאיות רקמת ב-115 mM אשלגן גבוה (הוחלף על ידי kcl על בסיס טוחנת) krebs המכיל 4.6 מ"מ הנאל, 115 mm Kcl, 2.5 mm cacl2, 1.17 mm MGSO4, 1.17 Mm KH2PO4, 25 מ"מ נחקו3 ו 11.1 mM D-גלוקוז ב-pH 7.4.
      הערה: ספינות מבודדות נחשבות לקיימות אם הכוח הכפוי מוקלט ונרשם כסטיה מעל לקו הבסיס בתוכנת הקלטת הנתונים של מערכת היויוגרף היא יותר מ-40% מטונוס המנוחה שלהם, בתגובה לסוכן כפוי. אם העורק אינו חוזה כראוי, אזי המתח הבסיס האופטימלי/לחץ הקיר לא הותאם כראוי, או העורק אולי ניזוק בבידוד או הרכבה של הכלי.
    15. אופציונלי להעריך את היושרה של תאים אנדותל על ידי החלת phenylephrine כדי לגרום התכווצות של כלי 50% התגובה הראשונית KCl (כפי שנרשם על ידי מתמר הכוח בתוכנה הקלטת נתונים), ואחריו הוספת 1 μM אצטילכולין.
      הערה: הכנה לכלי דם טובים היא חיונית להשגת תוצאות עקביות ומדויקות. אין להשתמש בהכנה לניסוי גם אם בדיקת התקינות האנדותל אינה משביעת רצון או שהיא אינה מגיבה ל-KCl, ומציינת כי הפונקציה האנדותל או השרירים החלקה של כלי הדם, בהתאמה, אינם מספקים. במקרה זה, ההכנה צריכה להיות מוחלפת בטבעת חדשה מאותו כלי דם או מכלי דם חדש.

2. נורמליזציה כדי לקבוע את המתח הראשוני האופטימלי

הערה: הליך הנורמליזציה מאפשר לקבוע את הקוטר הפנימי האופטימלי (IC) של עורקים שבהם כלי הדם חווה בלחץ המתאים להנחת קיר (100 mmHg או 13.3 kPa) ומייצרת פעיל מקסימלי כוחות בתגובה לסוכני vasoactive.

  1. הפעל את המחשב ופתח את תוכנת הקלטת הנתונים (עיין בטבלת החומרים).
  2. שמור את הניסוי כקובץ הנתונים "LabChart" בשם חדש כדי להימנע מהחלפת קובץ ההגדרה המקורי.
  3. פתח את חלון הגדרות הנורמליזציה והגדר את ה- k factor כ-1. קבל את ערכי ברירת המחדל עבור כיול עינית (0.3, אם אורך הספינה אינו ידוע, או 1 אם אורך הספינה ידוע), היעד לחץ (13.3), באופן מקוון חישוב זמן (2) וזמן עיכוב (60). לחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות.
  4. בחר ערוצי ריבית וקלט את קוטר התיל (40 μm), נקודות קצה של רקמה (a1:0; a2: אורך הרקמה כפי שנמדד), קריאה ראשונית של המיקרומטר בחלון הנורמליזציה.
  5. הפעל את הליך הנורמליזציה על-ידי החלת המתיחה הפסיבית הראשונה לכלי הדם (הפוך את הבורג המיקרומטר נגד כיוון השעון).
  6. המתן עד שכלי הקיבול יתייצב (3 דקות) וקלט את קריאת המיקרומטר החדשה בחלון הנורמליזציה. מתח הקיר מחושב באופן אוטומטי ומוצג כנקודה בגרף.
    הערה: "צעדים" ששימשו במהלך המתיחה הפסיבית אינם צריכים להיות זהים. המתיחות הראשונות יכולות. להיות 20 יקרומטר כל אחד כמו מתיחות להתקרב לקו isobar, השלבים יכולים להיות מופחת ל 10 יקרומטר, 5 יקרומטר, 2 יקרומטר או אפילו קטן יותר. יש לפתוח את חלון התרשים הראשי תוך כדי התאמת הגדרות המיקרומטר-אם מדובר בקפיצה גדולה העולה על קו הisobar בגרף אורך/מתח (המציין נקודות לחץ המתאימות לערך מראש), הפחת את המתח.
  7. לאחר כל מתיחה פסיבית, להחליף את הפקד Krebs עם אוסמוטי-האשלגן הגבוה הגבוהה קרבס המכיל 115 mM KCl. כאשר הכיווץ מגיע לרמה (כ-3 דקות), הקלט את הכוח הפעיל (F) על-ידי הפחתת הכוח הפסיבי בכל מתיחה מהכוח המופעל באמצעות אשלגן. חשב את המתח בקיר, כמו גם את ערכי ההיקף הפנימי (IC).
    1. מדידת מתח פעיל כהטיה מעל לקו הבסיס. המתח הפעיל (T) מחושב על בסיס משוואת F (mn) = T (mN/mm) x 2 x אורך הספינה (mm). ערכי היקף פנימי (ic) מחושבים מתוך נתוני המיקרומטר (IC = 205.6 יקרומטר + 2 x "פער").
  8. הסר את מצב האשלגן הגבוה על-ידי החלפת קרבס טריים. חזור על הכביסה במשך שלוש פעמים מעל 5 דקות.
  9. חזור על שלבים 2.5 עד 2.8 (על ידי גרימת מתיחה פסיבית ואחריו כיווץ פעיל בתורות חלופיות) עד שהמתח הפעיל מתחיל להצטמצם (איור 2).
  10. לאחר סיבובים מרובים של מתיחות חלופיות, האורך הפסיבי/עקומות מתח לתת את הערך של IC100, את ההיקף הפנימי של כלי הקיבול בלחץ מעבר לקיר של 100 mmHg, כנקודת המעבר עם קו isobar.
    הערה: כל ערך מיקרומטר במהלך המתיחות הפסיבית מוצג באופן ידני במודול נרמולהתוכנה. התוכנית מתעדת באופן אוטומטי את המדידה כוח המתאים כדי ליצור את עקומת המתח/אורך פסיבי, אשר נותן את הערך של IC100 כנקודת המעבר עם קו isobar (איור 2, לוחות זכות). ככל שהנקודה האחרונה מתקרבת לשורה הisobar, אבל ממש מעל הנורמליזציה הטובה יותר, היא מבלי לפגוע בכלי הדם. נקודה מעל לקו הisobar עלולה לגרום נזק פיזי לכלי הקיבול הנטען, ולגרום לתוצאות לא אמינות במהלך הניסוי.
  11. צור את עקומות האורך/המתח הפעיל כדי לקבוע ערכי IC1 ולחשב את מקדם הנורמליזציה k כיחס של IC1/IC100, אשר ישמש עבור סוג זה של כלי דם בניסויים המיגרפיה העוקבת.
    הערה: האורך/עקומות המתח הפעילים נוצרים על-ידי התוויית ערכי ה-IC המחושבים מנתוני המיקרומטר בציר ה-x והמתחים הפעילים בציר ה-y. IC1 הוא הערך השוכן באזור רמת השיא (עקבות אדומים באיור 2, לוחות מימין). לאחר התוויית האורך/המתח הפעיל עקומות וקביעת IC1, מקדם הנורמליזציה k מחושב כיחס של IC1/IC100. בהתבסס על פקטור k הנורמליזציה, IC האופטימלי עבור בסיס הבסיס, מסומן כ IC1, יופיע על עקומת המתח/אורך פסיבי. הגדרת המיקרומטר עבור ה-IC הזו מופיעה תחת העקומה ויש להשתמש בה כדי להגדיר את המיקרו-פוזיגרף לניסויים מיאלוגרפיה הבאים. המתח הראשוני (T) שווה ללחץ היעד (Pi) x IC/2π והכוח האופטימלי (F) המוחל על הספינה שווה לאורך הספינה T x 2 x.
  12. לשטוף ביסודיות החוצה את האשלגן הגבוה Krebs ואת ההכנות עבור אחר 30 עד 45 דקות. לאפס את המתחים הבזליים "אפס" כך שרק תגובות הקונקטילה הפעיל יירשמו במהלך הניסוי הבא.

3. התכווצויות Phenylephrine המושרה

הערה: תרופות שניתן לבחור לגרימת התשובות הvasoconstrictive כוללות את ה-אדרסוטור בלתי מוגדר, האנוניסט הסלקטיבי של הphenylephrine, ההורמון הפפטיד אנגיוטנסין II, ומונואמין נוירוטרנסמיטר 5-hydroxytryptamine. Phenylephrine משמש בפרוטוקול הנוכחי לבדיקה (טבלת חומרים).

  1. להכין ולטעון טבעות עורקים לזווג כפי שמתואר בסעיף 1.3, אחד עם PVAT שלמים והשני עם PVAT מ הוסר, מן הסעיפים הסמוכים של כל עורק עבור הניסוי.
  2. לאחר נורמליזציה (המתואר בסעיף 2), טרום חוזה את מקטעי העורקים עם מאגר קרבס אשלגן גבוה על ידי הוספת 115 mM הפתרון KCl לחדר המכיל Krebs.
  3. המתן לכיווץ הרמה (3 דקות), לשטוף את האשלגן הגבוה ולהחליף עם מאגר קרבס טרי. חזור על הכביסה שלוש פעמים על 5 דקות.
  4. חזרו על גירוי ה-KCl וכביסה שלוש פעמים והקליטו את התגובה/המתח המקסימלי ל-KCl על-ידי הפחתת המתח הבסיסי מהמתח עקב גירוי של KCl.
  5. לאחר ההתכווצות האחרונה והכביסה, למלא את החדר עם מאגר קרבס חם, גז ולאפשר לעורק להתאושש כ 30 דקות לפני ביצוע המשימה הבאה.
  6. לכל חדר, יש להוסיף כמויות מצטברות של phenylephrine (בהפרשים של חצי יומן מ-10-10 עד 10-4 מ') כדי לגרום לעלייה בריכוז התלויות במתח איזומטרי של ההכנות השקטים.
  7. התחל על ידי הוספת ריכוז נמוך של אגוניסט לחדר. לאחר התרת מספיק זמן להתכווצות יציבה (3 – 5 דקות), הוסיפו את הריכוז הבא. חזור על השלבים עם ריכוזים גוברת של phenylephrine.
  8. לאחר הוספת המנה האחרונה של אגוניסט (phenylephrine), לשטוף את התרופה ביסודיות ולמלא את החדר עם מאגר Krebs טרי. התווה את התגובות התלויות בריכוז כאחוזי הגדלה של הצירים המקסימלית המושרה ב-KCl (איור 3).
  9. אופציונלי כדי להעריך את התרומה של לא, מארג את ההכנות עם מעכב הסטנדרטים לא, L-שם (10-4 M), עבור 30 דקות לפני התוספת של phenylephrine. L-NAME משפר את הצירים phenylephrine המושרה בהכנות השקט של העורקים המסטרמית (איור 4).
    הערה: על מעכבי או האנטוניסטים להיות מספיק זמן כדי להשיג שיווי משקל, בדרך כלל 30-45 דקות (להיות עקבית לכל קבוצה של ניסויים).
  10. לביצוע עקומת ריכוז שני ברציפות, לשטוף את התא לחלוטין ושוב כדי להסיר את כל האגוניסטים הקודמים, עד שינויים נוספים בטון הם נצפו.
    הערה: ניסויים מקבילים חושפים לפחות שתי טבעות שהתקבלו מאותו כלי דם לאגוניסט, אחד תחת תנאי שליטה ואחד בנוכחות המדכא (ים); בכל טבעת, העקומה-תגובת הריכוז תתבצע רק פעם אחת. מעדיפים לבצע ניסויים מקבילים, שכן זה מספק שליטה טובה יותר לפעולה של הסם ורגישות לכלי הדם. ניסויים סדרתיים להשיג עקומת הריכוז-תגובת לאגוניסט בטבעת אחת; לשטוף את זה, לשנות את התנאים הניסיוניים (למשל, הוספת מעכב), ולאחר מכן חזרה על עקומת תגובת הריכוז על אותה טבעת. במקרה זה, שולטת הזמן נדרשים כדי להראות כי תגובות התרופה לא נובע שינויים של הרקמה לאורך זמן. אי אפשר להיות בטוחים שהרקמה נמצאת בדיוק באותה מדינה לאחר החשיפה לניסוי של תגובת ריכוז. זמן מספיק (לפחות 30-60 דקות) חייב להינתן כדי לאפשר למקטעי כלי לחזור המתח שלהם (בסיס) למרות במקרה מסוים, זה לא יכול להתרחש מיד לאחר הדיסוציאציה של אגוניסט אהדה גבוהה מן הקולטנים. בנוסף, האשלגן הגבוה מאפשר למרוח בין העקומות המצטברות של תגובת הריכוז כדילהפחית את הפחתת הרגישות. זכור כי רוב האנטוניסטים לא ניתן לשטוף לחלוטין, ובכך להמשיך להוסיף אותו לשאר הניסוי.

4. אנדותל-הפסקות תלויות/התכווצויות

  1. טרום חוזה קטע עורקי שנטען טרי (כמתואר בשלבים 3.2 עד 3.5). שוב, הקלט את התגובה/המתח המקסימלי של מהירות הפעולה ל-KCl על ידי הפחתת המתח הבסיסי מן המתח עקב גירוי KCl.
  2. אופציונלי מודאת ההכנות עם מעכב לא סטנדרטים, L-שם (10-4 M), עבור 30 דקות לפני התוספת של U46619.
  3. מוסיפים את הריכוזים המחושבים מראש של U46619 לחדר ומאפשרים התכווצות יציבה, מתמשכת של מקטעי העורק.
    הערה: תגובות vasodto המושרה בעורקים מצע לפני החוזה על 80% של התגובות המקסימלי 115 mM kcl. אגוניסטים שונים ניתן להשתמש כדי לגרום התכווצות על ידי הפעלת קולטנים ספציפיים שלהם. כאן, כלי הדם מפלחים עם או בלי PVAT מ מראש מתכווץ עם U46619 (1 – 3 x 10-8 M; טבלה של חומרים), מגוון התרווניסט A2 של הקולטן, כדי לגרום יציב ומתמשך התכווצויות שריר חלק.
  4. הוסיפו ריכוזים מצטברים של אצטילכולין (10-10 עד 10-4 מ') לחדר העוגב. התגובות הקשורות לריכוז והתגובה של מקטעי עורק מוצגים כאחוז התגובות הU46619 המושרה (איור 5).
    הערה: עבור רוב הניסוי, הריכוז הבא של אגוניסט מרגיע יש להוסיף מיד כאשר הרמה היא נצפתה כדי למנוע ריבאונד במתח. התגובות הקשורות לריכוז והתגובה של מקטעי עורק מנורמלות כאחוז מתגובות הקונאקטU46619 המושרה להתאמת הבדלים משניים באמצעות שימור וקוטר בין מקטעי העורק (איור 5). משתנים קטנים בתגובה בין טבעות בודדות שהתקבלו מכלי הדם אותו להיות מינימלי כאשר קבוצה של שישה או יותר ניסויים מנותח מבחינה סטטיסטית. כאשר מבטאים תגובות כאחוז של הצירים המקסימלי של רקמת הפרט, זה מתאים להשתמש בניתוח מזווג (למשל, לזווג t-test של סטודנט) כדי להשוות תגובות של אותו סוג של רקמות מחיות שונות כדי להשוות תגובות של רקמה אחת לפני ואחרי התערבות. בעת ניתוח ההשפעות של PVAT מ, משתמשים ב-ANOVA שתי כיוון ואחריו מבחן מרובה השוואה.
  5. לאחר הוספת המינון הסופי של אגוניסט מרגיע, להסיר את הסם מכל חדר ומילוי עם מאגר Krebs טרי. רוחצים את התא ביסודיות עם מאגר Krebs ולתת העורק לייצב לפחות 45 דקות לפני ביצוע ניסויים נוספים.

תוצאות

בחינת מערכת היחסים האורך/המתח להשגת פקטור הנורמליזציה k

כמות המתיחה המוחלת על קטע הספינה משפיעה על היקף האינטראקציה של actin-רירן ולכן הכוח הפעיל המקסימלי התפתח. לפיכך, עבור כל סוג של כלי דם, קביעת כמות המתיחה הנדרשת עבור כוח פ?...

Discussion

מלבד תאי האנדותל, אותות הנגזרים מהמע מ ממלאים תפקיד חשוב בוויסות הטון של השריר החלק החוזר30. Pvat בריא משחררת לא האנטי דלקתיות אדיפונקטין להפעיל אפקט אנטי קונקטילה על העורקים, אשר אובד בתנאים פתולוגיים כגון השמנה תסמונת מטבולית31,32. במצבי מחלה, pvat ?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו היתה תמיכה פיננסית על ידי המענקים של מחקר מלגת המועצה של הונג קונג [17124718 ו 17121714], הונג קונג בריאות ומחקר רפואי קרן [13142651 ו 13142641], קרן מחקר שיתופי של הונג קונג [C7055-14G], ואת הבסיס הלאומי תוכנית מחקר של סין [973 תוכנית 2015CB553603].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetylcholineSigma-AldrichA6625Stock concentration: 10-1 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-AldrichN5751Stock concentration: 3 x 10-2 M
Working concentration: 10-4 M
PhenylephrineSigma-AldrichP6126Stock concentration: 10-2 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)EnzoBML-PG023-0001Stock concentration: 10-5 M
Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myographDanish MyoTechnology (DMT)620M
PowerLab 4/26ADInstrumentsML848
Labchart7ADInstruments-
Adipo-SIRT1 wild type miceLaboratory Animal Unit, The University of Hong KongCULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishesDanish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wiresDanish MyoTechnology (DMT)300331
Surgical tools

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  2. Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
  3. Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
  4. Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
  5. Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
  6. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
  7. Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
  8. Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
  9. Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
  10. Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
  11. Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
  12. Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
  13. Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
  14. Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
  15. Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
  16. Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
  17. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  18. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  19. Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
  20. Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
  21. Gao, Y. -. J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
  22. Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
  23. Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
  24. Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
  25. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
  26. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  27. del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
  28. Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
  29. Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
  30. Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
  31. Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
  32. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  33. Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
  34. Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
  35. Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
  36. Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
  37. Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
  38. Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
  39. Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
  40. Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
  41. Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
  42. Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved