הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

Summary

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

Abstract

שיטות המבוססות על הומוולוגי מחדש לשנות גנים יש לקידום משמעותי מחקר ביולוגי. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הם שיטה קפדנית לחקר התפתחות היונקים והמחלות. המעבדה שלנו פיתחה מספר GEMMs של סרטן הערמונית (PCa) כי חוסר הבעה של אחד או מספר גנים מדכא הגידול באמצעות אתר ספציפי-loxP recombinase מערכת ומקדם הערמונית ספציפי. במאמר זה, אנו מתארים את השיטה שלנו נקרופסי של אלה PCa GEMMs, בעיקר התמקדות בניתוח של גידולים בערמונית העכבר. שיטות חדשות שפותחו במהלך העשור האחרון הקלו את התרבות של תאים האפיתל-הנגזרים למודל מערכות איברים בתחום החוץ בשלושה מימדים. כמו כן, אנו מפרטים שיטת התרבות התא 3D כדי לייצר אורגנואידים הגידול של העכבר PCa GEMMs. טרום קלינית מחקר הסרטן נשלט על ידי תרבות התא 2d ו קו הנגזר או החולה מודלים מבע. שיטות אלה חסרות מיקרואקולוגיה הגידול, מגבלה של שימוש בטכניקות אלה במחקרים קדם-קליניים. GEMMs הם יותר מבחינה פיזיולוגית-רלוונטי להבנת tuמוריגנזה התקדמות הסרטן. התרבות האורגאידית של הגידול היא מערכת מודל מבחנה כי לכידה של ארכיטקטורת הגידול ומאפייני השושלת של התא. בנוסף, 3D שיטות תרבות התא לאפשר צמיחה של תאים נורמליים להשוואה לתרבויות תאים סרטניים, אפשרי לעתים נדירות באמצעות 2D טכניקות תרבות התא. בשילוב, השימוש בתרבות תא של GEMMs ו 3D במחקרים קדם-קליניים יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את הביולוגיה של סרטן.

Introduction

מאז סוף שנות ה-80, היכולת לשנות גנים על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי התקדמה מאוד במחקר של מערכות ביולוגיות¹. Inducible, רקמה-, או תא ספציפי מערכות קידום האתר recombinases ספציפי, כגון היצור-loxp, יש מחקרים גנטיים מתקדמים על ידי הקלה על שליטה על שינויים גנטיים הן זמנית ו מרחב^{2,3, ד}. השילוב של אסטרטגיות גנטיות אלה יצר מגוון רחב של מערכות מודל ניסיוני^5,6,7.

מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הם כלי אינטגרלי כדי להעריך כיצד גנים בודדים או קבוצות של גנים משפיעים על פיתוח ומחלות היונקים. במחקר טרום קלינית לסרטן, GEMMs הם השיטה הפיזיולוגית ביותר הרלוונטית וקפדני ללמוד פיתוח סרטן, התקדמות, וטיפול⁸. המעבדה שלנו מתמחה בהפקת ואפיון של GEMMs סרטן.

הסרטן המאובחנים ביותר בקרב גברים בארצות הברית הוא סרטן הערמונית (PCa). רוב המטופלים עם PCa יש סיכון נמוך מחלה וסבירות גבוהה של הישרדות, אבל שיעורי הישרדות ירידה דרסטית כאשר המחלה מאובחנת בשלבים מתקדמים או אם טיפול הורמונלי ממוקד גורם התקדמות אגרסיבי, לא לריפוי PCa תת-סוגי^9,10. המעבדה שלנו פיתחה GEMMs המשתמשים האללים של אחד או יותר גנים מדכא הגידול. שילוב ואובדן של הביטוי הגנטי מדכא הגידול מתרחשת במיוחד בבלוטת הערמונית, כי הצגנו transgene עם recombinase במורד הזרם של היזם פרוסין מופעל רק בתאי אפיתל הערמונית^{11, 12}. יש לנו גם לגדל את ה-gemms שלנו להכיל את הכתבת שלנו שנקרא מקרא mT/mG, אשר משרה ביטוי חלבון פלורסנט העגבנייה בתאים חסרים היצורים הירוקים חלבון פלורסנט (gfp) ביטוי בתאים עם היצור¹³. בעוד המצגת של שיטה זו ותוצאות הנציג שלנו להראות GEMMs אנו לומדים במעבדה שלנו, פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לייצר סרטן הערמונית אורגנואידים מכל מודל העכבר. עם זאת, כפי שנדונו בפירוט בסעיף התוצאות הנציג שלנו, הבחנו כי מאפייני הגידול מסוימים הם אופטימליים עבור הדור סרטן הערמונית אורגאיד.

בעשור האחרון, שיטות חדשות של תאים culturing מרקמות של מוצא אפיתל הובילו להתקדמות משמעותית ביכולתנו לדגמן מערכות איברים בתחום החוץ מבחנה^14,15. המושג "3D תרבות התא" יוחסו טכניקות המעורבים בהקמת ושמירה על אורגנואידים, אשר ניתן להגדיר בדרך כלל מבנים העשויים מתאים להרכיב ארכיטקטורה משנית מונע על ידי אברי השושלת הספציפית האיברים מאפיינים¹⁶. שיטות חדשות אלה הן ברורות מתרבות התא דו-ממדית הקלאסית בתאים שאינם דורשים טרנספורמציה או התבגרות לצמיחה ארוכת טווח; כך, התרבויות 3D של תאים נורמליים ניתן להשוות לתאים חולים. זה בעל ערך רב במיוחד בחקר הסרטן שבו התרבויות נורמלי בקרת תאים בדרך כלל לא היה זמין. בנוסף, אורגנואידים בצורה ספונטנית ארכיטקטורות רקמה משנית עם סוגי תאים הבדיל כראוי, מה שהופך אותם מערכת מודל טוב יותר להבין סרטן באופן מתורבת מאשר 2D קווי התא¹⁷. המעבדה שלנו יצרה שורות 3D אורגאיד מבעיית הגידול מבודדים PCa שלנו GEMMs כדי להשלים את הנתונים שלנו vivo ולבצע ניסויים אשר לא יהיה ריאלי ב-GEMMs.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים כתובים וחזותיים עבור נקרופסי השלם של PCa GEMMs, כולל ניתוח של הערמונית ברורים העכבר נגעים גרורתית. אנו לתאר ולהראות צעד אחר צעד שיטה ליצירת אורגנואידים מפני גידולים בערמונית העכבר מבוסס על פרוטוקול שפורסם בעבר על-ידי Drost et al. עבור הנובעות אורגנואידים מרקמת הערמונית נורמלי עכבר אפיתל¹⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הליכים בעלי חיים המתוארים כאן בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במחלקה למשאבי בעלי חיים במעבדה, מרכז הסרטן ברוזוול, באפלו, ניו יורק.

הערה: עכברים זכרים להיות גזור לבודד וגדלת או גידולים הערמונית עבור דור של אורגנואידים צריך לפחות להגיע לגיל של בגרות מינית-כ 8-10 שבועות של גיל. גילאים ספציפיים של עכברים יכולים להשתנות בין המחקרים. גורמים מסוימים לשקול בעת בחירת גיל כוללים שינויים תלויי גיל באוכלוסיות של תאי הערמונית, ביטוי תלוי הגיל של טרנסגנים ספציפיים מונחה היזם המקדם, ושיעור של התקדמות גידול הערמונית ב-GEMM מסוים.

1. חיתוך והדמיה של העכבר הגידול וגידולים גרורתית

1. הכנות
   1. להשיג כלי ניתוח סטרילי הכרחי. אזור לנתיחה הבמה על משטח סטרילי נקי עם הסרגל 15 ס מ, איזון דיוק, האיזון האנליטי, בקבוק ספריי עם 70% אתנול, מלוחים באגירה פוספהו (PBS), מגבות נייר.
   2. הכנת פתרונות קבע עבור איברים ועצמות הקרביים לא לשמש דור אורגנואיד
      1. לאיברי הקרביים: הכינו 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבמה) ב-PBS. עבור עכבר אחד, להפוך 20 מ ל של 4% בתחתית, סדרת מחלקים לתוך 2 15 מ"ל צינורות חרוטי ולשמור בטמפרטורת החדר עד השימוש.
      2. עבור עצמות ארוכות: לאורך 10 מ ל של 10 מ"ל מתוצרת באגירה נייטרלית (NBF) ב-1 15 mL ולשמור בטמפרטורת החדר עד השימוש.
   3. השג מנות 10 ס מ ללא טיפול ומילוי עם PBS שאינה סטרילית — אלה ישמשו כמכלים זמניים עבור איברים במהלך ניתוח עדין באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה.
      הערה: כלים סטריליים משמשים לניתוח רקמות ליצירת אורגנואידים. כלים לא-סטריליים משמשים לחיתוך ולחיתוך ראשוני של הגפיים האחוריות.
2. המתת חסד
   1. המתת חסד העכבר על ידי CO₂ חנק באמצעות 2.0 L/min קצב זרימה עבור 5 דקות. להסיר את העכבר מהכלוב ולבצע פריקה צוואר הרחם. השתמש במאזן המדויק כדי למדוד את משקל הגוף והשיא של העכבר.
   2. הניחו את העכבר על גבי מגבת נייר ומזרחה על משטח הניתוח בצד השני של העכבר ופונים החוצה מהחוקר. מוספית העכבר על הלוח על ידי מתיחה החוצה איבריו ופירסינג כל הכפות האחוריות ואת כפות הרגליים עם מחט חד פעמית אחת.
   3. באמצעות בקבוק ספריי, לחצי את הפרווה של העכבר עם 70% אתנול. באמצעות מספריים ניתוח לא סטרילי מלקחיים ישרים, צביטה ממש מעל הפין של העכבר ולעשות חתך קטן דרך הפרווה בלבד.
   4. המשיכו בחתך האמצע עד לצוואר העכבר דרך הפרווה בלבד. הפוך חתכים דו-צדדיים מנקודת החתך הראשוני דרך המישור הגחוני של העכבר דרך הפרווה בלבד.
   5. אחוז בפרווה ובזהירות משוך אותו הרחק מהעור של העכבר. הצמד את הפרווה ללוח כדי לאפשר גישה הן חללים בבטן החזה.
3. הוצאת מערכת הפרדה של גברים ואורואברי
   1. באמצעות מספריים לחיתוך סטרילי מלקחיים ישרים, לחתוך בזהירות דרך העור על 0.75 ס מ מעל הרקטום. המשך החתך באמצע הדרך אל החזה מבלי להפריע כל איבר בחלל הבטן. בזהירות למשוך את העור משם להצמיד את הלוח כדי לחשוף את כל חלל הבטן.
      הערה: אל תאפשר למכשירים אלה לגעת בחלק החיצוני של העכבר או בכל משטח באזור האחסון הזמני, מכיוון שניתן להשתמש ברקמות אלה כדי ליצור אורגנואידים.
   2. לנתח את המערכת באיברי המין ואיברים אחרים לפי התרשים באיור 1א, עם מספרים המציינים את הסדר האיברים יוסרו מן העכבר.
   3. למצוא את שלפוחית השתן, ואז לתפוס את משטח השומן לשמאל או לימין למשוך כלפי מעלה כדי לחשוף את האשך. בזהירות לנתח את האשך משאר האזור האורואיברי ולשים בצד. . תעשה את אותו הנוהל בצד השני
      הערה: השגת איכות רקמות אופטימלית ואפיון הגידול המפורט של גידולים בערמונית דורש כי האזור האורואיברי כולו יוסרו מהעכבר בגוש¹⁹. מומלץ להסיר תחילה את האזור האורואיברי (איור 1א).
   4. לתפוס את שלפוחית השתן ובזהירות למשוך למעלה כך האזור אורואיברי מרים יחד, חשיפת השופכה מתחת. בזמן החזקת שלפוחית השתן, המזרח את המספריים כך שהם נגד החלק התחתון של הערמונית על גבי וחותכים את השופכה. כל האזור האורואיברי. ישחרר מחלל הבטן
   5. שים את האזור האורואיברי בצלחת 10 ס מ מלא עם PBS. אם עדיין מלא שתן, לנקז את שלפוחית השתן על ידי יצירת חתך קטן. באמצעות האיזון האנליטי, שוקלים את המערכת והשיא באיברי המין.
4. הפקת בלוטות לימפה אגן, טחול, כבד, כליה, ריאות, שוקה, ועצם הירך
   1. הסרת המערכת האורואיברי חושפת את בלוטות הלימפה באגן, ממוקם ממש מאחורי המערכת אורואיברי (איור 1א) ומשני צדי עמוד השדרה. בלוטות הלימפה יהיה רק גלוי אם הם מכילים נגעים גרורתית או אם יש דלקת מקומית. אוריינט מלקחיים ישר מתחת לצומת לימפה למשוך עד להסיר את הצומת לימפה. . תעשה את אותו הנוהל בצד השני
   2. לתפוס את הרקטום עם מלקחיים ישר לחתוך. משוך על הרקטום כדי לפענח את המעי הגס כולו המעי הדק, מחפש נגעים גרורתית בבלוטות הלימפה מצע. כאשר מעי כולו מוסר, להמשיך למשוך את התריסריון כדי לחשוף את הקיבה. חותכים את הוושט כדי להסיר לחלוטין את הבטן ולהשליך. אם נגעים גרורתית בבלוטות הלימפה נצפו, בזהירות לנתח את המעי ולאחסן בצלחת 10 ס מ של PBS.
   3. חשיפת והסרת הקיבה תמשוך את הטחול מהצד השני של הבטן (איור 1א). להסיר את הטחול ומקום 4% בכיוון החול. הטחול משמש בקרת מכתים עבור hemotoxylin כפי שהוא מאוד סלולרי.
      הערה: רקמות הקרביים לא לשמש דור אורגאיד יהיה קבוע לילה ב 4% בכיוון הערוץ, שטף עם PBS, ולאחר מכן הניח 70% אתנול.
   4. הסר את הכבד בחלק העליון של הבטן (איור 1א). מבוסס על עומס גרורתי בכבד, האונות האישיות ניתן לגזור, או את הכבד כולו ניתן להסיר על ידי חיתוך בזהירות לאורך הסרעפת. (אל תחתוך את הסרעפת בשלב זה). מניחים את הכבד בצלחת 10 ס מ של PBS.
   5. הסרת הכבד תחשוף לחלוטין את הכליות משני צדי עמוד השדרה (איור 1א). הסר את הכליות — יחד עם בלוטות הלימפה בכליות, אם הצמתים יש נגעים גרורתי — על ידי הצבת מלקחיים ישר מתחת לכליה ומושך. . תעשה את אותו הנוהל בצד השני
   6. כדי לחשוף את חלל החזה, לחתוך בזהירות את הסרעפת לאורך הצלעות. פירסינג הסרעפת תשחרר את הלחץ השלילי בחלל החזה ולחשוף את הלב והריאות (איור 1א).
   7. לתפוס את עצם החזה ולמשוך עד לפתוח את החלל החזה עוד. להתבונן הפנים הגגעי של חלל החזה לאורך כלוב הצלעות עבור נגעים גרורתי בבלוטות הלימפה בחזה ונתח, אם קיים.
   8. לחתוך את כלוב הצלעות הגחוני. כדי לגשת ללב ולריאות , תפוס את הלב. השוך למעלה וחתוך מתחת לריאות כדי להסיר במלואו את הלב והריאות בגוש, לחתוך את כל כלי הדם הקדמי ואת קנה הנשימה. מניחים את הרקמה ב-PBS ובזהירות להסיר את הלב מבלי לפגוע רקמת הריאות או נגעים גרורתית ריאה.
   9. לקחת את הלא סטרילי מלקחיים ישר לבתר את המספריים ולחתוך את הרגל האחוריות בראש עצם הירך. החזיקו בזהירות את עצם הירך והסירו את הרגל האחוריות מהפרווה.
   10. הניחו את הרגל האחוריות על מגבת נייר והחזיקו ברגל האחוריות. השתמש להב תער קצה אחד כדי לגנוז/לחתוך את כל השריר ואת רקמת החיבור מן השוקה ואת עצם הירך. להסיר את עצם הירך מתוך השוקה ידי חיתוך האחורי של צלחית ולהסיר את השוקה על ידי הסרת כף היד האחוריות. הניחו את השוקה ואת עצם הירך ב -10% NBF. . תעשה את אותו הנוהל בצד השני
       הערה: לצורך בחינת העצמות הארוכות של העכבר עבור נגעים גרורתית, הפיבולה אינו צריך להיות שלם. העצמות הארוכות יתוקנו ב-10% NBF למשך שבוע, ולאחר מכן הפכה באמצעות פתרון EDTA נייטרלי²⁰. לאחר שלושה שבועות, העצמות יועברו 70% אתנול.
   11. לאחר הסרת הגפיים האחוריות, לקחת את האוזן או חיתוך הזנב לצורך הקלדה עתידית. להיפטר גווייה העכבר ואת כל הרקמה לא להיות קבוע או משמש לדור אורגאיד.
5. חיתוך של גידול בלוטת הערמונית
   הערה: חיתוך של אונות הערמונית העכבר ניתן להשיג רק באמצעות מיקרוסקופ מבתר¹⁹. עם זאת, העומס גידול בערמונית יכול להיות גבוה כל כך האונות הפרט לא ניתן להבדיל, ניתוח יכול להתבצע ללא מיקרוסקופ. עם זאת, הפרוטוקול המלא לניתוח של אונות הערמונית הפרט מתואר להלן.
   1. מניחים את האזור האורואיברי בצלחת 10 ס מ של PBS תחת מיקרוסקופ מבתר ומכוון את הצד הגחוני למעלה עם שלפוחית השתן ושלפוחיות הזרע הפונה החוצה מן החוקר. כל מניפולציה של אזור אורואיברי צריך להיעשות באמצעות כלי סטרילי.
   2. להעריך את הפנוטיפ הכללי של גידול הערמונית-סביר ביותר, או הגידול מלא נוזל או מוצק יהיה נצפתה PCa GEMMs (איור 2א, ב).
      הערה: נוזל מלא גידולים ממוקמים לעתים קרובות באזור הערמונית הקדמי (איור 2א). גידולים מלאים נוזלים מורכב בעיקר רקמת חיבור עם רכיבים אפיתל מצומצם — ולכן גידולים אלה אינם אופטימליים עבור הדור האורגאיד בגלל המספר הנמוך של תאים אפיתל הגידול, כפי שיידונו בתוצאות הנציג סעיף.
   3. אם מילא גידולים נוזלים נמצאים, לתקוע חור קטן בגידול. הניחו את האזור האורואיברי במנה חדשה של 10 ס מ של PBS.
   4. קח זוג מלקחיים ישר ביד שאינה דומיננטית מלקחיים מעוקל ביד דומיננטי. הפוך את האזור האורואיברי לפנים האלה. חפשו את אזור הערמונית האבומני (איור 1B), אשר ניתן לזהות על ידי צבע ורוד/אדום של השופכה. לתפוס את השופכה ולהחזיק בחוזקה כדי לתמרן את הרקמה אורואיברי עם מלקחיים מעוקל.
      הערה: במהלך ניתוח הערמונית, תמיד לשים לב למיקום של שלפוחית השתן, כמו זו היא הדרך הפשוטה ביותר לאתר את האונות הערמונית הפרט (איור 1B).
6. הסרת רקמת הערמונית מהאזור האורואיברי
   1. בעוד שהוא עדיין על הפנים האלה של האזור האורואיברי, למצוא את הבסיס של הזרע שלפוחית. הסר בזהירות את שלפוחית הזרע ולהשליך. בצע את אותו ההליך בצד הנגדי.
      הערה: הימנע מפני שלפוחית הזרע, כמו זה ישחרר נוזל הפרשה דביק ואטום אשר מפריעה לניתוח הערמונית. אם שלפוחית הזרע מנוקב, להעביר את האזור אורואיברי הנותרים כדי 10 ס מ הצלחת חדש עם PBS טרי.
   2. להסיר ולמחוק את הזרע ואת רקמת השומן הרבה והחיבור ככל האפשר באמצעות הצד המעוקל של מלקחיים.
   3. בעוד מחזיק בחוזקה את אזור הערמונית/השופכה האבובית, להשתמש זוג מספריים בסדר, הצביע כדי להסיר את שלפוחית השתן מן השופכה.
7. בידוד של אונות הערמונית הפרט
   1. אתר את הערמונית הקדמית (איור 1B). להבטיח להחזיק בחוזקה את אזור הערמונית האבו-בי/השופכה עם מלקחיים ישר. הסר את אזור הערמונית הקדמי על ידי האוחז ישירות את הרקמה עם הצד המעוקל של מלקחיים ובחוזקה מושך אותו הרחק שלפוחית השתן ואת שאר הערמונית. . מניחים את הרקמה בערוץ הPBS
      הערה: עבור כל אזורי הערמונית, מספריים מבתר עשוי להידרש כדי להסיר את הרקמה, בהתאם לגודל של הגידול.
   2. אתר את אזור הערמונית הגחוני (איור 1B). הסר את אזור הערמונית הגחוני באותו אופן כמו בשלב 1.5.7.
   3. בשלב זה של הניתוח, רק את אזורי הערמונית לרוחב והראש צריך להיות נוכח, בעוד אזור הערמונית האבובית עדיין נתפס על ידי מלקחיים ישרים. העריכו את אזורי הערמונית הצדדיים והצדיים (איור 1B). אם האזור לרוחב ניתן להבדיל מהאזור הצדדי, להסיר את אזור הערמונית לרוחב כפי שמתואר בשלב 1.5.7. עשה את אותו ההליך בצד הנגדי.
   4. הסר את אזור הערמונית הגבי כמתואר בשלב 1.5.7. מניחים את אזור הערמונית האבובית ב 4% כדור הארץ, כמו המבנה שלה בתוך רקמת השרירים של השופכה עושה את זה לא מתאים לדור אורגנואיד.

2. הדור של אורגנואידים תלת-ממד מרקמת סרטן הערמונית

הערה: איור 3 מראה תיאור ציורי של ההליך עבור דור של אורגנואידים הגידול.

1. כנה
   1. הכנת מדיה הערמונית אורגאיד של העכבר על פי Drost et al.¹⁸ עם השינויים הבאים. השתמש במדיום ממוזג במקום בחלבונים רקומביננטי עבור ראש ו-R-החתן ולהשתמש בריכוז הסופי של 1% (v/v), במקום 10%, עבור שני מדיום ממוזג ו-R-החתן.
      הערה: תאים HEK293 באופן בלתי נשכח עם העכבר הראש-Fc או העכבר Rspo1-Fc משמשים כדי לייצר מדיום או R-החתן ממוזג, בהתאמה. התאים האלה היו מתנה מהמעבדה. של קלווין קואו באוניברסיטת סטנפורד
   2. הכנת פתרון העיכול בצינור 15 מ ל על ידי דילול 20 מ"ג/mL קולגן השני עם מתקדם DMEM/F12 (+ +) מדיה לריכוז הסופי של 5 מ"ג/mL. הוספת Y-27632 רוק מעכבי לתמיסה הקולגן השני בריכוז הסופי של 10 μM.
      הערה: היחס של מאגר העיכול לרקמות הוא 1 מ ל ל 50 מ"ג, שבו אנו משתמשים על פי Drost ואח '¹⁸.
2. מינסינג והעיכול של רקמת הגידול
   1. במכסה של תרבות התא, מניחים רקמת גידול הערמונית בצלחת התרבות 10 ס מ סטרילי, נתח ומתעלם רקמת נמק.
   2. האוהב את הרקמות הנותרות סרטן הערמונית לתוך 1 מ"מ³ קוביות על ידי החזקת חתיכות הרקמה עם מלקחיים מעוקל סטרילי חיתוך עם מספריים לחיתוך.
   3. מניחים את חתיכות הגידול טחון בצינור 15 מ ל עם מאגר העיכול על-ידי סקובי אותם עם הצד המעוקל של המלקחיים. לעכל את רקמת הגידול ב 37 ° c עם טלטול עבור 1.5 כדי 2 h. בדוק התקדמות העיכול כל 20 דקות.
      הערה: בשלב זה, להוציא לפחות 2 מ ל של מטריצה מ-20 ° c האחסון וההפשרה על הקרח. 1 מ"ל מטריקס של מטריצה לוקח כ 3 h כדי להפשיר.
   4. לאחר העיכול רקמות, שפופרת צנטריפוגה ב 175 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' כדי ליצור גלולה תא.
   5. הסר את הסופרנטאנט, קפיצי את הצינור כדי לשחרר את הגלולה התא, ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של טריפסין טרום התחממות בתוספת עם 10 μM Y-27632 סלע מעכבי. שים את הצינור באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 5 דקות.
   6. לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה 5 פעמים עם P1000 tip סטנדרטי. החזר את הצינור ל 37 מעלות צלזיוס לאמבט מים לעוד 5 דקות וחזור על שלב 2.2.6.
      הערה: בשלב זה בהליך, לחמם את הצלחת התרבות 6-הטוב תא התאים על ידי הכנסתו לתוך 55 מעלות צלזיוס.
3. ספירת תאים והשעיה מחדש במטריצה
   1. לשטוף את התאים על ידי הוספת 9 מ ל של קר הוספה/F12 (+ + +) ו צנטריפוגה את הצינור ב 175 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
   2. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, קפיצי את הצינור כדי לשחרר את הגלולה, ולשטוף את התאים שוב על ידי הוספת 10 מ ל הקרה הוספה/F12 (+ + +). צנטריפוגה את הצינור ב 175 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
   3. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, קפיצי את הצינור כדי לשחרר את הגלולה, להשעות מחדש את התאים ב 1 מ ל של הוספה/F12 (+ + +), ולספור את מספר התאים באמצעות הומוציטוטומטר לפי השגרה הסטנדרטית.
   4. שבעה עד שמונה כיפות להתאים בבאר אחת של 6 היטב צלחת כאשר אורגנואידים מצופים במטריצה באמצעות אופנה טיפה. כ 200 μL של מטריקס יפיק 7-8 כיפות. להחליט כמה בארות של אורגנואידים יש צורך למטרות ניסיוני בעתיד לחשב את נפח המטריצה הנדרשת. לאחר מכן, לחשב את עוצמת הקול של הפתרון המכיל תא צריך להיות ריכוז סופי של 1.0 x 10⁶ תאים/mL של מטריקס.
   5. לאחר ספירת תאים, צנטריפוגה ב 175 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטאנט, קפיצי את השפופרת כדי לשחרר את הגלולה, והשהה מחדש את התאים בנפח של מטריצה שחושבה בשלב 2.3.4.
      הערה: מטריקס נשארת בצורת נוזל רק ב -4 ° c; לשמור על מטריקס צינורות ופתרונות תא מטריצה על הקרח בכל עת.
4. כיפות מטריצה ושימוש במדיה
   1. לערבב מטריקס-תא פתרון עם P200 pipet כדי להפיץ באופן שווה את התאים מבלי להציג בועות. להסיר את הצלחת 6-היטב התרבות מהאינקובטור 55 ° c.
   2. בזהירות פיילט 200 μL של פתרון תא מטריצה ושחרר במהירות את הפתרון לתוך באר כדי ליצור כיפות.
   3. חזור על שלב ה2.4.2. עד שהוא מושקע בנפח של פתרון תא מטריצה. הניחו לכיפות לגבש את טמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
   4. הפוך את המנה 6-טוב הפוך ולשים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס החממה כדי להמשיך מיצוק עבור 20 דקות.
   5. לאחר דגירה, להוסיף 2 מ ל של מדיה הערמונית העכבר אורגאיד לכל טוב. הוסף אנדרוגן סינתטי R1881 לכל טוב עבור ריכוז סופי של 1 ננומטר ו-Y-27632 סלע מעכבי לריכוז הסופי של 10 μM. מערבבים בזהירות ומניחים את הצלחת בחממה 37 ° c עבור culturing.
      הערה: מדיה התרבות אורגאיד צריך להיות שיושלם עם 10 μM Y-27632 רוק מעכבי עבור רק 1 שבוע לאחר דור אורגנואיד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הנציג תמונות נקרופסי של עכבר עם גידול הערמונית העיקרי ממולא נוזל באזור הערמונית הקדמי מוצגים באיור 2א. לעומת זאת, איור 2B, הצגת תמונות מייצגים נקרוסי של עכבר עם גידול מוצק גדול הערמונית העיקרי שבהם אזורי הערמונית בודדים אינם זהים. תמונות ל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

צעדים קריטיים בפרוטוקול לניתוח גידול בערמונית ויצירת אורגנואיד
הסרת רקמת הערמונית וניתוח עדין של הגידול בערמונית העכבר הוא חיוני עבור הדור האופטימלי של הסרטן אורגנואידים מאז הן תאים אפיתל שאינם הערמונית תאים אפיתל הערמונית נורמלי לייצר אורגנואידים. עבור גידולים בערמונית מו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles	Becton Dickinson	Z192430
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Analytical balance	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Dissecting Board	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Manufactured by Trevigen	Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory	Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamine (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetyl-L-Cysteine	Sigma	A9165
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Precision balance	Mettler Toledo	30216561
Scalpel #23	World Precision Instruments	504176
Scalpel Handle #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Single-edge carbon razor blade	Fisherbrand	12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight	World Precision Instruments	14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated	World Precision Instruments	15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)	APExBIO	A3008