JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

סינון פיצול אבחון, מיושם לתוך MZmine, היא גישה אלגנטית, לאחר הרכישה למסך LC-MS/MS datasets עבור מחלקות שלמות של מוצרים טבעיים ידועים ולא ידועים. כלי זה מחפש את MS/MS ספקטרום עבור יוני מוצרים ו/או הפסדים ניטרליים כי האנליסט הגדיר כאבחון עבור המחלקה כולה של תרכובות.

Abstract

מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית, ולא מתחם אחד. בשל תכונות מבניות נפוצות שלהם, תרכובות רבות בתוך אותה מחלקה עוברים פיצול MS/MS דומה ויש להם כמה יונים מוצר זהה ו/או הפסדים ניטרליים. המטרה של סינון פיצול אבחון (DFF) היא לזהות ביעילות את כל התרכובות של מחלקה נתונה בתמצית מורכבת על-ידי הקרנת מערכות נתונים מסוג LC-MS/MS לצורך הגדרת מערך MS/ms, המכילות יוני מוצרים ספציפיים למחלקה ו/או הפסדים ניטרליים. שיטה זו מבוססת על מודול DFF מיושם בתוך פלטפורמת MZmine מקור פתוח הדורש תמציות לדוגמה להיות מנותח על ידי רכישה תלוי נתונים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, כגון אוריוראפ פי ארבעה או מאסה פי ארבעה של הטיסה. אנלייזרים. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שהאנליסט חייב להגדיר תחילה אילו יוני מוצר ו/או הפסדים ניטרליים הם ספציפיים למעמד היעד של מוצרים טבעיים. DFF מאפשר את הגילוי הבא של כל המוצרים הטבעיים הקשורים במדגם מורכב, כולל תרכובות חדשות. בעבודה זו, אנו מדגימים את האפקטיביות של dff על ידי הקרנת תמציות של מיקרוקילף aeruginosa, בולט פריחת אצות בולטים מזיקים גרימת חיידקים, לייצור של microcystins.

Introduction

טנדם המסה (MS/MS) היא בשימוש נרחב ספקטרומטר מסה שיטה הכוללת בידוד יון מקודמת וגורם לפיצול באמצעות יישום של אנרגיה הפעלה כגון התנגשות המושרה (CID)1. האופן שבו שברי יונים מקושרים בצורה אינטימית למבנה המולקולרי שלו. מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית ולא כמו כימיקל יחיד ייחודי2. ככאלה, תרכובות קשורות מבנית המהווים חלק מאותה מחלקה biosynthetic לעתים קרובות לשתף מאפיינים מרכזיים MS/MS הפיצול, כולל יוני מוצרים משותפים ו/או הפסדים ניטרליים. היכולת להקרין דגימות מורכבות עבור תרכובות בעלות יוני מוצר ספציפיים לכיתה ו/או הפסדים ניטרליים היא אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לזהות מחלקות שלמות של תרכובות, שעשויות להוביל לגילוי של מוצרים טבעיים חדשים3, ד , מיכל 5 , 6. במשך עשרות שנים, שיטות ספקטרומטר המסה כגון סריקת הפסד נייטרלי וסריקת יון מקודמות שבוצעו על מכשירים ברזולוציה נמוכה אפשרה יונים עם הפסד נייטרלי או יוני מוצר זהים להתגלות. עם זאת, היונים או המעברים הספציפיים הנחוצים להגדרה לפני ביצוע הניסויים. כאשר ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה הפכו לפופולריים יותר במעבדות מחקר, דוגמאות מורכבות מוקרן כעת בדרך כלל באמצעות שיטות רכישה לא ממוקדות ותלויות נתונים. בניגוד לאובדן נייטרלי מסורתי סריקת יון מקודמן, תרכובות קשורות מבנית ניתן לזהות על ידי ניתוח לאחר הרכישה7. בעבודה זו, אנו מוכיחים אסטרטגיה שפיתחנו לסנן פיצול אבחון (dff)5,6, ישר קדימה וידידותי למשתמש גישה לזהות מחלקות שלמות של תרכובות בתוך מטריצות מורכבות. מודול DFF זה כבר יושם לתוך מקור פתוח, MZmine 2 פלטפורמת והוא זמין על ידי הורדת MZmine 2.38 או מהדורות חדשות יותר. DFF מאפשר למשתמשים למסך ביעילות את מערכות הנתונים של ד. א. ל. (MS/MS ספקטרה המכילים את יון מוצר (ים) ו/או הפסד נייטרלי (es) כי הם אבחון עבור כיתות שלמות של תרכובות. מגבלה של DFF הוא יונים אופייניים מוצר ו/או הפסדים ניטרליים עבור מחלקה של תרכובות חייב להיות מוגדר על ידי האנליסט.

לדוגמה, כל אחד יותר מ 60 שונים של fumonisin פטרת מזוהה8,9 בעלי שרשרת של tricarballylic אשר יוצר m/z 157.0142 (C6H5O5-) מוצר יון על פיצול של [M-H]- יון4. לכן, כל pumonisins במדגם ניתן לזהות באמצעות DFF על ידי הקרנת כל MS/MS ספקטרום בתוך ערכת נתונים של לוד המכילים את הבולטים m/z 157.0142 המוצר יון. באופן דומה, תרכובות sulfated ניתן להבחין על ידי הקרנת מגדיר הנתונים של דה לטרשת נפוצה/ms המכילים אובדן ניטרלי אבחון של 79.9574 Da (SO3)3. גישה זו גם הוחל בהצלחה לגילוי חדש פפטידים מחזורי5 ומוצרים טבעיים המכילים טריפטופן או שאריות פנילאלטין6.

כדי להדגים את האפקטיביות של DFF ואת קלות השימוש שלה בתוך פלטפורמת MZmine10, החלתי גישה זו לניתוח microcystins (mcs); מחלקה של מעל 240 רעלים הקשורים מבחינה מבנית המיוצר על ידי כחוליות מים מתוקים11,12,13.

מרבית הרעלים שדווחו הם MCs, עם MC-LR (לאוצין [L]/arginine [R]) congener לרוב למדו (איור 1). מחשבי MCs הם מונלוציציתיים שאינם הריבוזומפיים, ביוסינתזה על ידי מספר סייאובקטריה כולל מיקרוצילסטיס, אננינה, Nostoc, ו- plankto,12. מחשבי MCs מורכבים מחמישה שאריות משותפים ושני תנוחות משתנה שנכבשו על ידי חומצות אמינו. כמעט כל MCs בעלי מאפיין β-אמינו חומצה 3-אמינו-9-מתיונין-2, 6, 8-triמתיק-10-פנילdeca-4, 6-חומצה dienoic (Adda) שאריות בעמדה 511.  משעולים הפיצול ms/ms של mcs מתוארים היטב14,15; שאריות adda אחראי יון מוצר ms/ms בולטים, m/z 135.0803+ (C9H11O+) כמו גם יוני מוצרים אחרים כולל m/z 163.1114+ (C11H15 O+) (איור 2). לא ממוקד הנתונים של מערכת המידע הנייד של מיקרוצילף שניתן להציג עבור כל microcystins הנמצאים באמצעות יוני אבחון אלה, והעניק כי המיקרוcystins יש שאריות adda.

Protocol

1. הכנת כרומטוגרפיה בלתי ממוקדת (LC)-ערכות נתונים MS/MS

הערה: DFF ניתן לבצע באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה ושיטה אנליטית ממוטבת עבור מחלקת היעד של האנליטים. התנאים של מיטוב LC-MS/MS על ספקטרומטר המסה של אורדרראפ מפורטים בטבלת החומרים.

  1. הורדת MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    הערה: נתונים לדוגמה CPCC300. raw ניתן למצוא ב-https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
    1. תחת התפריט הנפתח שיטות נתונים גולמיים , בחר באפשרות ייבוא נתונים גולמיים .
    2. בחר את קבצי הנתונים שיש לנתח. ניתן לייבא קבצים בודדים או מרובים.
  2. אופציונלי אם תבנית נתוני הספק אינה נתמכת על-ידי MZmine, השתמש ב-פרוטרוביזארד16 כדי ליצור קבצי נתונים centroided. mzmine.
    1. בחר במסנן ' מרב האיסוף ' כדי להחיל אלגוריתם מבני מרחב המסופק על-ידי הספק.

2. סינון פיצול אבחון של קובצי הדה המיובאים

  1. באמצעות הסמן, בחר וסמן את קבצי הנתונים בעמודת קבצי הנתונים הגולמיים של מסך MZmine הראשי.
  2. תחת התפריט הנפתח החזותי , בחר באפשרות סינון פיצול אבחון .
  3. בתיבת הדו DFF המופיעה (איור 3), הקלט את האפשרויות הבאות:
    1. זמן שמירה – השתמש בטווח אוטומטי או הגדר את טווח זמני השמירה בדקות שבהן המחלקה הייעודית של האנליטים תהיה בסדר.
    2. שימוש בטווח אוטומטי m/z להשתמש או להגדיר את טווח m/z של מחלקת היעד של האנליטים, כולל האפשרות של תרכובות טעונה מרובים בעת הצורך.
    3. m/z סובלנות – להזין את הדיוק של MS/ms השגה המוני של MSinstrument; 0.01 מ'/ת' או 3.0 ppm מתאים לפלטפורמת אורדרראפ. אם רק יוני מוצרים אבחוניים ייחקרו, קלט 0.0 לתוך האפשרות האבחונית (Da) של אבחון הפסד נייטרלי . לעומת זאת, אם הפסדים מסוימים בלבד לא ייבדקו, הקלט 0.0 לתוך האפשרות של יוני מוצר האבחון (m/z) .
    4. יוני מוצרים אבחוניים (m/z) -קלט את יון המוצרים הספציפי (עם) m/zשל המחלקה. הפרד בין יוני מוצרים מרובים באמצעות פסיק.
      הערה: הזנת יוני מוצרים מרובים ידמיינו את הספקטרום המכיל את כל יוני המוצרים המפורטים.
    5. ערך הרזיה נייטרלי (Da) – קלט הפסד נייטרלי מסוים (es). הפרד בין הפסדים ניטרליים מרובים באמצעות פסיק.
      הערה: הזנת הפסדים ניטרליים מרובים תדמיין את הספקטרום המכיל את כל ההפסדים הניטרליים המפורטים. הזנת יוני מוצר אבחון והפסדים נייטרליים יהיה להמחיש ספקטרום שיספק את כל הקריטריונים.
    6. עוצמת יון אבחונית מינימלית (% בסיס שיא) – כ-% מפסגת הבסיס של ספקטרום MS/ms, להגדיר את העוצמה המינימלית עבור יוני מוצר אבחון ו/או הפסדים ניטרליים להיחשב.
    7. Peaklist קובץ פלט – בחר נתיב ושם קובץ כדי להפיק את התוצאות.
    8. לחץ על אישור לחצן כדי להפעיל את ניתוח dff. העלילה DFF תופיע על השלמת השלבים לעיל בהצלחה
      הערה: קבצי נתונים משני. csv ייווצרו. {קובץ הפלט של Peaklist}. csv מכיל את המספרים המקודטים של m/z, מספרי הסריקה ושעות השמירה של הסריקות. זה יכול לשמש מודולים MZmine הקיים כולל שיטות נתונים גולמיים ≫ זיהוי שיא ≫ ממוקד לזיהוי השיא כדי ליצור כרומטוגרמות ion שחולצו של סמנים שנתקלו בקריטריוני dff המוגדרים. {קובץ הפלט של Peaklist} _ data. csv מכיל את ה- m/zהקודמן, המוצר יון /ת' וזמני השמירה כדי לאפשר יצירה של חלקות Dff מחוץ ל-mzmine.

3. שימוש לדוגמה ב-DFF לניתוח microcystin

  1. הכנה לדוגמא
    1. לחטא 250 mL מבחנות erlenmeyer אייר המכיל 30 מ ל של מדיה סטרילית של MA17 או אחרים מדיה הצמיחה כחוליות (BG-11) מצויד בפקק קצף.
    2. איחסן מדיה הצמיחה מעוקר עם התרבות הציאנקטריה כ 5 × 105 תאים mL-1 תחת תנאים אספטי. הצג את צפיפות התאים עם הדימום. בדוגמה זו, לגדול M. aeruginosa זן CPCC300 פוטואוטוטרופי ב 27 ° c, מואר עם אור פלורסנט לבן קריר (30 μe M-2 s-1) באמצעות אור 12 h: 12 h כהה המשטר. מערבולת את התאים פעם ביום.
    3. הפרד את התאים מתוך מדיום התרבות לאחר 26 ימים על ידי סינון ואקום באמצעות 47 מילימטר בקוטר GF/C מיקרופייבר מטלית זכוכית.
    4. הוסף 3 מ"ל של 80% מתנול (aq) לתאים שנקטפו 14 מ ל שפופרת בדיקה (s).
    5. מערבולת ולאחר מכן sonicate את שפופרת הבדיקה (עם) המכילים תאי כחוליות עבור 30 s כל אחד. אחסן את שפופרת הבדיקה ב-20 ° c עבור 1 h. החזר את צינורית הבדיקה לטמפרטורת החדר ואפשר למדגם (ים) להפשיר במשך 15 דקות.
    6. חזור על השלב 3.1.5 שתי פעמים נוספות כדי לשחזר ביעילות את התאים.
    7. לסנן את התמצית כתוצאה מהחיידקים (ים) באמצעות מסנני 0.22 יקרומטר (s).
    8. תמצית יבש (ים) עם מאייד בטמפרטורה של 30 ° צ' באמצעות זרם עדין של גז חנקן. אחסן את התמצית יבש ב-20 ° c עד לניתוח LC-MS/MS.
    9. מרכיבים מחדש את שאריות יבשים עם 500 μL של 90% מתנול (aq) ו מערבולת עבור 30 בקבוקון כתום ענבר לפני ניתוח.
  2. באמצעות שיטת רכישה. ברזולוציה גבוהה של ספקטרומטר מסה
    הערה: תנאי LC-MS אופטימיזציה עבור ניתוח MC משמש כאן מפורטים בטבלה של חומרים.
  3. הכן את ה-datafile (s) ויבא לתוך MZmine בעקבות שלבים 1.1 ו-1.2.
  4. בחר את datafiles והפעל את מודולי DFF בעקבות השלבים 2.1-2.2.
  5. עבור ניתוח MC, השתמש בהגדרות הבאות בתוך מודול DFF (איור 3).
    1. זמן השמירה – הקלט את הטווח של 2.00 עד 6.00 דקות.
    2. מקודמן m/z – טווח קלט m/z של 430.00 עד 1200.00.
    3. m/z סובלנות – החל את הסובלנות m/z של 0.01 m/z או 3.0 ppm.
    4. יוני מוצרים אבחוניים (m/z) – קלט m/z של 135.0803, 163.1114 כיוני מוצרים אבחוניים
    5. ערך הרזיה נייטרלי (Da) – קלט 0.0 כדי להגדיר כי לא נעשה שימוש בהפסדים ניטרליים לאבחון.
    6. עוצמת יון אבחונית מינימלית (% בסיס שיא) – שימוש 15.00 כסף האינטנסיביות המינימלי
    7. Peaklist קובץ הפלט – להגדיר את קובץ הפלט כמו putative_MCs. csv.
  6. לחץ על אישור לחצן כדי להפעיל את ניתוח dff. מגרש DFF (איור 4) יופיע על השלמת השלבים לעיל בהצלחה

תוצאות

העלילה DFF שנוצרה לאחר ניתוח של M. aeruginosa CPCC300 מוצג באיור 4. ציר ה-xשל מחלקה זו הוא m/z של היונים המקודרים המביעות את קריטריוני ה-dff המוגדרים כאשר ציר ה- yמציג את ה- m/z של כל יוני המוצרים בתוך ספקטרום ה-mcs ms/ms. עבור ניתוח זה, הקריטריונים של זיהו...

Discussion

DFF היא אסטרטגיה ישר-קדימה ומהירה לזיהוי מחלקות שלמות של תרכובות, רלוונטיות במיוחד עבור גילוי מתחם טבעי מוצר. ההיבט החשוב ביותר של DFF הוא הגדרת קריטריונים ספציפיים MS/MS הפיצול עבור המעמד המיועד של תרכובות. בדוגמה זו, השתמשו ב-DFF כדי לאתר את כל שאריות Adda המכילים מחשבי MCs בתמצית סלולרית של M. aerug...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgements

המחברים מודים הת רושון (מרכז התרבות Phycological הקנדי, אוניברסיטת ווטרלו על מתן התרבות הקיבקקטריה למד וסורסאן אבושרף (אוניברסיטת קרפלטון) לקבלת סיוע טכני.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRECPCC300https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2softwarehttp://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive OrbitrapThermo-Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLCAgilentEquipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 columnAgilent959757-902Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade MethanolFisherA456-4
OptimaLC-MS grade AcetonitrileFisherA955-4
OptimaLC-MS grade WaterFisherW6-4
LC-MS grade Formic AcidFisherA11710X1-AMP
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21Thermo Scientific75-772-436
Other
Amber HPLC vials 2 mL/capsAgilent5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filtersPall Corp.4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filtersSigma-AldrichWHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L)Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mgSigma-AldrichC2786
KNO3, 100 mgSigma-AldrichP8291
NaNO3, 50 mgSigma-AldrichS5022
Na2SO4, 40 mgSigma-AldrichS5640
MgCl2·6H20, 50 mgSigma-AldrichM2393
Sodium glycerophosphate, 100 mgSigma-AldrichG9422
H3BO3, 20 mgSigma-AldrichB6768
Bicine, 500 mgSigma-AldrichRES1151B-B7
P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HOSigma-AldrichE6635
FeCl3 ·6H2OSigma-Aldrich236489
MnCl2·4H2OBaker2540
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
CoCl2·6H2OSigma-AldrichC8661
Na2MoO4·2H2OBaker3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater SolutionSigma-AldrichC3061-500mL

References

  1. Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
  2. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  3. Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
  4. Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
  5. Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
  6. Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
  7. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
  8. Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
  9. Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
  10. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
  11. Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
  12. Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
  13. Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
  14. Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
  15. Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
  16. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  17. Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
  18. Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
  19. Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
  20. Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147MZmineLC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved