ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

Summary

המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.

Abstract

מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.

Introduction

מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול¹. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות^2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת^4,5,6,7,8,9.

קשה להעריך את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האנושית בvivo בשל האילוצים הביואתיים וההגבלות הכלכליות. לדוגמה, ניסויים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם לא ניתן לבצע ללא אישור של מינהל המזון והתרופות, וגיוס מתנדבים הוא יקר. לכן, מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקירות כאלה. עם זאת, השימוש במודלים בעלי חיים מוגבל בשל קומפוזיציות microbiota שונים וגיוון בבעלי חיים לעומת הקהילות הקשורות לאדם. חלופה בשיטת חוץ גופית כדי לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם הבטן היא באמצעות השימוש בניסויים בתרבות האצווה.

הפרפוליסכדים (EPSs) הם prebiotics שתורמים באופן משמעותי לשמירה על בריאות האדם¹⁰. ברור epss כי מורכב של קומפוזיציות חד-סוכר שונים ומבנים יכולים להפגין פונקציות נפרדות. ניתוחים קודמים קבעו את ההרכב של ביף EPSs, אשר הם הנציג הבכיר ממוקד במחקר הנוכחי¹¹. עם זאת, אפקטים מטבוליים המשויכים למארח לא נחשבו ביחס לקומפוזיציה ולגיוון של EPS.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במיקרוביוטה צואה מ -12 מתנדבים להחמיץ את ביף EPSs. כרומטוגרפיה של שכבה דקה (למעלה), 16 s rRNA התפוקה הגבוהה ברצף של הגז, כרומטוגרפיה גז (GC) משמשים בשילוב כדי לחקור את האינטראקציות בין EPSs לבין מיקרוביוטה בטן האדם. יתרונות שונים של פרוטוקול זה בהשוואה לניסויים vivo הם בעלות נמוכה והימנעות של אפקטים מפריעים מחילוף החומרים של המארח. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר במחקרים אחרים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בבטן האדם.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).

1. הכנת חיידקים

1. הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק
   1. שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה של קזאין, 10 גרם/ליטר; soytone, 5 g/L; גלוקוז, 10 g/L; K₂hpo₄, 2.04 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 0.22 g/L; . בסדר. H₂0, 0.05 g/L; המשך, 5 גר'/L; . רצף 80, 1 מ ל תמיסת מלח, 40 mL (CaCl₂.2 h₂O, 0.25 g/L; KH₂פו₄, 1 g/L; נחקו₃, 10 גר'/L; הרוג, 2 גרם/ליטר); ו resazurin, 0.4 mL (2.5 mg/L). להתאים את ה-pH כדי 6.8 עם 2 M NaOH.
   2. אוטוקלב ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר ציר להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) תחת תנאים אנאירובית (10% H₂, 10% CO₂, 80_{% N 2}). הוסף סינון-מעוקר cysteine-HCl (0.5 g/L) ו-mupirocin (5 מ"ג/L) למדיום.
2. להוסיף סדרת מחלקים (50 μl) של הקפואים bifidobacterium לונגום לצינור תרבות עם 5 מ ל של ציר בינוני של bifidobacterium תחת תנאים אנאירובית, אז תרבות בחממה אנאירובית עבור 24 h ב 37 ° c.

2. הכנת משקפיים

1. הכנת בינונית-PYG אגר
   1. שלב את הפעולות הבאות: peptone, 20 g/L; תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר; גלוקוז, 5 g/L; המשך, 0.08 ג'/ל; CaCl₂, 0.008 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 0.008 g/L; K₂hpo₄, 0.04 g/L; KH₂PO₄, 0.04 g/L; נחקו₃, 0.4 ג'/ל; אגר, 12 g/L. להתאים את ה-pH כדי 7.2 באמצעות 10 M NaOH.
   2. אוטוקלב את התקשורת ב 121 ° c עבור 15 דקות וקריר עד ~ 50 ° c. אז, עבור 1 L של בינוני, להוסיף 0.5 mL של מסנן ויטמין K₁ פתרון (1 גרם של ויטמין k₁ מומס 99 mL של 99% אתנול), 5 מ ל של פתרון האמין (0.5 g של האמין הומס 1 מ ל 1 מול/L ' naoh , ואז הביא עד 100 mL עם מים מזוקקים), ו 0.5 g של cysteine-HCl.
   3. לפני שיוצקים את לוחיות PYG, להוסיף מסנן-מעוקר 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl β-D-גלטופאוסייד (X-גל, 0.06 g/L), LiCl · 3H₂O (5.7 g/l) ו-mupirocin (5 מ"ג/l) למדיום.
      הערה: X-Gal ו-LiCl. 3H₂O לאפשר זיהוי של B. longum מושבות על לוחות באמצעות שינויי צבע.
2. מחסן 20 μL של B. longum זנים (שלב 1.2) כדי pyg צלחות ומקום בחממה אנאירובית ב 37 ° c עבור 72 h.
3. לאסוף מושבות חיידקי mucoid מן הצלחות PYG באמצעות סקופ שקילה, ואז לחלוטין להשעות בתוך 10 מ ל של פוספט מאגור מלוחים (PBS) באמצעות מתנד מערבולת.
   הערה: תערובות בקטריאלי ו-EPS צריך להיות מושהה לחלוטין על ידי vortexing או ללטף למעלה ולמטה שוב ושוב עד הסיבים מומס לחלוטין ב-PBS.
4. צנטריפוגה את ההשעיה ב 6,000 x g עבור 5 דקות.
5. העבירו בזהירות את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש וערבבו לגמרי עם שלושה כרכים של קור 99% אתנול על ידי היפוך ומיזוג חוזרות ונשנות.
6. צנטריפוגה את התערובת ב 6,000 x g עבור 5 דקות לחלוטין להסיר את supernatants.
7. הסר את הזרזים מצינורות הצנטריפוגה על ידי גירוד וייבוש של מחלץ EPS לילה באמצעות ואקום מהירות.

3. הכנת מדיום תסיסה

1. הכנת מדיום תרבות בסיסית VI
   1. שלב את הפעולות הבאות: peptone, 3 g/L; טריטונים, 3 גר'/L; תמצית שמרים, 4.5 g/L; mucin, 0.5 g/L; מלחי מרה מס ' 3, 0.4 g/L; המשך, 4.5 ג'/ל; KCl, 2.5 g/L; MgCl₂· 6h₂O, 4.5 g/L; 1 מ ל רצף 80; CaCl₂. 6h₂O, 0.2 g/L; KH₂PO₄, 0.4 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 3.0 g/L; MnCl₂· 4h₂O, 0.32 g/L; FeSO₄· 7h2o, 0.1 g/L; CoSO₄· 7h₂O, 0.18 g/L; CaCl₂· 2h₂O, 0.1 g/L; לאשר את היום₄· 7h₂O, 0.18 g/L; CuSO₄· 5h₂O, 0.01 g/L; ו-NiCl₂· 6h₂O, 0.092 g/L. להתאים את ה-PH כדי 6.5 עם HCl 1 M.
   2. הכן את האמין והציסטנין כפי שנעשה בסעיף 2.1 והוסף לאחר התיקון והצינון.
2. הכן מדיה תרבותית המכילה מקורות פחמן שונים עם מדיית בסיס VI. לפני הפעלה אוטומטית, יש להוסיף 8 גרם/ליטר של סיבי EPS ל-VI הבינוני, הכולל קבוצה VI_Bif. בנוסף, הוסף 8 עמילן g/L ל-VI הבינוני כדי לייצג קבוצה VI_Starch. לבסוף, VI בינונית ללא תוספת של מקור פחמן משמש כפקד (קבוצה VI).
   הערה: אם EPS ו עמילן הם הומס הראשון במים חמים באמצעות מגנטים מגנטיים, ולאחר מכן מעורבב עם הכין מדיום VI.
3. האוטוקלב כל המדיה ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר קריר כדי RT.
4. העבר מדגם משנה (5 מ"ל) של כל בינוני לצינורות תרבות בחממה אנאירובית, ואחסן את המדיה הנותרת ב-4 ° c.

4. הכנה לדגימת צואה של אדם

1. לאסוף דגימות בצואה טרי מיד לאחר הצרכים הטריים מתנדבים בריאים מבוגרים אנושיים באמצעות מכולות צואה, ולאחר מכן להשתמש לקראת הכנה להשתהות.
   הערה: לפני איסוף המדגם, יש להקפיד על כל המתנדבים כדי להבטיח שאין צורך בטיפול באנטיביוטיקה, בפרוביוטיקה או בטיפולים מוקדמים למשך שלושה חודשים לפחות לפני תרומת דגימות. בנוסף, כל התורמים חייבים לספק הסכמה מושכלת, בכתב.
2. העבר מדגם צואה טרי (1 גרם) עד 10 מ"ל של 0.1 M אנאירובית PBS (pH 7.0) לתוך כוסות זכוכית, ואז להשתמש מוטות זכוכית כדי להכין 10% (w/v) ללגום.
3. השתמש במכתש 0.4 מ"מ כדי לסנן את השימוש בצואה. לאחר מכן, השתמש במדגם משנה של המבחנות המסוננות כדי להשתמש בניסויי התסיסה של תרבות האצווה, ואחסן את השארית ב-80 ° צ' לניתוח נוסף.
   הערה: צעדים 4.2 – 4.3 מתנהלים בחדר אנאירובי.

5. תסיסה מחוץ למבחנה

1. הוסף שאיפה מסוננים בצואה (500 μL) למדיום התסיסה שהוכן בשלב 3.2 בתוך חדר אנאירובי, ולאחר מכן דגירה ב 37 ° c.
2. לאסוף 2 מ ל של דגימות מותסס ב 24 h ו 48 h בחדר אנאירובי ולאחר מכן צנטריפוגה מחוץ לחדר ב 6,000 x g עבור 3 דקות.
3. העבירו בקפידה את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש שישמש לניתוח השפלה רב-סוכר וחומצות שומן קצרות (SCFAs) מדידות.
4. לאחסן את צנטריפוגה כדורי ב-80 ° c ולאחר מכן להשתמש להפקת DNA חיידקים גנומית.

6. השפלה EPS על-ידי מיקרוביוטה של צואה אנושית

1. טען 0.2 μL של סופרנטנים מותטים על גבי סיליקה ג'ל מצופה מראש-60 לוחות אלומיניום ולאחר מכן יבש באמצעות מייבש שיער.
2. לפתח את הצלחות 20 מ ל של חומצה פורמית/n-butanol/מים (6:4:1, v:v: v) פתרון יבש באמצעות מייבש שיער.
3. משרים את הצלחות בתוך מגיב orcinol כדי לצבוע, ואז יבש באמצעות מייבש שיער.
   1. להכין orcinol ריאגנטים על ידי המסת 900 מ"ג של Lichenol ב 25 מ ל של מים מזוקקים ולאחר מכן הוספת 375 mL של אתנול. לאחר מכן, חומצה גופרתית מרוכזת צריך להתווסף לאט והפתרון מעורבב ביסודיות.
4. לוחות חום ב120 ° c במשך 3 דקות בתנור אפייה והערכת השפלה של EPS על ידי מדידת להקות האהבה.

7. השפעות EPS על מיקרוביוטה של המעי האנושי

1. הקפא הפשרה דגימות צואה המקורי הכין בשלב 4.3 ודגימות מותסס הכין בשלב 5.4.
2. לחלץ דנ א חיידקי גנומית (gDNA) מכל הדגימות באמצעות שרפרף בקטריאלי גנטי גנומית ערכת החילוץ בעקבות הוראות היצרן.
3. קביעת ריכוזי DNA, integrities, וגודל הפצות באמצעות מיקרו ספקטרוסקופיה ואלקטרופורזה ג'ל אגר.
4. התנהלות ה-PCR של גנים rRNA של בקטריאלי 16 מ-gDNA שחולצו באמצעות הבאים תיאר בעבר והפוך התחל¹²:
   -קדימה פריימר (ברקוד פריימר 338F): הוראות
   -הפוך פריימר (806R): מהפך
   השתמש בתנאי הציקלer התרמיים הבאים:
   1. 94 ° c עבור 5 דקות.
   2. 94 ° c עבור 30 ס מ.
   3. 55 ° c עבור 30 ס מ.
   4. 72 ° c במשך 1 דקות.
   5. חזור על 2 – 4 עבור 35 מחזורים
   6. 72 ° c עבור 5 דקות.
   7. 4 ° c להחזיק עד ההסרה של הציקלאה תרמית.
5. ניהול רצף התפוקה הגבוהה של מוצרי ה-PCR בחברה ברצפי DNA באמצעות התפוקה ברמה גבוהה ביותר מיקרוביאלית הקהילה בדיקות.
6. השיגו רצפים איכותיים ונקיים בעזרת התובנות הכמותיות לניתוח רצף של מיקרוביאלית (QIIME^).
7. הגדרת יחידות מיסוי מבצעיות (OTUs) עבור רצפי הגנים של 16S rRNA עם יותר מ-97% נוקלאוטיד דמיון באמצעות כלים ביואינפורמטיקה כגון חבילת התוכנה של מוארתור¹⁴.
8. בחר רצף מייצג מכל OTU והשתמש במסווג ה-RDP יחד עם מסד הנתונים הטקמי של סילבה כדי לסווג רצפים מייצגים¹⁵.
9. לחשב כיסוי של טוב, מדדים מגוון אלפא (כולל המדד סימפסון ושאנון), ועושר (מספר נצפה של OTUs) באמצעות כלים בביואינפורמטיקה¹⁶.

8. השפעות EPS על הפקת SCFA על ידי מיקרוביוטה המעי האנושי

1. הוסיפו סופרנטנים מותטים (1 מ ל) המוכנים בשלב 5.3 עד 2 מנורות צנטריפוגה.
2. הוסף 0.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטאמזרחנית לכל הדגימות ולערבב ביסודיות את הפתרונות על ידי vortexing.
3. צנטריפוגה את התערובות ב 13,000 x g עבור 20 דקות ולהעביר את supernatants כדי צינורות טריים.
4. במקביל, להכין פתרונות 120 של propionic mM אצטית, בוטירית, איזווטיריק, חומצות ואלאריק ו isobutyric. אז, להוסיף 1 מ ל של כל חומצה מוכנה ל 1.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטורית ולהשתמש כמו קוקטיילים סטנדרטיים.
5. מסננים את הדגימות באמצעות קרום μM 0.22.
6. זיהוי ריכוזי scfa באמצעות כרומטוגרפיה גז ביצועים גבוהים לפי פרוטוקולים שתוארו בעבר^11,17.
   הערה: העמודה InertCap FFAP (0.25 mM x 30 m x 0.25 μM) משמש כרומטוגרפיה גז (GC). ריכוזי SCFA מבוססים לאחר מכן על בסיס אזורי שיא באמצעות שיטת התקן הפנימי של נקודה אחת בחבילת התוכנה של הפתרון GC.

תוצאות

הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה....

Discussion

התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה^19,20. יתר על כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium