אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.

Abstract

ואפופטוזיס תא הוא תהליך טבעי וממלא תפקיד קריטי בפיתוח עובריים, רגולציה הומסטטית, עמידות החיסונית אינדוקציה, ורזולוציה של דלקת. הצטברות של פסולת אפוטוטית בגוף עלולה לגרום לתגובות דלקתיות כרוניות המובילות מחלות אוטואימוניות מערכתית לאורך זמן. . מעורב במגוון מחלות אוטואימוניות סיווג האפוטוטיק הוא תהליך מורכב שנדיר לעתים רחוקות בתנאים פיזיולוגיים. זה כולל קולטני שטח שופע מולקולות איתות. לימוד התהליך של הסיווג התא האפוטוטיק מספק מנגנונים מולקולריים תובנה ותגובות ביולוגיות עוקבות, אשר עשוי להוביל לפיתוח של therapeutics חדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אינדוקציה של thymocytes האפוטוציטים, הכנת מקרופאגים הצפק, וניתוח של הסיווג התא האפוטוטיק על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ. כל התאים יעברו אפופטוזיס בשלב מסוים, ומגורים רבים במחזור התאים יכולים ספיגה של פסולת אפוטוטית. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין את כריכת התא האפוטוטית ובליעה של סוגים רבים של תאים אחרים.

Introduction

הגוף שלנו מייצר 1-10 מיליארד תאי האפוטוטיים על בסיס יומי. מספר גדול של תאים אפוטוטיים חייב להיות מתנקה באופן שהתגובות החיסונית יישארו בשקט. כדי להבטיח את הסיווג של תאים האפוטוטיים בזמן, סוגים רבים של תאים תושב רקמות ותאים מחזורי לפתח מנגנונים לתאי האפוטוטיים מפרץ¹. רגולציה מתפקדת של אפופטוזיס כבר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלות דלקתיות שונות החסינות האוטומטית². אפופטוזיס גם משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של התפתחות הסרטן ההתנגדות הבאה שלה טיפולים קונבנציונליים^3,4. הסרת תאים אפוטוטיים מקדמת בדרך כלל תגובה אנטי דלקתית, אשר עשויה להיות מקושרת לסובלנות החיסונית⁵. הפרעה של הסיווג תא האפוטוטיק כוננים חיסון עצמי תורמת לפיתוח של מחלות אוטואימוניות מערכתית בבני אדם ועכברים⁶.

כאשר התאים עוברים ואפופטוזיס, הם חושפים את הפוספלדיסרין (פטין) מתוך העלון הפנימי אל העלעל החיצוני של הקרום. לאחר מכן יהיה מזוהה על ידי phagocytes באמצעות קולטני פני השטח. למעלה מתריסר קולטנים זוהו לזהות ו/או להקל על הבזלת של תאים אפוטוטיים. באופן כללי, ישנם לפחות שלושה סוגים של קולטני פני השטח המעורבים בסיווג התא האפוטוטית: הקולטנים קולטני, לזהות תאים אפוטוטיים; לדגדג קולטנים, ליזום שתבלע; קולטנים למשגיחים, להקל על התהליך כולו⁷. שיטת הקולטן טאם (TAM RTKs) מורכבת מ- Tyro-3 , Xl, ו- Mer והם מבוטאים בעיקר על ידי תאים מיאלואידים של מערכת החיסון⁸. התפקיד העיקרי של TAM RTKs הוא לשמש קולטנים הקשירה, הקלה על הסרת phagocytic של תאים אפוטוטיים ופסולת. הקבוצה שלנו למדה את הסיווג של התאים טאם בתיווך במסגרת החסינות האוטומטית במשך שנים רבות. הגידול ויטמין K התלוי חלבון מעצר מסוים חלבון 6 (Gas6) וחלבון S (היתרונות) נקשר ומפעיל את קולטני טאם^9,10. Gas6 מופק בלב, הכליות, והריאות. מקצוענים מיוצרים בעיקר בכבד¹¹. TAM מזהה בתאים אפוטוטיים בצורה כזאת, כי N-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לפטין על תא האפוטוטיק ואת C-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לקולטני TAM המעוגן על פני השטח של phagocytes. יחד עם קולטני אחרים, הבזים של תאים אפוטוטיים מתרחש¹². למרות Mer יכול לאגד הן מומחי ליגנדס ו Gas6, מצאנו כי Gas6 מופיע להיות ligands עבור מר בתיווך מקרופאג phagocyציטוזה של תאים אפוטוטיים, אשר ניתן לחסום על ידי נוגדן אנטי מאר¹³. מקרופאגים הם phagocytes מקצועי. סיווג מהיר של תאים אפוטוטיים על ידי מקרופאגים חשוב עיכוב של דלקת ותגובות אוטואימוניות נגד אנטיגנים תאיים. קולטן מר טירולך קינאז הוא קריטי עבור מקרופאג הבזים וסיווג יעיל של תאים אפוטוטיים¹⁴. בטחול העכבר, Mer מבטא בעיקר על אזור שולי מקרופאגים גוף מוחשי¹³.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה בסיסית כדי לגרום אפופטוזיס התא ולהפגין דרכים למדוד את התהליך ואת היעילות של efferocytosis. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות כדי ללמוד efferocytosis על ידי סוגי תאים אחרים בתוך שתבלע של תאים אפוטוטיים של מקורות שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

עכברים ניסיוניים התרבו והחזיקו במושבת העכברים שלנו. כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי.

1. הכנת תימוציטים מותווית של CFSE

1. המתת חסד שני העכברים C57/B6 על ידי CO₂ שאיפת עבור 10 דקות ולנתח כדי לפתוח את חלל החזה, להסיר (למשוך החוצה) את התימוס עם מלקחיים בסדר מעוקל עצה לתוך צלחת התרבות הרקמה פטרי המכיל 10 מ ל של RPMI1640 medium.
2. השג השעיה תא יחיד על ידי שיוף התימוס כולו נגד שני קצוות מזוגג של שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 100 יקרומטר.
3. לאסוף את 10 מ"ל בלוטת התימוס הבולם לתוך צינור 50 mL ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
4. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש ב-40 mL של 1x PBS, וספור מספרי תאים עם הומוציטומטר.
5. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant.
6. השהה מחדש 20 מ ל של 1x PBS בצינור 50 mL כמו תא אחד השעיה עם עד 2 x 10⁸ תאים (אם יותר מ 2 x 10⁸ תאים, להשעות את שאר התאים בעוד 20 מ ל של 1 x PBS ב שונים 50 ml שפופרת).
7. לעשות 5 μM של CFSE בנפח שווה (20 מ ל) של 1x PBS בצינור 50 mL נפרד על ידי pipetting 40 μL של פתרון מלאי CFSE (2.5 mM) לתוך 20 מ ל של 1x PBS ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.
8. הוסף את 20 מ ל CFSE משלב 1.7 לתוך 20 מ ל של השעיית תא משלב 1.6 (הריכוז הסופי של CFSE הוא עכשיו 2.5 μM).
   הערה: עבור כל 20 mL השעיית תא, 20 מ ל של צינור CFSE נדרש.
9. היפוך התא ו CFSE תערובת שפופרת 2-3 פעמים ו דגירה את התערובת בחושך בטמפרטורת החדר עבור מקסימום של 2 דקות, ולאחר מכן להפסיק את התגובה על ידי הוספת 10 מ ל של סרום הסוס חום המופעל.
10. צנטריפוגה את תערובת שפופרת 50 mL ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: אם התיוג CFSE מוצלח, גלולה תא יהיה צהוב בהיר בצבע.
11. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בתא ב 40 mL של 1x PBS וספירת מספרי תאים עם הומוציטומטר.
12. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
13. לשטוף את הגלולה התא שוב עם 40 mL של מדיום RPMI1640.
14. להסיר את supernatant ולהשעות את התאים עם RPMI1640 התרבות רקמות בינונית (RPMI1640, 20 מ"מ HEPES, 10% FBS (חום מופעל), 20 מ"מ גלוטמין, ו-1x עט/דלקת) בריכוז של 7 x 10⁶ תאים/mL בצלחת התרבות 100 מ"מ רקמות.
    הערה: אם מתקבלים תאים נוספים, יהיה צורך בגידול נפרד של מ100 מ"מ ברקמות.
15. הוסף סטרוספורטין לתוך התרבות ההשעיה התא בריכוז הסופי של 1 μM ותרבות עבור 4 h ב 37 ° c בחממה תרבות רקמות שסופקו עם 5% CO₂.

2. הכנת מקרופאגים הצפק

1. הכנס שני עכברים C57B6 (או כל העכברים מניפולציות הגנים במעבדה) intraperitoneally עם 1 mL של 3% בגילאי הזמן לאסוף ביום 0.
2. המתת חסד העכברים ביום 5 כמו בשלב 1.1, לגזור ולקלף לפתוח את עור הבטן אבל לעזוב את צפק ללא פגע. ריקון החלל הצפק על ידי דוחף במהירות 10 מ ל של מאגר כביסה (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA) לתוך חלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ ל מוצמד עם מחט 18 גרם.
3. לאחזר את מאגר לשטוף לאט עם אותו מחט/מזרק, ולאסוף את המאגר לשטוף לתוך צינור 50 mL (פרטים מתייחסים לסעיף מעבדה ג ' ינסן¹⁵).
4. לשטוף את gavage הצפק פעמיים עם ה-PBS 1x, מחדש את מקרופאגים הצפק במדיום תרבות RPMI1640 רקמות בצפיפות של 2 x 10⁶ תאים/mL ו-סדרת מחלקים 500 μl לתוך כל טוב של צלחת 24. השאירו את הצלחת בחממה לתרבית רקמות במשך 2 שעות.
5. להסיר את התאים צף על ידי מתיף והחלפה עם 500 μL של מדיום תרבות טרייה, פעמיים.
6. באופן אופציונלי, להוסיף את המעכב הקולטן של TAM מעכב, RXDX-106, בריכוזים שצוין באגדות דמות לתוך כל טוב של התרבות המקרופאג ו דגירה עבור 2 h אחר.

3. שיתוף תרבות של מקרופאגים הצפק עם האפומוציטים

1. לאסוף thymocytes האפוציטים משלב 1 ולשטוף שלוש פעמים עם RPMI1640 medium. את היעילות של אינדוקציה האפוטוטית ניתן למדוד בשלב זה עם ערכת V/7-עמ ' של אנשין.
2. הפץ 0-12 x 10⁶ תאים (ב 500 μl בינונית) לתוך כל טוב של התרבויות המקרופאג מהפרוטוקול2, על פי הסדר ניסיוני (למשל, ראה איור 1). זה הופך את כל נפח התרבות של 1 mL בכל טוב של הצלחת 24-הבאר. להוסיף את הנוגדן חסימת לתוך התרבות מיד לפני התוספת של thymocytes האפוציטים.
3. התרבות תערובת התאים ב 37 ° c עבור 4 h בחממה תרבות רקמות שסופקו עם 5% CO₂.
4. לשטוף כל היטב של התרבות עם 1x PBS (המכיל 500 μM EDTA) פעמיים כדי להסיר את התאים בחינם צף האפוטוטיים.
5. הכתם את מקרופאגים מאוגדים בצלחת עם CD11b-PE בשלב זה.
   1. לשטוף את הצלחת מקרופאגים מאוגד עם מאגר צביעת (1x PBS, 1% BSA) פעם אחת.
   2. הוסף 200 μL של מאגר כתמים המכיל 2 μL CD11b-PE לתוך כל באר.
   3. מודקת את הצלחת ב 4 ° c עבור 20 דקות.
   4. רוחצים את כל הצלחות בצלחת שלוש פעמים עם מאגר הצביעת.
   5. הוסף 200 μL של מאגר כתמים ולהמשיך את הצלחת עבור ניתוח תמונה תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
6. לחילופין, לנתק את מקרופאגים לוחית הרישוי על ידי הוספת 1 mL של 1% לידוקאין ב-PBS ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c.
7. ניתוק מקרופאגים מאוגדים בצלחת עם ליטוף חוזר.
8. העברת מקרופאג השעיה לתוך בודד 5 מ ל הצינור התחתון FACS מתוך כל טוב של צלחת 24-הבאר.
9. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
10. הסר את הסופרנטאנט והוסף 200 μL של מאגר כתמים המכיל 2 μL של CD11b-PE (1:200 דילול במאגר הצביעת).
11. מודקון התא הבולם במאגר מכתים ב 4 ° צ' עבור 20 דקות.
12. שטוף את ההשעיה של התא פעמיים עם מאגר מכתים.
13. הוסף 200 μL של מאגר כתמים ולהמשיך לניתוח FACS עם cytometer זרימה ולנתח עבור אחוז של מקרופאגים חיוביות CFSE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ניתוח של מקרופאג הצפק-מתווך של האפוטוציטים. מקרופאגים הצפק ותאי האפוטוטיק היו מוכנים ושיתוף תרבותי כפי שמתואר בפרוטוקול. מקרופאגים היו מנותקים ומוכתמים עם הנוגדן PE anti-CD11b באוב עבור 20 דקות על הקרח. מקרופאגים נשטפו לאחר מכן ועובדו באמצעות ציטוטומטר זורם. כפי שנראה, אין CFSE חיובי מקר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אפופטוזיס הוא תהליך שימור מאוד תאים מוות המערבת הרבה אותות מפלי ומשרה ביטוי חלבון, הפרשה, ותחבורה. אפופטוזיס קשורה לעיתים קרובות עם שינויים מורפולוגיה הסלולר¹⁷. תאים אפוטוטיים משחררים ציטוקינים ונוגדנים שמושכים phagocytes כדי לעבור לאתר וליזום את תהליך של שריפת, מסלול מורכב מאוד ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.