סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

Summary

אנו מציגים שיטה מועילה לסינתזה אנזימטית וטיהור של אנאנטימרים ספציפיים ובעלי מגוון רחב של חומצה ארכידונית (AA), חומצה docosahexaenoic (DHA), וחומצה eicosapentaenoic (EPA) עם שימוש של ציטוכרום בקטריאלי אנזים P450 (BM3).

Abstract

האפוקסי מטבוליטים של חומצות שומן רב בלתי רוויות שונות (PUFAs), הנקראת חומצות שומן אפוקסי, יש מגוון רחב של תפקידים בפיזיולוגיה של האדם. אלה מטבוליטים מיוצרים באופן שורש על ידי מחלקת P450 ציטוכרום של אנזימים. בגלל השפעות ביולוגיות מגוונות וחזקות שלהם, יש עניין רב בלמידה אלה מטבוליטים. קביעת התפקידים הייחודיים של מטבוליטים אלה בגוף היא משימה קשה, כמו חומצות שומן אפוקסי יש לקבל תחילה בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוהה. קבלת תרכובות ממקורות טבעיים היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, ו לייף hydrolases מסיסים הידרו במהירות את מטבוליטים. מצד שני, קבלת אלה מטבוליטים באמצעות תגובות כימיות הוא מאוד לא יעיל, בשל הקושי של קבלת regisomers טהור, enantiomers, תשואות נמוכות, ונרחב (ויקר) טיהור. כאן, אנו מציגים סינתזה אנזימטית יעיל של 19 (s), 20 (r)-ו-16 (s), 17 (r)-האפוקסי חומצות (edps) מ-DHA באמצעות אפוקסי עם BM3, אנזים CYP450 חיידקי מבודד במקור ממלוס מקרתגו megaterium (המתבטא בקלות באסאנכיה קולי). אפיון וקביעת טוהר מתבצעים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וספקטרומטר מסה (MS). הליך זה ממחיש את היתרונות של סינתזה אנזימטית של PUFA אפוקסי מטבוליטים, והוא חל על האפוקסי של חומצות שומן אחרות, כולל חומצה ארכידונית (AA) וחומצה eאיסאופנטקאנומית (EPA) כדי לייצר את האפוקסי האנלוגי חומצות (EETs) ומוצרי אפוקסי (EEQs), בהתאמה.

Introduction

כעניין התפקיד כי חומצות שומן רב בלתי רווי (במיוחד אומגה 3 ו אומגה 6 חומצות שומן רב בלתי רווי) לשחק בביולוגיה אנושית גדל בשנים האחרונות, החוקרים הבחינו של מגוון רחב של הטבות מושך כי מטבוליטים שלהם תערוכה. במיוחד, שומן אפוקסי חומצת מטבוליטים המיוצר על ידי מחלקה P450 ציטוכרום של אנזימים היו נקודת גדול של מיקוד. לדוגמה, באפופא רבים, כולל חומצות שונות (eets), חומצות שמנת (edps) וחומצות אפוקסי (eeqs), משחקים תפקיד קריטי בוויסות לחץ הדם ודלקת^1,2 ....... ^, מיכל שלוש ^{, ד , 5}. מעניין, enantiomers ספציפיים ו regioisomers של AA ו-EPA ואפוקסידס ידועים יש השפעות שונות על הצומת^6,7. בעוד ההשפעות הפיזיולוגיות של enantiomers ו regioisomers של EETs ו-EEQs תועדו, מעט ידוע על ההשפעה של חומצות האפוקסי מקבילה ביותר (EDPs) נוצר מ DHA. שימוש נרחב של שמן דגים⁸, אשר עשיר הן EPA ו-DHA, גם עוררה עניין ב-edps⁹. היתרונות של תוספי מזון אלה הם האמינו בחלקו בשל הזרם מטבוליטים DHA (16, 17-EDP ו 19, 20-EDP להיות הנפוץ ביותר) כי ברמות vivo של הקואורדינטות Edp טוב מאוד עם כמות של DHA בדיאטה^10, . בסדר, 11

לימוד המנגנונים והיעדים של חומצות שומן אפוקסי אלה על ידי טבולומיקס, ביולוגיה כימית, ושיטות אחרות הוכיחו מאתגרת, בין השאר כי הם קיימים כתערובות של regio-ו-מערכת סטריאו, ושיטה להשיג כמויות טהורות של המלון מחויב ליחידים ולמבודדים. אמצעים קונבנציונליים לסינתזה תרכובות אלה הוכחו ללא יעילים. שימוש בחומצות הפראוקסיטציה כמו חומצה מטה-כלורמטומית לאפוקסי בעלי חסרונות רבים, ובראשם העדר סלקטיביות, הדורשת טיהור יקר ומדקדק של המוני ואנאנטינים בודדים. סינתזה הכולל של DHA ו-EPA מטבוליטים אפשרי, אבל גם סובל מחסרונות שעושים את זה מעשי סינתזה בקנה מידה גדול כגון עלויות גבוהות תשואה נמוכה^12,13. הייצור הכולל יעיל ניתן להשיג עם סינתזה אנזימטית, כמו תגובות אנזימטיות הם regio-ו סטריאוסלקטיבית¹⁴. מחקרים מראים כי מגוון אנזימטית של AA ו-EPA (עם BM3) הוא שניהם regioselective ו enantioselective^15,16,17,18, אבל הליך זה לא נבדק עם DHA, או על גדול ידה. המטרה הכללית של השיטה שלנו היתה לשנות את היקף ולייעל את האפוקסי כימוזציה זו כדי לייצר במהירות כמויות משמעותיות של חומצות שומן באפוקסי טהור כמו enantiomers הפרט שלהם. באמצעות השיטה המוצגת כאן, החוקרים יש גישה אסטרטגיה פשוטה וחסכונית לסינתזה של EDPs ו-PUFA אחרים אפוקסי מטבוליטים.

Protocol

התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים המפורטים.

1. ביטוי מסוג פראי BM3

1. איחסן pBS-BM3 מDH5α E. coli (תרומה נדיבה של ד ר פ. אן ווקר) ב 5 מ ל של מרק LB סטרילי עם 0.5 מ"ג של אמפיצילין נוסף לתוך שפופרת תרבות 20 מ ל.
2. מודטה את תרבות התא בשייקר ב 37 ° c עבור 24 שעות ב 200 rpm. להוסיף את התרבות לילה המתנע (5 מ ל) ו 100 mg של אמפיצילין L של מרק ליברות סטרילי בבקבוקון פרנבאך או Erlenmeyer אייר. נענעי ב 37 ° צ' עבור 6 h ב 200 סל"ד, ואז ב 30 ° c עבור 18 h ב 200 rpm.
3. איסוף וצנטריפוגה את תרבות התא ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ב 1,000 x g. השמט את הסופרנטנט ואחסן את הגלולה בתא-78 ° צ' עד לטיהור אנזימים.
   הערה: supernatant יכול להיות מעוקר כימית על ידי טיפול עם אקונומיקה או מעוקר באמצעות החיטוי ולאחר מכן נשפך לטמיון.

2. טיהור של BM3.

1. פירוק תאים
   1. הפשרת את הגלולה הסלולרית על הקרח והשעיית מחדש ב-40 מ ל של מאגר מסיסות (4 ° c) של קרח קר (ארבע מעלות צלזיוס) (10 מ"מ טריס, 0.01 מ"מ פנילמתיל פלופקסיל (PMSF;), 0.01 מ"מ EDTA; pH 7.8).
      התראה: PMSF הוא רעיל על ידי מגע.
   2. בעוד בקרח, sonicate את התאים עבור 1 דקות עם הומוגניצר אולטרה סאונד (פלט כוח הגדרת 10, חובת 100%), ואחריו הפסקה 1 דקות על הקרח על מנת lyse את התאים. חזור על הליך זה 6 פעמים. צנטריפוגה את התא ליפוסט ב 4 ° צ' עבור 30 דקות ב 11,000 x g כדי לכלוך תא גלולה.
2. כרומטוגרפיה של אהדה
   1. הכנת עמודה חזקה של חילופי כרומטוגרפיה (ראה טבלת חומרים; קוטר: 2.8 ס"מ x 6 ס"מ, נפח עמודה: 37 mL) על ידי כביסה עם 5 כרכים של עמודות (CV) של מאגר a (10 מ"מ טריס, pH 7.8) ב 4 ° c.
   2. הוסף את התאים הניידים לעמודה מעורפלת ושטוף את העמודה עם 3 קורות חיים של מאגר קר A. Elute the BM3 על ידי שטיפת הטור עם מאגר קר B (10 מ"מ טריס, 600 mM הנאקל, 6 קורות חיים).
   3. לאסוף את שבר משחרלי חום אדמדם. אם החלבון אינו משמש באופן מיידי, ערבב אותו עם נפח שווה של גליצרול והקפאת הבזק עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא ב-78 ° c.

3. אפוקסי של DHA על ידי BM3

1. להכין את התגובה על ידי הוספת 0.308 g (0.940 mmol) של DHA ב 18.8 mL של dimethylsulfoxide (DMSO) כדי 2 L של מאגר התגובה זע (0.12 M אשלגן פוספט, 5 מ"מ MgCl₂, pH 7.4) יחד עם 20 ננומטר של האנזים BM3 הופדיל. ריכוז האנזים ניתן לקבוע על ידי שיטת הדו חד תחמוצת הפחמן/דיתיוונייט¹⁹.
2. בעוד הפתרון הוא זע, להתחיל את התגובה על ידי הוספת 1 שווה ערך ל-NADPH (מופחת בדרך-אגב, מופחתת מלח הטטרנתרן, 0.808 g, 0.940 mmol) הומס מאגר התגובה. מערבבים את התגובה עבור 30 דקות תוך מבעבע אוויר דרך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מוצמד מזרק מחט.
3. באמצעות ספקטרוסקופיה (ראה טבלת חומרים), בדוק את ספיגת תערובת התגובה ב 340 nm כדי לקבוע אם nadph מתרוקן. אם אין ספיגה נוספת המציינת את הצריכה של NADPH, התגובה תושלם.
   הערה: בדרך כלל, התגובה הושלמה לאחר 30 דקות.
4. להרוות את תערובת התגובה על ידי הוספת לאט חומצה אוקסלית 1 M, dropwise, עד pH של הפתרון מגיע 4.

4. הפקת האדפס

1. לחלץ את הפתרון מאגר הקרה עם 2 L של דיאתיל אתר (anהידרוous, ללא תחמוצת) 3 פעמים. לאסוף את שכבת האתר (6 L) ויבש עם מגנזיום אנמים סולפט (MgSO₄).
2. מסננים את MgSO₄ מן הפתרון ולרכז את שכבת האתר מיובש על מאייד רוטרי להניב שאריות edp גסה.
3. לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה עמודה פלאש (מחסנית 40 g סיליקה מספיקה). התחל ב 10% אתיל אצטט (אטואק) ב הקסנס ואת הרמפה עד 60% אטואק ב הקסאנס מעל 22 דקות.
   הערה: שלוש פסגות גדולות מתקבלות ונאספות, משחררי בסדר של 1. לא הגיב DHA; 2. תערובת של איזופ איפולימרים; ו-3. di-לייף (מוצרים נורמליים על חמצון (ראה איור 1)).
4. לשלב את השברים ולמקד אותם על המאדה רוטרי. מדוגמה זו, 0.074 g, (24%) של DHA בלתי מגיב, 0.151 g (47%) של EDP איזוers, ו 0.076 g, (22%) של di-לייף הושגו.

5. הריפיקציה של EDPs, הפרדה של 16 (s), 17 (r)-ו-19 (s), 20 (r)-edps, ו סאפפיקציה של אסטרים

התראה: טרימתיל סיללדימתאן (TMS-diazomane) הוא רעיל מאוד על ידי מגע ואינהלציה. השתמש רק בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי תקין.

1. דלל את האפוקסידות (0.151 g, 0.435 manm) בבקבוקון עם תחתית עגול או בקבוקון קטן עם 2 מ ל של anמתנול ous (MeOH) ו-3 מ ל של אנידראן טולואן, מוסיפים בר-מהומה, ומוסיפים TMS-diazomane (1.2 מקבילות, או 0.26 mL של 2 M פתרון ב hexanes) תחת ארגון.
2. המתן 10 דקות והוסף תוספת TMS-diazomane (0.050 mL) עד שיישאר צבע צהוב חיוור.
3. לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות מאייד רוטרי ולטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש. אליוט עם 4% אטואק בהקסנס (באמצעות טור או מחסנית סיליקה ג'ל 40 g) במשך 22 דקות. בדוגמה זו, 19, 20-EDP מתיל אסתר (0.116 g, 74%) ו 16, 17-EDP מתיל אסתר (0.029 g, 19%), התקבלו כשמנים ברורים (תשואה כוללת, 93%).
4. אספו את השברים המכילים את המוני מתיל EDP מטוהרים. 19 (ים), 20 (ה)-edp מתיל אסתר לראשונה, ואחריו 16 (ים), 17 (r)-edp מתיל אסתר.
5. אם יישארו שברים מעורבים (המכילים גם איזוers; ניתן להעריך על-ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (ועוד) ב-8:1 הקסאן/אטואק ומוכתמת באשלגן פרמנגנט (KMnO₄)), מחדש כרומאטוגרף אותם עם מערכת ממיסים זהה לפני.
6. רכזו את השברים המכילים את היחידות הבודדות.
   הערה: בשלב זה, הזהות והטוהר עשויים להיות מוערך על ידי NMR (באמצעות CDCl₃ כמו הממס; ראה את האגדה עבור איור 2).
7. כדי להמיר בודדים EDP מתיל אסתר regiאוינים כדי צורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP ב THF: מים (כ 0.7 mL/0.1 mmol של אסתר). להוסיף 2 מימית ליהוי (3 מקבילות טוחנת) ומערבבים בן לילה.
   הערה: שלמות התגובה יכולה להיות מוערך על-ידי השימוש ב-3:1 הקסאנס/אטואק, כתמים עם KMnO₄; למוצר יש גורם שמירה של ~ 0.3.
8. להרוות את התגובה לאט עם חומצה פורמית, עד pH של התערובת מגיע 3-4. הוסף מים ו אתיל אצטט (1-2 mL/0.100 mmol של אסתר) ולהפריד את השכבות. לחלץ את שכבת המים עם אטואק (3 x 5 מ ל), לשטוף עם תמיסת מלח רווי ("נמול"), ולייבש את שכבת אטואק מעל נתרן סולפט (Na₂SO₄).
9. רכז את תמיסת אתיל אצטט באמצעות מאייד רוטרי, להוסיף הבעיה (10 mL) ולהתרכז שוב. חזרו פעמיים כדי להסיר את החומצה המיאוטרופית השיורית. לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש, משחררי עם 10-30% אטואק מעל 15 דקות.
10. רכזו את השברים הרצויים ויבשו בתוך הריק כדי לממן את החומצה הטהורה.
    הערה: בשלב זה ניתן להעריך את טוהר enantiomeric (על-ידי כימיית מערכות, עיין באגדות לאיור 3 - איור 4 לעמודה ולתנאים). טוהר כימי יכול להיות מוערך על ידי סי18 (achiral) כרומטוגרפיה (ראה לוח חומרים והתייחסות 14).

תוצאות

כרומאטוגרמה הבזק (מבוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית כפי שמתואר להלן) שהושג על ידי טיהור התערובת הגולמי מתוך מראה של אפוקסי אנזימטי מוצג באיור 1. לאחר הפרדת המוני והפרדה של האריאוינים הטהורים 16 (s), 17 (r)-Edp ו -19 (s), 20 (r)-אסטרים של מתיל edp ...

Discussion

אנו מציגים כאן שיטה פשוטה וחסכונית עבור הכנת שני מטבוליטים אפוקסי השפע ביותר של DHA-19, 20 ו 16, 17-EDP. חומצות שומן אפוקסי אלה ניתן להכין ב enantiopure מאוד (כמו S שלהם , R-איזוers) טופס באמצעות האנזים BM3 סוג פראי. כמה נקודות קריטיות שניתן להשתמש בהם לפתרון בעיות, ואת השלוחה של השיטה שלנו להכנת אפוקסי אנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer