הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

Abstract

תרבות תא העצב העיקרי היא טכניקה חיונית בתחום המוח. כדי לזכות בתובנות מכניסטיות עמוקות יותר במוח, חיוני להיות בעלי מודל מתורבת שניתן לנצל למחקרים שונים בנוירוביולוגיה. למרות התרבויות הראשיות של תא העצב (כלומר, לטווח ארוך בתרבויות ההיפוקמפוס) סיפקו מדענים עם דגמים, הוא עדיין לא מייצג את המורכבות של רשת המוח לחלוטין. בעקבות מגבלות אלה, מודל חדש התפתחה באמצעות נוירוספירות, אשר נושא דמיון קרוב יותר לרקמת המוח. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ציפוי של צפיפות גבוהה ונמוכה של קליפת המוח המעורב ואת הנוירונים היפוקמאל מבודדים מן העובר של היום העובריים 14-16 החולדות של הג דאוד. זה מאפשר את הדור של נוירוספירות ותרבות תא העצב העיקרי לטווח ארוך כמו שתי פלטפורמות עצמאיות לבצע מחקרים נוספים. תהליך זה הוא פשוט מאוד חסכוני, כפי שהוא ממזער מספר שלבים וריאגנטים שנחשבו בעבר חיוני לתרבות העצב. זהו פרוטוקול יציב עם דרישות מינימליות שניתן לבצע עם תוצאות השגה ושימוש נוסף עבור מגוון של מחקרים הקשורים למדעי המוח.

Introduction

המוח הוא מעגל מורכב של תאים עצביים ולא עצביים. במשך שנים, מדענים מנסים. להשיג תובנה במכונות המורכבות האלה כדי לעשות זאת, מדענים נוירו, בתחילה נקטו בקווים שונים של תאי עצב מבוססי העצבים לחקירות. עם זאת, חוסר היכולת של הקווים האלה תא שבטים ליצור קשרים סינפטית חזקים ואקסונים הנכון או דנדטים העבירו עניין מדעי לתרבויות תא העצב העיקרי^1,2. ההיבט המרגש ביותר של תרבות תא העצב העיקרי הוא שזה יוצר הזדמנות להתבונן ולתפעל נוירונים חיים³. כמו-כן, היא מורכבת פחות לעומת רקמת העצבים, מה שהופך אותו למועמד אידיאלי לחקר התפקוד וההובלה של חלבונים עצביים שונים. לאחרונה, מספר התפתחויות בתחומים של מיקרוסקופ, גנומיקה, ו פרוטאומניקס יצרו הזדמנויות חדשות עבור נוירומדענים לנצל את תרבויות תא העצב⁴.

התרבויות הראשיות הרשו לנוירומדענים לחקור את המנגנונים המולקולריים שמאחורי ההתפתחות העצבית, לנתח מסלולים שונים של אותות עצביים, ולפתח הבנה ברורה יותר של synapsis. למרות שמספר שיטות דיווחו על תרבויות מפני הנוירונים הראשוניים (בעיקר ממקור ההיפוקמאל^5,6,7), פרוטוקול אחיד עם מדיום מוגדר כימית המאפשר תרבות ארוכת טווח של נוירונים הוא עדיין צריכים עם זאת, נוירונים מצופה בצפיפות נמוכה מתבוננים בדרך כלל, אשר לא לשרוד לטווח ארוך, כנראה בשל חוסר תמיכה הזנה⁸ כי הוא סיפק את הנוירונים הסמוכים תאים גליה. שיטות מסוימות אפילו הציע co-culturing של הנוירונים העיקריים עם תאים גליה, שבו התאים גליה משמשים כשכבת ממזין⁹. עם זאת, תאים גליה להוות הרבה בעיות עקב צמיחת יתר שלהם, אשר לפעמים לעקוף את הצמיחה עצבי¹⁰. מכאן, בהתחשב בבעיות לעיל, חובה פשוטה וחסכונית יותר הפרוטוקול העיקרי התרבות העצבית נדרשת, אשר ניתן להשתמש הן נוירוביולוגים והן נוירוכימאים לחקירות.

תרבות תא העצב העיקרית היא למעשה צורה של תרבות דו-ממדית ואינה מייצגת את הפלסטיות, השלמות המרחבית, או הטרוגניות של המוח. זה נתן את הצורך במודל תלת-ממד אמין יותר בשם נוירוספירות^11,12. נוירוספירות להציג פלטפורמה רומן מדענים נוירו, עם דמיון קרוב יותר למציאות, במוח vivo¹³. נוירוספירות הם לא מחסיד אשכולות תלת-ממד של תאים עשירים בתאי גזע עצביים (NSCs), בתאי מחולל קדמון (NPCs), נוירונים, ו astrocytes. הם מקור מצוין עבור בידוד של תאי גזע עצביים ותאים מחולל קדמון, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול לתוך שונים עצביים ושאינם עצביים. שוב, השונות בתוך תרבויות נוירוספירה המיוצר באמצעות הפרוטוקולים שדווחו קודם לכן מציג מחסום לניסוח של פרוטוקול נוירוספירה מאוחדת התרבות¹⁴.

כתב יד זה מציג פרוטוקול שבו ניתן ליצור הן 2D ו-3D פלטפורמות על ידי הציפוי תאים מתחלפים משולב של קליפת המוח מעורב היפוקמאל. הוא ציין כי בתוך 7 ימים חופשי-צפה נוירוספירות מתקבלים מפני נוירונים בצפיפות גבוהה מצופה מבודדים מ-E14-E16 ספראג העובר עכברוש דטרלי, אשר על תרבות נוספת, גשרים טופס והתקשרויות באמצעות הרחבות מדומה glial-. באופן דומה, בצפיפות נמוכה מצופה נוירונים, תרבות תא העצב העיקרי שניתן לשמור עד 30 ימים מושגת על ידי שינוי המדיום תחזוקה פעמיים בשבוע.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים של CSIR-הודי מכון לביולוגיה כימית (IICB/AEC/פגישה/אפריל/2018/1).

1. הכנה מגיב ומדיה

1. פתרון ליזין-D (PDL): להכין פתרונות PDL בריכוזים של 0.1 mg/mL במים מוכי ובחנות ב 4 ° צ' עד השימוש.
2. מדיום דיסוציאציה: ל-1 L של מים סטריליים, מסוננים מסונן, לשלב את הרכיבים הבאים בריכוזים המתאימים: נתרן כלוריד (8 מ"ג/mL), אשלגן כלוריד (0.4 mg/mL), אשלגן פוספט חד-בסיסי (0.06 mg/mL), D-גלוקוז (1 מ"ג/mL), נתרן פוספט dibasic (0.479 מ"ג/mL), ו 1 M הפסי [4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה; 10 מ"מ]. מערבולת כל המרכיבים כדי לסייע ערבוב נכון ולאחסן 4 ° צ' עד השימוש.
   הערה: השתמש באמצעי הדיסוציאציה בצורת קרח קר במהלך הדיסוציאציה, אך בטמפרטורת החדר (RT) לכביסה ולמטרות אחרות.
3. ציפוי בינוני: ציפוי בינונית מורכב מהפעולות הבאות: בינוני חיוני מינימלי (הגברת) של נשר עם פתרון מלח מאוזן של ארל (BSS; 88.4%), D-גלוקוז (0.6%), סרום סוסים (10%), ופניצילין/סטרפטומיצין (1%). לשלב את הרכיבים ביחס המתאים ולבצע את ההליך בתוך ברדס תחת תנאים סטריליים.
   הערה: השתמש תמיד במדיום ציפוי טרי כדי למנוע השפלה של כל רכיב.
4. תחזוקה בינונית: להכין את המדיום תחזוקה על ידי שילוב הבאים ביחס המתאים: neurobasal סיס מדיום (97%), 0.5 mM מסחרי מדגם גלוטמין, B27 סרום ללא תשלום (2%), ו פניצילין/סטרפטומיצין (1%). לשלב את הרכיבים ביחס המתאים ולבצע את ההליך בתוך ברדס תחת תנאים סטריליים. ודא כי כל הרכיבים מוכנים טרי.

2. הכנת שמיכות

1. קח בקוטר 12 מ"מ שמיכות זכוכית עגול ולהשרות אותו בחומצה הידרוכלורית 1 M (HCl) עבור 4 h.
2. להעביר את הכיסויים במים מזוקקים באמצעות זוג מלקחיים מערבולת בעדינות כדי להיפטר חומצה לחלוטין.
3. העבר את הכיסויים שנשטפו עבור סיבוב נוסף של ניקוי בגביע המכיל 100% אתנול.
4. לפני השימוש הכיסויים, לייבש אותם היטב במכסה המנוע על ידי שמירה עליהם על נייר טישו.

3. הכנת צלחות פולי-ליזין מצופות לתרבות תא העצב

1. קח 2 24 צלחות טוב: אחד לציפוי בצפיפות גבוהה ואחר ציפוי צפיפות נמוכה. פתח את המנות הסטריליות רק בתוך המכסה המנוע.
2. להעביר את 12 מ"מ של שמיכות זכוכית סטרילי ב 24 לוחות היטב.
3. יוצקים 300 μL של פתרון PDL (0.1 mg/mL במים מוכי) בכל טוב, כך שהוא מכסה באופן מלא את פני השטח של שמיכות.
4. עוטפים את הצלחות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע ייבוש ולשמור אותו ב-CO₂ חממה בלילה.
5. למחרת (לפני ציפוי), מטפי את הפתרון PDL ולשטוף כראוי עם 300 μL של מים מעוקרים סטרילי פעמיים עד שלוש פעמים.
6. הוסיפו 200 μL של מדיום ציפוי טרי והחזר את הצלחות לחממה עד לציפוי.

4. הסרת ועריפת ראשו של העובר

הערה: לעקר את כל כלי הניתוח הארוזים ברדיד אלומיניום ב-121 ° צ' (15 psi) במשך 30 דקות. זה כולל זוג מספריים בוטה-קצה, מלקחיים, מלקחיים עדינים, שני מספריים עדינים, ומלקחיים עורק אחד לכל ההליך כולו.

1. ליצירת נוירונים וכדורים נוירו, השתמש בעכבר בזמן ההריון בזמן הריון ולסמן את היום עם זיהוי תקע הנרתיק כמו E0.
   הערה: יש לבצע את התרבות בין E14-E16.
2. ביום התרבות, מניחים צלחת פטרי זכוכית סטרילית על הקרח ולמלא אותו עם פתרון מלח קר מאוזנת של האנק (HBSS).
3. הE14-E16 עכברוש בהריון עם הזרקה של הצפק (כיתה) של 90 מ"ג קטמין/ק ג של משקל הגוף 10 מ"ג xylazine/ק"ג, ואז להקריב על ידי ביצוע פריקה צוואר הרחם.
   הערה: ניתן לקבל חולדות גם על ידי מנת יתר של פנטוברביטל או מנת יתר של קטמין עם xylazine או דיאזפם.
4. לחטא את הבטן של הסכר על ידי ריסוס 70% אתנול ולעשות חיתוך בצורת V באזור הבטן באמצעות מלקחיים סטרילית וזוג מספריים קהה-קצה.
5. קחו את השקי העובריים בזהירות על צלחת פטרי עם פתרון HBSS קר.
   הערה: אין להשתמש באותם מלקחיים ומספריים ששימשו רק לצורך העור, שכן הדבר יזהם את האברים הפנימיים. השתמש בערכה שונה של מספריים/מלקחיים עבור האיברים הפנימיים.
6. קח את העוברים מתוך השקי העובריים בתוך הHBSS הטרי והקר.
7. . ערוף את ראשו במספריים סטריליים

5. הסרת המוח והניתוח של הקליפה עם ההיפוקמפוס

1. לפני שמתחילים, ממלאים 90 מ"מ מנות פטרי סטרילי, עם HBSS קר וסטרילי.
2. להעביר את הראשים בכלים סטרילי באמצעות מלקחיים ההלבשה סטרילי, בוטה הסתיימה.
3. תחת stereomicroscope, להחזיק את הראש מאזור החוטם עם מלקחיים סטרילי, משונן ולהסיר את המוח על ידי חיתוך העור והגולגולת פתוח.
4. לאסוף את כל המוח העובר באותו אופן בפתרון HBSS.
5. להסיר את כל מקרום המוח מהאונות ומידות על ידי החזקת גזע המוח.
6. להסיר בזהירות את האונות ללא שינוי דמוי פטריות כמוסות המכילות את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח.
7. לאסוף את האונות המכילה את קליפת ההיפוקמפוס בשלמותו בצינור 15 מ ל חרוט המכיל 10 מ ל של מדיום הדיסוציאציה.

6. דיסוציאציה של רקמה קורטיקלית והיפוקמאל לנוירונים בודדים

1. הרשו לרקמות שנאספו להתיישב ולחלק את מדיום הדיסוציאציה, ומשאירים 5%-10% מהמדיום.
2. הוסיפו 10 מ ל של מדיום דיסוציאציה טרייה לרקמה, וחזרו על שלב 6.1 פעמיים.
3. הוסף 4.5 mL של הדיסוציאציה בינונית ו 0.5 mL של 0.25% (1x) טריפסין EDTA (אתילן הטטראצטט) פתרון.
4. שמרו את הרקמה בחממה ב-37 ° c למשך 20 דקות כדי שתהיה העיכול להמשיך.
5. מנושף את המדיום ומוסיף 10 מ ל לדיסוציאציה ולציפוי מדיום ברציפות לרקמות הממעוטות.
6. הרשו לרקמות העיעוטות להתיישב ולהוריד את מדיום הדיסוציאציה. להוסיף 2.5 mL של ציפוי בינוני ולשפוך לתוך הבסיס של 90 מ"מ צלחת סטרילית.
7. Triturate את הרקמות מתעכל בבסיס הפינה של המנה באמצעות טיפ 1,000 μL הצנרת לכבוש את נפח מינימלי.
8. להעביר את ההשעיה התא המתקבל דרך מסננת תא 70 יקרומטר, למעט כל נתחי רקמות.
9. קבע את צפיפות התאים הניתנים לשימוש בשיטת האי-הכללה של הצבע הכחול וספור את מספר התאים במונה תאים אוטומטיים.
   1. עבור טרימין כחול שיטת הדרה, לקחת 10 μL של ההשעיה התא ו 10 μL של 0.4% טרימין כחול כתם, לערבב ביסודיות, ולהוסיף 10 μL של התערובת באחד משני התאים הסגורים של השקופיות קאמרית חד פעמיות.
   2. הכנס את השקופית המכילה את התערובת לתוך מונה התא וקבל את הקריאה.
      הערה: שיטת ההדרה של הצבע הכחול מתבססת על העיקרון שתאים חיים (בשל הקרומים האחרים שלהם) לא יכללו את הצבע הכחול, ומכאן יראו ציטופלסמה ברורים, בהשוואה לתא שאינו בר קיימא, שייקח בקלות להשתלט על הכחול ויופיע כחול ב . בצבע¹⁵
10. לדלל את מספר התאים המתקבלים צלחת 1.5 x 10⁵ תאים/ml עבור צפיפות גבוהה ו 20,000 תאים/mL עבור צפיפות נמוכה בשני צינורות נפרדים המכילים 30 מ ל כל אחד המדיום ציפוי.
11. מנושף את בינונית ציפוי שנוספו בעבר מכל טוב צלחת 500 μL של תאים התפזרו במדיום ציפוי בכל טוב.
12. לאחר מכן להחזיר את הצלחות לחממה ב 37 ° c ו 5% CO₂ עבור 4 h.
13. בדקו את התאים לדבקות מתחת למיקרוסקופ 4 שעות הציפוי.
14. אם יש הדבקות הנכון של התאים בשתי הצלחות, להחליף את המדיום בכל טוב עם 500 μL של תחזוקה ומדיום בינוני טרי ב 37 ° c.
15. תרבות אלה הנוירונים גדלו בצפיפות נמוכה עבור 30 ימים על ידי שינוי המדיום תחזוקה 2x בשבוע.
16. תרבות הנוירוספירות המתקבלות מנוירונים מצופים בצפיפות גבוהה באותו מדיום תחזוקה על ידי העברתם ללוחות המצורפים האולטרה-נמוכים.
17. אפיון הנוירונים והנוירוספירות על-ידי חיסוני מכתים אותם עם סמנים חשובים. עבור האימונוציטוכימיה, ראשית לתקן את התאים/נוירוספירות באמצעות 4% פורמלדהיד עבור 30 דקות על הצלחת עצמה, ולאחר מכן לחלחל את התאים עם 0.1% שאינם יוניים לניקוי עבור 10 דקות.
18. הוסף נוגדנים עיקריים עבור הנוירונים הן (anti-Tuj1, GFAP, O4, טאו) ו נוירוספירות (אנטי Nestin, GFAP, Tuj1) ב פוספט-מלוחים באגירה (PBS) ב 1:300 ריכוזי ו-דגירה לילה ב 4 ° c¹⁶.
    הערה: Tuj1 (השלישי III β-טובולין) ו-הטאו הם סמנים חיוביים עבור הנוירונים העיקריים, בעוד gfap (glial fibrillary חלבון חומצי) ו O4 (אוליגודנדרוציטים סמן) הם סמנים שליליים עבור נוירונים ראשוניים^17,18. במקרה של נוירוספירות, Tuj1, gfap, ו nestin כולם לשמש סמנים חיוביים^19,20.
19. למחרת, לשטוף את התאים עם PBS פעם או פעמיים ולהוסיף נוגדנים משניים המתאים PBS ב 1:600 ריכוזים ב RT עבור 2 h.
    הערה: הנוגדנים המשניים נגד העכבר או נגד הארנב נבחרים בהתאם למינים המארחים של הנוגדן העיקרי הוסיף. יש לזכור כי על הנוגדנים המשניים להיות מצומנת לנגזרות של זריחה המתאימה למטרות המיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
20. שטוף את התאים שוב פעם או פעמיים.
    1. בצע כתמים גרעיניים של התאים עם Hoechst 33258 (1 מ"ג/mL פתרון מניות במים מוהים). הכן 0.1% הפתרון ב-PBS מתוך פתרון המניה ולהוסיף אותו לתאים.
    2. מודיית את התאים עם 0.1% הפתרון עבור 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף שוב עם PBS.
21. הוסף 20 μL PBS (או הרכבה בינונית) בשקופית והבהר באיטיות את הכיסויים המכילים את התאים המוכתמים על אזור השקופית המכילה את ה-PBS. סגרו את שולי הכיסויים בפוליסטירן מוקצף שמנת (DPX).
22. בצע הדמיה של התאים הקבועים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 10x ו-40x.

תוצאות

בפרוטוקול זה הובהר אסטרטגיה פשוטה שבה מתקבלים צפיפות תאים משתנה משתי פלטפורמות שונות של הקרנה עצבית. איור 1A,B ממחיש את הדבקות של תאים לאחר 4 h של ציפוי הנוירונים בתאים גבוהים ומצופים צפיפות נמוכה, בהתאמה. על התבוננות נכונה של הנוירונים כפי שמוצג

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד על ידי שינוי צפיפויות הציפוי של תאים של נוירונים ראשוניים, שני פלטפורמות עצבי משתנה מתקבלים. למרות זאת היא שיטה פשוטה, כל צעד צריך להתבצע בקפדנות כדי להשיג את התוצאות הרצויות. שיטות קודמות אחרות דיווחו על תרביות נוירונים בטווח הארוך או בתרבויות נוירוספירה. רוב הפרוטו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072