ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

Summary

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

Abstract

הערכת טרוגניות פנים-tumoral (ה-i) היא בעלת חשיבות עליונה כדי לצפות כישלון של טיפולים ייעודיים ועיצוב בהתאם אסטרטגיות אנטי סרטניים יעיל. למרות חששות מורמות לעתים קרובות עקב הבדלים בעיבוד לדוגמה עומק של כיסוי, רצף הדור הבא של גידולים מוצקים יש מידה משתנה מאוד של ה-i לאורך סוגי הגידול. לכידת המצב הגנטי בין נגעים ראשוניים לגרורות באמצעות זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים הוא קריטי לעיצוב של טיפולים עבור מחלות שלב מראש. כאן, אנו מדווחים על שיטה לניתוח נגעים השוואתי המאפשר זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים בין דגימות שונות מאותו חולה. הגישה הניסיונית המתוארת כאן משלבת שלוש גישות מבוססות: ניתוח היסטולוגית, הסיקור הגבוה רב הנגעים וניתוחים אימונולוגיים. כדי למזער את ההשפעות על זיהוי של אירועים תת-שבטיים על ידי עיבוד לדוגמה בלתי הולמת, אנו חשופים רקמות כדי להיזהר בדיקה פתולוגית והעשרה תאים הנאופלסטית. בקרת איכות DNA מנגעים נאופלסטיים ורקמות נורמלי היה אז נתון רצף כיסוי גבוה, מיקוד אזורי הקידוד של 409 גנים סרטניים רלוונטיים. בעוד רק מסתכל בחלל גנומית מוגבלת, הגישה שלנו מאפשר להעריך את היקף הטרוגניות בין שינויים סומטיים (יחיד-נוקלאוטיד מוטציות והעתק מספר וריאציות) בנגעים שונים מחולה נתון. באמצעות ניתוח השוואתי של נתוני רצף, הצלחנו להבדיל בין שבטים לעומת שינויים תת-שבטיים. רוב ה-i-a מיוחס לעיתים קרובות למוטציות נוסעים; לכן, השתמשנו גם באימונוהיסטוכימיה כדי לחזות את ההשלכות התפקודיות של מוטציות. בעוד פרוטוקול זה הוחל על סוג הגידול מסוים, אנו מצפים כי המתודולוגיה המתוארת כאן היא ישימה באופן כללי על סוגים אחרים של גידולים מוצקים.

Introduction

הופעתו של רצף הדור הבא (NGS) יש מהפכה הדרך סרטן מאובחנים וטופלו¹. NGS מצמידים ברצף רב אזורי נחשפו מידה גבוהה של טרוגניות פנים-tumoral (ה-i) בגידולים מוצקים², אשר מסביר בחלקו את כישלון של טיפול ממוקד בשל נוכחותם של תת שיבוטים עם רגישות לסמים שונים² . אתגר חשוב הציג על ידי מחקרים הגנום כלל רצף הוא הצורך להבדיל בין הנוסע (כלומר, ניטרלי) ואת הנהג מוטציות בודדים סרטן³. מספר מחקרים אכן הראו כי, בגידולים מסוימים, מוטציות הנוסע חשבון עבור רוב ה-i, בעוד שינויים הנהג נוטים להיות שימור בין נגעים של אותו הפרט⁴. חשוב גם לציין כי הנטל הגדול (כפי שניתן לראות בסרטן הריאות ומלנומה) אינה מרמזת בהכרח על נטל גדול שבטיים משנה². לכן, מידה גבוהה של ה-i ניתן למצוא בגידולים עם נטל ממוכן נמוך.

גרורות אחראים יותר מ 90% של מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם⁵; לכן, לכידת מטרוגניות של גנים של מנהלי התקנים בין נגעים הראשי גרורתי הוא קריטי לעיצוב של טיפולים יעילים עבור מחלות בשלב מתקדם. רצף קליני מבוצע בדרך כלל על חומצות גרעין מרקמות קבועות, אשר מספק הגנום כולו קשה בגלל איכות ה-DNA עני. מצד שני, הכוונה של הרצף הקליני הוא לזהות מוטציות שימושי ו/או מוטציות שעשויות לחזות היענות/היענות למשטר טיפולית נתונה. כפי שהוא עומד, רצף יכול להיות מוגבל לחלק קטן יותר של הגנום בזמן החילוץ של מידע רלוונטי קלינית. המעבר מפרופיל DNA בתפוקה נמוכה (g., רצף Sanger) כדי NGS יש לאפשר לנתח מאות הגנים הרלוונטיים לסרטן בעומק גבוה של כיסוי, אשר מאפשר זיהוי של אירועי שבטים משניים. כאן, אנו מדווחים על שיטה לניתוח נגעים השוואתי המאפשר זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים בין דגימות שונות מאותו אדם. השיטה המתוארת כאן משלבת שלוש גישות מבוססות היטב (ניתוח היסטולוגית, הסיקור גבוה רב נגעים ברצף, וניתוחים immunophenotypic) כדי לחזות את ההשלכות הפונקציונליות של הווריאציות שזוהו. הגישה מתוארת באיור 1 , והיא חלה על המחקר של 5 מקרים גרורתית של נאפילאמים מוצקים (שמות spn) של הלבלב. בעוד אנו מתארים עיבוד וניתוח של פורמאלין קבוע-פרפין מוטבע (FFPE) דגימות רקמה, את ההליך אותו ניתן להחיל על חומר גנטי מרקמות קפוא טרי.

Protocol

החומר ששימש במחקר נאסף תחת פרוטוקול מסוים, אשר אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית. הסכמה מושכלת בכתב מכל המטופלים היתה זמינה.

1. מהדורת היסטולוגית וimmunophenotypical של דגימות רקמה

הערה: פתולוג מומחה אחראי על פעילויות המתוארות להלן.

1. מהדורת היסטראוולוגית של מקרים נבחרים על פי קריטריוני אבחון מבוססים היטב.
   1. השתמש במיקרוטומה כדי לחתוך 4 לחמש יקרומטר מקטעים רקמה עבה מן הנציגה בלוקים של רקמות ffpe ו הר את הסעיפים על שקופיות היסטולוגיה סטנדרטיים.
   2. בצע את המטאוקסילין ואת אאוזין הצביעת עבור כל שקופית באמצעות שקופית אוטומטית של שקופיות רקמה (טבלת חומרים).
   3. סקור את האבחנה histopathological של מקרי הגידול שנבחרו בהתאם לקריטריון האבחון של מי.
      הערה: בשלב זה, הפתולוג עשוי לזהות אזורים ברורים מורפולוגית של הגידול בתוך אותה מחלקת רקמות. ניתן לקצור את האזורים הללו בנפרד (ראו סעיף 2). הדמיון היסטולוגית של הגידול והתאים הנורמליים עבור שמות Spn מסופק באיור 2.
   4. לבצע כתמים אימונוהיסטוכימיה עבור סמנים הוקמה כדי להשלים ניתוח היסטולוגית והערכת immunophenotypic טרוגניות.
      הערה: הפתולוג עשוי לזהות את האזורים הנפרדים immunophenotypically דרך כלל של הגידול בתוך מקטע רקמות זהה. ניתן לקצור את האזורים הללו בנפרד (ראו סעיף 2).
2. הערכת cellularity נאופלסטית של החלק רקמת הגידול ולתכנן מיקרו-ניתוח ידני בהתאם.
   הערה: זוהי הערכה של הפתולוג שנוצר של cellularity הגידול.
   1. אם תוכן התאים הנאופלסטי של מקטע הרקמה גבוה מ-70%, אין הכרחי לחיתוך מיקרוידני; עבור ישירות לשלב 3.1.
      הערה: היעד 70% מתוכן תאי הנאופלסטי על מנת (i) להבטיח רגישות נאותה להערכת תדר אלל מוטציה ו (ii) כדי לאמת מוטציות שבטים על ידי שיטות רגישות פחות (למשל, רצף נימי).
   2. אם תוכן התאים הנאופלסטי של הרקמה נמוך מ-70%, יש צורך בניתוח מיקרו ומעבר לשלב 2.
3. הערכת מקטעי רקמות מבלוק FFPE שבו הרקמה הלא נאופלסטית שנדגמו. רקמה זו משמשת כמקור ל-DNA של germline.
   הערה: דם הוא מקור חלופי של DNA germline. במקרה זה, להמשיך עם חילוץ ה-DNA כהמלצה בהערה של צעד 4.1.
   1. אם רק רקמה לא-נאופלסטית מוצגת בחלק הרקמה (איור 2D), אין צורך בניתוח מיקרו-חיתוך ידני; עבור ישירות לשלב 3.1.
   2. אם זיהום משמעותי מתאים נאופלסטית נמצא בסעיף הרקמה, לאחר מכן הניתוח המיקרו הכרחי; עבור לאזור 2.

2. מיקרוניתוח ידני

הערה: שיטה זו ישימה לסוגים שונים של גידולים מוצקים, והיא נועדה להגביר את תוכן התאים הנאופלסטיים של דגימות רקמות. לחילופין, שיטה זו ניתן להשתמש לקצור מורפולוגית ו/או immunophenotypically דרך כלל אזורים נפרדים בתוך אותה מחלקה רקמות.

1. באמצעות מיקרוטומה, לגזור עד 10 4 לערך 6 למעלה מחלקים רקמת הגידול FFPE עבה ולטעון אותם על שקופיות שלא טעונה.
   הערה: אם רק אחד 1 מ"מ² הקן של תאים סרטניים גלוי בדגימה, 10 שקופיות רקמה צריך להיות גזור ונתון לניתוח מיקרו באופן ידני על מנת להשיג את כמות היעד של ה-DNA (40 ng); זה בהנחה כי 1 מ"מ² אשכול מכיל בין 700 ו 1000 גרעיני הגידול.
2. מודקון שקופיות ב 60 ° c עבור 10 דקות.
3. הצב את השקופיות בארון תקשורת, ובצע את השיטיפות הבאות: קסילן עבור 20 דקות, 100% אתנול במשך 10 דקות, 80% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול עבור 10 דקות, מים מזוקקים עבור 1 דקות, המטאוקסילין כתמים עבור 10 s, ברז מים עבור 1 דקות.
4. במיקרוסקופ הפוך סטנדרטי, להשתמש 27 G מחט על מזרק ככלי מיקרודיסקציה לאסוף אשכולות הנציג של תאים סרטניים. הקציר מינימום של עשרה 1 מ"מ² אשכולות של תאים כדי להבטיח את כמות הנדרש של ה-DNA לרצף.
   הערה: אם אזורים שונים ומורפולוגית מיועדים לניתוח כיישויות שונות, השתמשו בכלי המיקרו-חיתוך כדי לקצור את האזורים הללו בנפרד.
5. מקום אשכולות שנקטפו 1.5 mL (טבלה של חומרים) מילא בעבר עם 20 μl של פרוטאז K ו 180 μl של מאגר לפירוק (טבלת חומרים, שניהם כלולים ערכת החילוץ DNA) ולערבב על ידי vortexing.

3. עיבוד רקמות ללא מיקרודיסקציה מוקדמת

הערה: הליך זה משמש לקוביות רקמה המכילות רק שאינם מנאופלנים תאים (מקור ה-DNA של germline) או להכיל לפחות 70% מתאי סרטן הומוגנית מורפולוגית.

1. באמצעות חיתוך מיקרוטומה עד שישה 4-5 מקטעי רקמה בעובי יקרומטר מקוביות שנבחרו מרקמת ffpe. מגילות רקמות המקום בצינורות 1.5 mL כמתואר בשלב 2.5.

4. הפקת דנ א מתאים נורמליים וניאופלסטיים

1. טיהור דנ א מן הרקמה הרגילה והנאופלסטית באמצעות ערכת ה-DNA FFPE רקמת החילוץ (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
   הערה: כאשר דם משמש כמקור חומצה הגרעין של germline, לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת הפקת דם DNA (טבלת חומרים).
2. כימות דנ א ובדיקת איכות
   1. כדי לכמת את כמות התקועים כפול (dsdna), להוסיף סדרת מחלקים של דגימת ה-DNA לפתרון המכיל כתם חומצת פלורסנט (טבלת חומרים) ולמדוד זריחה הנפלט באמצעות פלואורומטר שולחן הספסל (טבלת חומרים ).
      הערה: השיטה מודדת את עוצמת אות הפלורסנט הנפלטת מצבעי פלורסנט המצורפת ל-dsDNA וקובעת את כמות הדנ א באמצעות עקומת תקן.
   2. השתמש ב-ספקטרוסקופיה מיקרוvolume (טבלת חומרים) כדי למדוד את 260/280 ו 260/230 היחס של המדגם על מנת לאשר את ה-DNA. ה-DNA "טהור" צריך להיות 260/280 של 1.8 ו 260/230 בטווח של 1.8-2.2.
      הערה: הערכה Spectrophotometric של המדגם נועדה לראיה לקיומו של מזהמים כימיים (כגון פנול) המשפיעים על תגובות במורד הזרם. במקרה של זיהום עקב ריאגנטים כימי, לבצע צעד ניקוי באמצעות ערכה מבוססת עמודה.

5. הכנה לספריות וככמת

הערה: תרשים הזרימה הסכימטי של שלבי ההכנה וכימות הספריה מדווח באיור 3.

1. הכנת ספריית ה-DNA (4 בריכות פריימר להגדיר עבור כל דוגמה)
   הערה: 4 הבריכות הפריימר שייכות ללוח הסרטן שדווחו ברשימת חומרים. כל בריכה מכילה זוגות פריימר המיועדים לבחירת יעד מרבב של 409 גנים. קישור לרשימת הגנים ההלחין את הפאנל ngs מסופק ברשימת חומרים.
   1. הכינו ארבע תגובות הגברה למטרה של דנ א עבור כל דוגמה, בריכה אחת לכל תחל. עבור כל בריכה פריימר (הטבלה של חומרים), להוסיף שפופרת 0.2 mL (הטבלה של חומרים): 4 μl של שילוב מאסטר (טבלת חומרים, כלולים בערכת הספרייה), 10 μl של בריכה באיכות גבוהה פריימר לערבב (לוח חומרים, כלולים ב הספריה סרטן הפאנל), ו 6 μL של דנ א (10 ng בסך הכל).
   2. להגביר את אזורי היעד של כל בריכה פריימר בנפרד בארבעה 1.5 מ"ל צינורות פועל את התוכנית הבאה: להחזיק ב 99 ° c עבור 2 דקות (הפעלה של התחלה חם פולימראז), 16 מחזורים (מינימום של 99 ° c עבור 15 s, לספח ולהאריך ב 60 ° c עבור 8 דקות) , המתיני 4 ° c.
      הערה: נקודת עצירה. אחסן תגובות הגברה על היעד ב-4 ° c בלילה או ב-20 ° צ' למשך זמן ארוך יותר.
   3. עיכול חלקי של הגברה מסתיים
      הערה: המדריך שסופק על-ידי ערכת יצרן NGS מראה צעד שבו תגובות הגברה שונות מכל מדגם משולבות לפני עיכול חלקי. הימנע שלב זה ולהמשיך לעבד כל עיכול הגברה בנפרד.
      1. הוסף 2 μL של שילוב עיכול ספציפי (טבלת חומרים, כלולים בערכת הספריה) לכל בריכה מוגברת של כל מדגם (הנפח הכולל של כל שפופרת 0.2 mL הוא 22 μl). מערבולת ביסודיות וצנטריפוגה כל צינור לאסוף טיפות.
      2. העמיסו את הצינורות לתוך הציקלייר התרמי והפעל את התוכנית הבאה: 50 ° c עבור 10 דקות, 55 ° c עבור 10 דקות, 60 ° צ' עבור 20 דקות, 10 ° c להחזיק (עד 1 h).
         הערה: נקודת עצירה. צלחת החנות ב-20 ° צ' לתקופות ארוכות יותר.
   4. מתאמים ליגייט להיגברה וטיהור.
      הערה: השתמש במתאם ברקוד שונה לכל דוגמה בעת סידור ספריות מרובות בשבב יחיד. כל ארבע תגובות הגברה מן המדגם חייב לקבל את אותו ברקוד.
      1. הכנת מתאמים (טבלת חומרים, מתאמי ברקודים ערכת). עבור כל ברקוד X, להכין שילוב של מתאם P1 ומתאמי ברקוד ייחודי (טבלת חומרים) בדילול הסופי של 1:4. מערבבים 4 μL של מים עם 2 μL של מתאם P1 ו 2 μL של מתאמי ברקוד ייחודיים. השתמש 2 μL של שילוב זה של מתאם ברקוד עבור מעברים במורד הזרם.
      2. בצע את תגובת החיבור על ידי הוספת לכל בריכה מוגברת של כל מדגם בסדר זה: 4 μl של פתרון בורר (טבלת חומרים, כלולים בערכת הספריה), 2 μl של מתאם ברקוד לערבב ו 2 μl של DNA ליגאז (טבלת חומרים, כלולים ב ערכת הספריה) (נפח כולל = 30 μL).
      3. מערבולת ביסודיות ובקצרה צנטריפוגה לאסוף טיפות.
      4. העמיסו כל צינור לתוך הציקלייר התרמי והפעל את התוכנית הבאה: 22 ° צ' עבור 30 דקות, 68 ° צ' צלזיוס עבור 5 דקות, 72 ° צ' עבור 5 דקות, 4 ° צלזיוס להחזיק (עד 24 שעות).
         הערה: נקודת עצירה. צלחת החנות ב-20 ° צ' לתקופות ארוכות יותר.
   5. טיהור והגברה של הספרייה
      1. צנטריפוגה כל צינור ולאחר מכן להעביר כל דגימת ברקוד בצינור 1.5 mL. הוסף 45 μL של החרוזים מבוססי מגיב טיהור (טבלת חומרים) לכל בריכה של כל מדגם. Pipet למעלה ולמטה 5x כדי לערבב את ההשעיה חרוז עם ה-DNA.
      2. מודלת את התערובת עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן מניחים כל צינור בארון מגנטי ו דגירה עבור 2 דקות. בזהירות להסיר ולמחוק supernatant מבלי להפריע את הגלולה.
      3. הוסף בכל צינור 150 μL של טריים 70% אתנול. לשטוף את החרוזים הזזת כל הצינורית מצד לצד של שני המיקומים של המגנט. השמט את הסופרנטאנט ושימו לב לא להפריע לגלולה.
      4. לחזור על ההליכים המתוארים בשלב 5.1.5.3 ולאחר מכן לשמור את הצינורות של מגנט האוויר יבש החרוזים ב RT עבור 5 דקות.
      5. הסרת צינורות עם ספריות מטוהרים של כל בריכה פריימר מן המגנט ולהוסיף 50 μL של באיכות גבוהה PCR Mix (טבלת חומרים) ו 2 μl של מיקס הגברה של הספרייה (טבלת חומרים, כלולים בערכת הספרייה) לתוך הגלולה חרוזים של כל צינור.
      6. מערבולת כל 1.5 mL ובקצרה צנטריפוגה לאסוף טיפות.
      7. מקום 1.5 מ"ל צינורות ב מגנט עבור 2 דקות ובזהירות להעביר את supernatant (~ 50 μL) מכל צינור לצינור החדש 0.2 mL מבלי להפריע את הגלולה.
      8. להגביר את הספריות של כל מאגר פריימר שמפעיל את התוכנית הבאה: החזיקו 98 ° c עבור 2 דקות כדי להפעיל את האנזים, 5 מחזורים (הטמפרטורה 98 ° c עבור 15 s, לספח ולהאריך ב 64 ° c 1 דקות), להחזיק 4 ° c. דוגמאות לחנויות ב-20 ° c.
   6. טיהור ספריה מוגברת
      1. צנטריפוגה כל צינור כדי לאסוף את התוכן בתחתית ולהעביר כל מדגם ספריה מוגבר לצינור 1.5 mL.
      2. הוסף 25 μL של החרוזים מבוססי לטיהור הממגיב. Pipet למעלה ולמטה 5x כדי לערבב את ההשעיה חרוז עם ה-DNA.
      3. דגירה את התערובת עבור 5 דקות ב RT, ולאחר מכן למקם צינורות לתוך המגנט עבור 5 דקות.
      4. בזהירות להעביר את supernatant, אשר מכיל את הגברה, מכל צינור לצינורות חדשים מבלי להפריע את הגלולה.
      5. הוסף 60 μL של חרוזים מבוססי טיהור מגיב על supernatant של כל צינור וללטף למעלה ולמטה על מנת לערבב ההשעיה חרוז ו-DNA.
      6. מודאת התערובת עבור 5 דקות ב RT ולאחר מכן למקם את הצינורות של המגנט עבור 3 דקות.
      7. להיפטר supernatant מכל צינור ולשים לב לא להפריע את הגלולה.
         הערה: ההגברה קשורה לחרוזים.
      8. הוסף בכל צינור 150 μL של טריים 70% אתנול. לשטוף את החרוזים מזיז את הצינורות מצד לצד בשתי העמדות של המגנט. השמט את הסופרנטאנט ושימו לב לא להפריע לגלולה.
      9. חזור על ההליך בשלב 5.1.6.8 והאוויר יבש את החרוזים ב RT עבור 3 דקות. הימנע ייבוש מוגזם של החרוזים.
      10. להסיר את הצינורות מן המגנט ולהוסיף 50 μL של תריס נמוך EDTA (TE) (טבלת חומרים, כלולים בערכת הספרייה) לתוך הגלולה כדי לפזר את החרוזים.
      11. Pipet התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים ו-דגירה ב RT עבור 2 דקות.
      12. מניחים את הצינורות במגנט לפחות 2 דקות ובזהירות להעביר את supernatant, אשר מכיל את הגברה, צינורות חדשים מבלי להפריע את החרוזים.
2. קוונפיקציה של הספרייה
   1. השתמש בכלי ניתוח קטע (טבלה של חומרים) כדי להפעיל שבב dna בהתאם לרגישות גבוהה הפרוטוקול ערכת ה-dna.

6. הפעלת האיגוד והרצף של ספריות

1. דלל כל ספריה עד 100 pM עם nuclease-מים ללא תשלום. שלב 10 μL של כל אחת מספריות 100 pM להפעלה יחידה בשפופרת אחת. ערבב את הספריות המשולבות באמצעות ליטוף והמשך לתבניות ולרצף.
2. יצירת הפעלה מתוכננת
   הערה: הפעלה אופיינית כוללת ארבע דגימות שניתן לטעון על שני סוגים שונים של שבב מוליך למחצה (יון PI שבב או Ion 540 שבב) מבוסס על ברצף זמין במעבדה (יון פרוטון מערכת או GeneStudio S5 מערכת, לוח חומרים). מערכות אלה מפיקות בדרך כלל 80,000,000 קריאות בכל הפעלה.
   1. פתח את הדפדפן Torrent על מחשב המחובר למערכת רצף (g., מערכת הצ שף) ולתכנן הפעלה חדשה באמצעות התבנית הכללית עבור היישום הנבחר (הגברה).
   2. . מעבר ל-' קיטים ' של התוכנית בחירת יון מערכת פרוטון או מערכת יון GeneStudio S5 מתוך הרשימה הנפתחת המכשיר מבוסס על מערכת רצף בשימוש.
   3. בהתאם למערכת רצפי הרצף, בחר את השבב המתאים (שבב PI עבור מערכות יון פרוטון; 540 שבב יון GeneStudio S5 מערכות) מתוך הרשימה הנפתחת סוג שבב .
   4. בחר באפשרות ' הגברה ' 2.0 ערכת הספריות ' מהרשימה הנפתחת ' ערכת ספריה '.
   5. בחר את לחצן ה- Ion שף עבור ערכת תבנית, ולאחר מכן בחר את ערכת השף המתאים (יון Pi Hi-Q השף עבור PI שבב או יון 540 Kit-שף עבור 540 שבב) מהרשימה הנפתחת ערכת תבנית .
   6. בחר את ערכת הרצף המתאימה (יון PI Hi-Q רצף 200 Kit עבור שבב PI או Ion S5 ערכת רצף עבור 540 שבב) מהרשימה רצף הרשימה הנפתחת ערכת , ולאחר מכן בחר ionxpress מהרשימה ברקוד להגדיר רשימה נפתחת.
   7. עבור לכרטיסיה plugin ובחר את תוסף ניתוח העיתוד .
   8. עבור לכרטיסיה תוכנית. בחר את הגנום GRCh37/hg19 מתוך הרשימה הנפתחת ספריית ההפניות. מהרשימה הנפתחת ' אזורי יעד ', בחר בלוח המתאים לרצף.
   9. הגדר את מספר הברקודים שיוצגו ברצף ואת התווית של הצינורות לדוגמה של הספריה לשדות המתאימים.
   10. הגדר את שם הברקוד ואת שם הדוגמה עבור כל ספריה.
3. ספריות לדוגמה דילול וטעינה.
   1. לדלל את ספריית המניות עם nuclease-מים חינם עד 25 pM עבור שבב PI או 32 pM עבור 540 שבב.
   2. Pipet 50 μL של כל ספריה מדוללת לתחתית הצינור לדוגמה המתאים הספרייה.
   3. הפעל את מערכת רצף ובצע את ההוראות על המסך כדי לטעון את כל הריאגנטים הדרושים כדי לייבא את תוכנית הריצה.
   4. טען את הצינורית לדוגמה של הספרייה המכילה את הספריות הנמצאות במאגר והתחל תוכנית הגברה.
      הערה: מערכת שף היונים מחייבת שני אסימונים שיהיו מוכנים לכל הפעלה.
4. רצף של יון פרוטון או יון GeneStudio S5.
   1. הפעל את מערכת הרצף ובצע את ההוראות שעל-גבי המסך כדי לאתחל את הרצף ולייבא את תוכנית ההפעלה.
   2. טען את שבב הרצף לאחר הסרתם ממערכת הרצף.
      הערה: להיות מקורקע לפני שאתה להרים שבב כדי למנוע נזק שבב עקב פריקה אלקטרוסטטית. הטיפול בשבבים/מיצוב יחד עם דוגמאות של טעינה מוצלחת/מוצלחת מדווחים באיור 4.
   3. סגור את מכסה תא השבבים והמתן עד שהסמל מצב שבב יציין את המילה "מוכן".
   4. רוקן את מיכל הפסולת לאחר השלמת ההפעלה הראשונה ולאחר מכן רצף את השבב הנותר בהקדם האפשרי.

7. מוטציות ומספרי העתקה וריאציות (CNVs) ניתוח

הערה: יישור נתוני רצף לגנום GRCh37/hg19 ההפניה האנושית מבוצע באופן אוטומטי פעם אחת בתוכנית (שלב 6.2.8).

1. השתמש בפלט ניתוח כיסוי (טבלת חומרים) כדי לוודא עומק של כיסוי ואחידות.
2. בצע את המשתנה הקורא באמצעות תוסף מתקשר למשתנה משתנה (טבלת חומרים), בחירת זרימת העבודה של germline או סומאטיק לפי הצורך.
3. הורד משתנים מסוננים תבנית שיחה משתנה (VCF) קבצים. ביאור משתנים באמצעות התוכנה ' מנבא אפקט משתנה ' (VEP)⁶ ומסד נתונים מוכן ליישום.
4. טען נתונים רצף על התוכנה עיתונאי יון באמצעות כתב הדרך uploader תוסף ולהשתמש בלוח הסרטן המקיף מקיף הגידול בזרימת העבודה כדי לנתח את הנתונים כדי להעריך cnvs.
5. מוטציות מסנן ידני ו CNVs מבוסס על ציונים שהוקצו על ידי התוכנה ולאמת אותם באופן חזותי עם מציג גנומיקה אינטגרטיבית (IGV)⁷.
   1. בחן באופן חזותי את היישור עבור קריאות יוצאות דופן (עקב, למשל, מניעת הגברה או קריאה בצליל רך) שעשוי ליצור שיחות ארטעובאליות.
   2. ודא CNVs על-ידי בדיקת הכיסוי המנורמל עבור כל הגברה על-פני גן נתון כנגד הכיסוי המנורמל של התוכנית הבסיסית.
      הערה: זה מסייע לתקן שיחות שווא בשל התוכנה פילוח, אשר לפעמים קורא CNV מבוסס על כיסוי נורמלי מטריקלי חריגים של מספר הגברה בסוף הגן אחד ובתחילת הגן העוקבים.
6. יצירת אינדקס של מוטציות סומטיים
   1. עבור כל מקרה, מוטציה המדד קורא מתוך רצף של רקמות נורמלי/דם, גידול ראשוני גרורות.
   2. דגל כמו germline ולמחוק את הקריאות כי הם ברור גם מתוך רצף נתונים של DNA germline.
   3. דגל בתור שבטים/מייסד את המוטציות המשותפות בין כל הנגעים של מטופל נתון.
   4. דגל כסאב-שבטיים/תדע המוטציות המזוהים בחלקם, אך לא כל הנגעים של מטופל נתון.

8. אנליזה אימונוהינואומית: אימונוהסטוכימיה לביטוי החלבון הרלבנטי

הערה: אימונוהיסטוכימיה שימש כדי לאמת את ההשלכות הפונקציונליות של חוסר הפעלת מוטציות בגנים מדכא הגידול.

1. באמצעות מיקרוטומה, גזור 3 על 4 יקרומטר עובי רקמות ffpe עבה להר אותם על שקופיות טעונה ושקופיות הדגירה ב 60 ° c עבור 10 דקות.
2. הצב את השקופיות בארון תקשורת, ובצע את השלבים הבאים: קסילן עבור 10 דקות, קסילן עבור 10 דקות, 95% אתנול עבור 4 דקות, 95% אתנול עבור 4 דקות, 70% אתנול עבור 4 דקות, 70% אתנול עבור 4 דקות, מים מזוקקים עבור 4 דקות.
3. לבצע אחזור אנטיגן מבוסס על אינדיקציה של יצרני הנוגדן (טבלת חומרים).
   1. מקם את השקופיות בארון תקשורת עם הפתרון הספציפי לאחזור אנטיגן וטבול באמבט מים בטמפרטורות מתחת לרתיחה.
   2. הסר את השקופיות מן האמבטיה ולהפעיל מי ברז להתקרר עבור 10 דקות.
4. המקום שקופיות בארון תקשורת חדש עם 3% H₂O₂ ב-1x טריס מלוחים באגירה (TBS) עבור 20 דקות ב RT כדי להשבית peroxidases אנדודוגני.
5. מניחים שקופיות בארון תקשורת חדש ורוחצים את 3x עם TBS ו 0.1% של רצף השנה 20 (TBST).
6. השתמש בעט פאפ (טבלה של חומרים) כדי לצייר מעגל הידרופובי סביב רקמת שקופיות רכוב.
7. מניחים את השקופיות בחדר לח ומבצעות חסימה עבור 1 h ב-RT באמצעות 5% סרום (BSA) ב-TBST כפתרון חסימה.
8. דגירה שקופיות עם נוגדניםהראשי (טבלה של חומרים) בתא לח לילה ב 4 ° c. לדלל את הנוגדן העיקרי עם פתרון חסימה כמומלץ.
9. מקם שקופיות בארון תקשורת חדש ושטוף את 3x עם TBST.
10. דגירה שקופיות עם נוגדנים משניים ספציפיים (אנטי-עכבר או אנטי ארנבת) (4-5 טיפות עבור שקופית 1) עבור 30 דקות ב-RT בחדר לח.
11. מניחים שקופיות בארון תקשורת חדש ורוחצים את 3x עם TBST ואחרי מים מזוקקים.
12. הכינו את התמיסה 3, 3 '-diaminobidine (בתוך) תמיסת שטיפה 1 מ ל של מאגר דילול (טבלת חומרים). דגירה שקופיות מקסימום עבור 5 דקות בדיקה מתחת למיקרוסקופ.
13. השתמש בפקד חיובי כדי לחשב את זמן הדגירה על ידי ביצוע התפתחות התגובה מתחת למיקרוסקופ.
    הערה: כל נוגדן זקוק לזמן דגירה ספציפי.
14. לא פעיל (הפסק משקעים של כרומוגן) על-ידי שקופיות מיזוג במים מזוקקים.
15. כתמים משקפים על ידי הערכת אותם בארון תקשורת חדש עם המטאוקסילין עבור 10 s ולאחר מכן לשטוף עם מים ברז.
16. הצב את השקופיות בארון תקשורת, ובצע את השלבים הבאים: 70% אתנול עבור 4 דקות, 70% אתנול עבור 4 דקות, 95% אתנול עבור 4 דקות, 95% אתנול עבור 4 דקות, קסילן עבור 10 דקות, קסילן עבור 10 דקות.
17. שקופיות חותם לשים כמה טיפות של בינונית הרכבה (טבלה של חומרים) על כל שקופית רקמות לכסות עם שמיכות.
18. לחץ על ללחוץ על שמיכות כדי להעביר עודפי בועות בינונית ואוויר הרחק מן הרקמה והחוצה מתוך coverslip ואוויר יבש.
19. הערכה וציון מכתים תוצאות תחת מיקרוסקופ הפוך עם פתולוג מומחה.
    הערה: מערכת הניקוד תהיה תלויה באנטיגנים הספציפיים, שייתכן שהמידע בספרות כבר קיים. אם המידע אינו זמין בספרות, להפיק מערכת הבקיע באמצעות ביטוי של אנטיגן ברקמה נורמלית כהפניה.

תוצאות

תהליך המחקר מומחש באיור 1. Multi-נגעים (n = 13) רצף של 5 מקרי SPN מיקוד רצפי קידוד של 409 סרטן הקשורות הגנים זיהה סך של 27 מוטציות סומטיים ב 8 גנים (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, ו- FGFR3). מוטציות הוגדרו כמייסד/שבטים כאשר משותף בין כל הנגעים של חולה נתונה, ?...

Discussion

השיטה שלנו מאפשרת זיהוי של שינויים מולקולריים מעורב התקדמות של גידולים מוצקים באמצעות שילוב של נתונים אנכיים (כלומר, מורפולוגיה, רצפי DNA, ו אימונוהיסטוכימיה) מפני נגעים שונים של מטופל נתון. הדגמנו את היכולת של השיטה שלנו כדי לזהות אירועי שבטים ושבטים משניים בסוג הגידול השקט מודגש (כלומר, SPN...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit	Fisher Scientific	NC9959336	Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4627	Library quantification
Anti-BAP1	Santa Cruz Biotechnology	sc-28383	Antibody
Anti-GLUT1	Thermo Scientific	RB-9052	Antibody
Anti-KDM6A	Cell Signaling	#33510	Antibody
Anti-p53	Novocastra	NCL-L-p53-DO7	Antibody
Anti-βcatenin	Sigma-Aldrich	C7207	Antibody
Blocking Solution	home made	-	5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution	home made	-	3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra	Leica	70937891	Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	AR9961	Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	AR9640	EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear	Eppendorf	951010006	Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021	Tubes
Ethanol	DIAPATH	A0123	IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H­4000	Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Laboratories	SK­4105	HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7401­50	Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7402­50	Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV)	Broad Institute	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel	Thermofisher Scientific	4477685	Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermofisher Scientific	4480441	Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument	Thermofisher Scientific	4484177	Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip	Thermofisher Scientific	A26771 or A27766	Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef	Thermofisher Scientific	A27198 or A30011	Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit	Thermofisher Scientific	A26433 or A30011	Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System	Thermofisher Scientific	4476610 or A38196	Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair	Thermofisher Scientific	4487118	Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin	Thermofisher Scientific	4487118	Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit	Thermofisher Scientific	4474517	Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermofisher Scientific	ND-2000	DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Fisher Scientific	12532-016 or 12532-024	SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Quiagen	51106 0r 51104	DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue	Quiagen	56404	DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermofisher Scientific	Q32866	DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermofisher Scientific	Q32850	Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST	home made	-	Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film	Sakura Europe	6172	Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software	EMBI-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres	Carlo Erba	492306	IHC deparaffinization reagent