הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

Summary

פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי הסימולטני של מינים חמצן תגובתי (ROS), תאים חיים, ותאים מתים בתרבויות הראשיות חי מפני העכבר משטח העינית תאים. 2 ', 7 '-diלורופלוט אצטט, propidium יודיד, וכתמים הופסט משמשים כדי להעריך את רוס, תאים מתים, ותאים חיים, בהתאמה, ואחריו הדמיה וניתוח.

Abstract

משטח העינית נתון לבלאי רגיל ולקריעה בשל גורמים סביבתיים שונים. חשיפה לקרינת UV-C מהווה סיכון בריאותי תעסוקתי. כאן, אנו להדגים את החשיפה של תאי גזע ראשוני מן העכבר העינית משטח לקרינת UV-C. מינים חמצן תגובתי (ROS) היווצרות היא הבדיקה של היקף לחץ חמצוני/נזק. ב ניסיוני בקביעת חוץ גופית, זה חיוני גם כדי להעריך את אחוז התאים המתים שנוצרו עקב לחץ חמצוני. במאמר זה, אנו נדגים את 2 ', 7 '-Diלורוofluorescl (DCFDA) כתמים של UV-C חשוף העכבר הראשי משטח העינים הפנים בתאי גזע ואת הקוונפיקציה שלהם מבוסס על תמונות פלורסנט של DCFDA כתמים. DCFDA מכתים ישירות מתאים לדור ROS. אנו גם להדגים את הקוונפיקציה של תאים מתים וחיים על ידי מכתים בו זמנית עם propidium יודיד (PI) ו Hoechst 3332 בהתאמה ואת אחוז DCFDA (ROS חיוביים) ו PI חיובי תאים.

Introduction

המשטח העינית (OS) היא יחידה תפקודית המורכבת בעיקר של השכבה החיצונית epithelia של קרנית, בלוטת la, בלוטת מייבואן, לחמית, חלק משולי מכסה העין ו innervations שינוי אותות¹. שכבת הקרנית בצורת הכיפה השקופה מתמקדת באור על הרשתית. זו רקמה נמק העצם מורכב מרכיבים סלולריים כגון תאים אפיתל, keratocytes, ותאי האנדותל ורכיבים acellular כגון קולגן ו גליקוזנוגליקנים². האזור מנוקז על ידי דמעות כי גם לספק את רוב החומרים המזינים. המיקום האנטומי של מערכת ההפעלה מאלץ אותו להיות במגע ישיר עם הסביבה החיצונית, לעתים קרובות חושף אותו לרכיבים קשים שונים כגון אור בוהק, חיידקים, חלקיקי אבק וכימיקלים. גורם זה מקדם את מערכת ההפעלה לפציעות פיזיות והופך אותו לנוטה למחלות שונות.

מתח חמצוני נגרמת בשל הdisequilibrium בין הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואת נוגדי חמצון מנגנוני ההגנה האנדודוגני³. ROS מסווגים מולקולות תגובתי ורדיקלים חופשיים, שניהם נגזרים מחמצן מולקולרי (O₂) באמצעות זרחון חמצוני מיטוכונדרילציה⁴. הקבוצה הקודמת מורכבת ממינים לא רדיקלים כגון מי חמצן (H₂o₂), סינגתן חמצן (¹o₂) והשני כולל מינים כגון סופראוקסיד אניונים (O₂^-), ו רדיקלים הידרוקסיל (^•או), בין היתר. מולקולות אלה הן על ידי-מוצרים של תהליכים סלולריים נורמליים התפקידים שלהם היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיות חשוב כגון התמרה אותות, ביטוי גנים, והגנה מארחים⁵. ייצור משופר של ROS ידוע להיווצר בתגובה לגורמים כגון הפלישה הפתוגן, xenobiotics, וחשיפה אולטרה סגול (UV) קרינה⁴. זה ייצור יתר של ROS תוצאות לחץ חמצוני שמוביל לנזק של מולקולות כגון חומצות גרעין, חלבונים, ושומנים⁶.

אור השמש הטבעי, המקור השולט ביותר של קרינת UV, מורכב UV-A (400 – 320 nm), UV-B (320 – 290 nm), ו-UV-C (290 – 200 ננומטר)⁷. דווח על קורלציה הפיכה בין אורך הגל לבין האנרגיות הספקטרליות. למרות קרינה UV-C טבעי נספג על ידי האטמוספירה, מקורות מלאכותיים כגון מנורות כספית ומכשירי ריתוך פולטים, ולכן, מהווים סיכון מקצועי. תסמינים של חשיפה לעיניים כוללים פוטוקרטיטיס ו פוטוקראטודלקת הלחמית⁸. הפקה של ROS הוא אחד המנגנונים העיקריים של גרימת נזק לתאי UV המושרה⁹. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את הזיהוי של ROS באמצעות 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFDA) הצביעת שיטה העכבר הראשי משטח עינית העין/תאי גזע חשופים UV-C. הזריחה הירוקה נתפסה. בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט תאים היו מוכתם נגד שני צבעים, Hoechst 33342 ו אדום propidium יודיד, כדי להכתים את התאים חי ומת, בהתאמה.

Protocol

הניסוי בוצע על התאים העינית העיקרי/תאי גזע נגזר עין העכבר השוויצרי לבקן. השימוש בבעלי חיים למסיק העיניים לניסוי זה אושר על ידי הוועדה המוסדית של בעלי החיים המוסדיים, Yenepoya (הנחשבת לאוניברסיטה) (מספר אישור IEAC, 6a/19.10.2016).

1. ההכנות של ריאגנטים

הערה: הנגזרת של תאים ראשוניים/תאי גזע ממשטח העינית של העכבר הוא מעבר לטווח של פרוטוקול זה. מכאן, אנו מדגימים את מינונים החשיפה UV-C, הכנה מגיב להערכת ROS, תאים חיים ומתים הכמת שלהם. נא להפנות לטבלה 1 עבור הכרכים המתאימים של ריאגנטים (10% סרום בפרה העוברי, Dcfda, Hoechst ו propidium יודידה פתרונות מניות להתווסף להשגת פתרון הצביעת הסופי).

1. להכין פתרון מניות של 10 מ"מ מילימטר DCFDA על ידי המסת 25 מ"ג של אבקת DCFDA ב 5.13 mL של DMSO. Aliquot 250 μL כל אחד בצבע ענבר 1.5 mL וחנות ב-20 ° c.
2. הכנת פתרון מניות של 10 מ"ג/mL (16.23 mM פתרון) Hoechst 33342 על ידי המסת התוכן כולו של 25 מ"ג בקבוקון ב 2.5 mL של מים מוהים. להפוך ali, ts של 100 μL בצינורות מיקרוצנטריפוגה בצבע ענבר ולאחסן ב 2-6 ° צ' עבור עד 6 חודשים. לאחסון ארוך טווח, חנות ב-20 ° c.
3. הכנת פתרון מניות של 1 מ"ג/mL propidium יודיד במים מיוהים, סדרת מחלקים 1 mL כל אחד בצבע ענבר 1.5 ml, ולאחסן ב 4 ° c.

2. ציפוי תאים וקרינת UV-C

1. לפני ציפוי, לנתק את העכבר העיקרי העין תאים העין מבודדים במעבדה שלנו (תוצאות שלא פורסמו; תאים כאלה הם תערובת של אפיתל הקרנית, מסטרומה תאים ו keratocytes) באמצעות סוכן הדיסוציאציה של התא עדין (טבלת חומרים).
2. צלחת 0.2 x 10⁶ משטח העכבר הראשי העינית תאים ב 35 mm 0.2% מרתף קרום מטריצות מטריקס מצופה תאים מנות התרבות 2.5 mL של מדיה שלמה. המלון משלב בין לילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5_{% ומחולל} חממה.
   הערה: מדיה מלאה עבור תאים ראשוניים של culturing מפני השטח העינית של העכבר מורכב גלוקוז גבוה המכיל 20% FBS, 1% עט-דלקת, 1% גלוטמקס, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% נתרן פירובט, ו 0.1% β-mercaptoethanol.
3. לפני חשיפת התאים למינונים שונים של UV-C, למחוק את הנפח המרבי של מדיה ולאפשר רק שכבה דקה של מדיה (~ 500 μL) כדי להישאר בקשר עם התאים, רק מספיק כדי לכסות אותם.
4. קח את הכלים, אחד בכל פעם אל המקור/תא UV-C (החדר התחתון של תנור הכלאה/מקשר צלב UV; טבלה של חומרים). מניחים את הצלחת לתוך החדר ולהסיר את המכסה של המנה. מיקום המכסה הפתוח של המנה מבטיח כי התאים יקבלו את המינון UV-C המקסימלי במהלך החשיפה UV-C.
5. לחשוף את התאים ציונים שונים/מינונים של UV-C: 1 J/m², 100j/m², 1,000 j/m² ו 10,000 J/m².
6. לאחר החשיפה UV-C, להחליף את המכסה של כל אחד מהמנות מיד ולהסיר אותם מהתא מקור UV-C.
7. הביאו את כל הכלים למכסה האוויר המבינארי ולמעלה כל אחת מהמנות עם 2 מ ל של מדיה טרייה מלאה.
8. מודאת התאים במשך 3 שעות בחממה 37 ° c ושות₂ . שלוש שעות של הדגירה לאחר החשיפה UV-C הוא אופטימלי להמחיש ולכמת את ההשפעות המוקדמות.

3. הכנת מדיה לצביעת תאים בשידור חי

1. הכינו את מדיית הצביעת טרי במהלך 15 הדקות האחרונות של 3 שעות הדגירה של התא הפוסט UV-C חשיפה.
2. טרום חם 10 מ ל של מדיה הצביעת המכיל 10% FBS-DMEM שיושלם עם 1% עט-דלקת עד 37 ° c.
3. הוסף 5 μL של 10 מ"מ מילימטר DCFDA; 5 μL של 10 מ"ג/mL הפתרון וה200 μL של 1 מ"ג/mL propidium יודיד. ריכוזי הסופי של DCFDA, Hoechst ו-PI הם 5 μM, 5 μg/mL ו -20 μg/mL, בהתאמה, ב 10 מ ל של צביעת מדיה.

4. DCFDA כתמים של UV-C חשופים העכבר הראשי העינית

1. לאחר 3 שעות של דגירה של UV-C חשופים העכבר הראשי בתאי העינית במינונים שונים, מרוב המדיה של 35 mm מנות.
2. לחדש עם 2 מ ל של המוכן מחדש DCFDA לצביעת כל הכלים בעדינות מהצדדים.
3. דגירה את התאים עם מדיה הצביעת עבור 15 דקות בחושך בתוך 37 מעלות צלזיוס ° c₂ בחממה לצביעת תא חי.

5. צפייה של DCFDA (ROS), הופסט ו-PI תאים ויטראז '

1. לאחר השלמת הדגירה, למחוק את המדיה הצביעת.
2. הוסף מדיה מלאה טרי לתאים ולהתבונן התאים תחת מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה/תא צמידה (טבלת חומרים). צלם את השדות הרצויים: שדה בהיר, זריחה כחולה, זריחה אדומה, זריחה ירוקה.
   הערה: התאים הכחולים ויטראז ' כחול הם גרעינים, הזריחה הירוקה היא עבור התאים מייצרים ROS ואת הזריחה אדום מציין את PI חיובי תאים מתים.

6. הכמת של תאים מוכתמים (הושע-כחול, PI-מת וירוק-רוס) באמצעות טכניקות דימות

1. לייצא את התמונות שנתפסו תחת מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה/תא צמידה כדי imagej עבור כימות.
2. פתח כל אחד מהתמונות בכל פעם, באמצעות כל ערוץ (כלומר, כחול (גרעינים/הואכסט), ירוק (רוס), אדום (מת/PI חיובי)) ברצף, לספירה. התחל מהפקד שלא נחשף באופן רציף לעבור 1, 100, 1,000 ו 10,000 J/m^-2.
3. ספירת התאים באמצעות כלי ספירת התאים המסומנים כצלב בתפריט התוכנה עבור כל אחד מהשדות [כחול חיובי (hoechst חיובי; גרעינים), אדום חיובי (PI חיובי; תאים מתים); ירוק חיובי (רוס)] בכל אחת מהתמונות המתאימות לכל אחד מ טיפולים.
4. ספירה על-ידי לחיצה על כל אחד מהאותות הספציפיים בכל אחד מהשדות. לדוגמה, לחיצה על הגרעינים הכחולים/Hoechst ויטראז ' תעניק את המספר הכולל של גרעינים בשדה נתון.
5. לחשב את התוצאות כאחוז של מוות התאים על ידי נזק UV (מספר תאים חיוביים של PI x 100 מחולק על ידי מספר תאים חיוביים hoechst) ואת אחוז הייצור של רוס על ידי נזק UV (מספר של dcfda התאים החיוביים x 100 מחולק על ידי מספר תאים חיוביים הואכסט).

תוצאות

DCFDA הוא צבע חסר צבע כי הוא צורה כימית מופחתת של fluorescein המשמש כאינדיקטור לגילוי ROS בתאים. צבע זה מקבל לכוד בתוך תאים והוא תחמוצת בקלות כדי פלורסנט diכלור דיהידרוטסטוסטרון (DCF), אשר פולט זריחה ירוקה. ניתן לזהות את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. התאים יכולים להיות דמיינו ומתואם ...

Discussion

The DCFDA הצביעת השיטה המתוארת כאן מאפשר ויזואליזציה של ROS בתוך העכבר הראשי העינית לחיות תאים מטופלים עם קרינת UV-C. היתרון של שיטה זו מכתים הוא גם מאפשר לחוקרים ללמוד את ההשפעות המיידיות של UV-C (3 שעות לאחר חשיפה UVC) על התאים החיים ואת הספירה הסימולטני שלהם עבור אחוז של ROS חיובי, כמו גם, תאים מתים. ית...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad