הדור של מלנומה האדם Uveal האנושי פלטפורמת Xהשתל בעכברים חיסוני

Summary

אורתופון האדם גרורות הכבד uveal מלנומה מבע מודלים העכבר נוצרו באמצעות שיטות כירורגי אורתוקפית עם קטע הגידול המטופל נגזר וטכניקות הזרקת מחט עם הגוף האנושי תרבותי שורות מלנומה.

Abstract

בעשורים האחרונים, תת-עורי מושתל החולה הנגזר גידולים מבע או שורות התאים האנושיים האדם מוכר יותר ויותר כמודלים מייצגים יותר ללמוד סרטן האדם עכברים חיסוני מאשר תא אנושי מסורתי הוקמה קווי מבחנה לאחרונה, אורתולמריחה על החולה מושתל הגידול מבע (pdx) מודלים בעכברים פותחו כדי לשכפל יותר תכונות של גידולים החולה. הכבד אורתובסיס מודל העכבר מקבל השתל צפוי להיות פלטפורמת מחקר שימושי לסרטן, מתן תובנות לתוך ביולוגיה של הגידול וטיפול בסמים. אולם, השתלת הגידול אורתוטופית מסובכת בדרך כלל. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים שלנו עבור השתלת הנושא האורתודפית של החולה-נגזר הכבד-מלנומה וגרורתית גידולים בסרטן. אנחנו מתורבתים האדם מתורבת uveal מלנומה מסרטן קווי לתוך עכברים חיסוני. הפרוטוקולים יכולים לגרום בעקביות שיעורי הצלחה טכנית גבוהה באמצעות טכניקה השרשה כירורגית אורתודופית עם נתחי החולה הנגזר מלנומה סרטן או טכניקה הזרקת מחט עם קו הגוף האנושי מתורבת. אנו גם לתאר פרוטוקולים עבור סריקת CT כדי לזהות גידולים בכבד הפנים לבין טכניקות מחדש השרשה באמצעות גידולים קריואופרשמורות כדי להשיג מחדש. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים פלטפורמה טובה יותר עבור מודלים של העכבר הגידול אורתופפית של מלנומה גרורתית בכבד במחקר טרנסלtional.

Introduction

מלנומה uveal היא הגידול הנפוץ ביותר התוך העינית ממאיר בקרב מבוגרים בעולם המערבי. במהלך 50 השנים האחרונות, השכיחות של מלנומה uveal (5.1 מקרים למיליון) נשאר יציב בארצות הברית^1,2. מלנומה uveal נובע מלנוציטים ב איריס, גוף סיליארי, או choroid, וזה מחלה קטלנית ביותר כאשר הוא מפתח גרורות. שיעור התמותה של חולים עם גרורות מלנומה uveal היה 80% בשנה 1 ו 92% ב 2 שנים לאחר האבחנה הראשונית של גרורות. הזמן בין האבחנה של גרורות ומוות הוא בדרך כלל קצר, פחות מ 6 חודשים, בלי להתייחס לטיפול^3,4. הסרטן מתפשט דרך הדם ונוטה להיות גרורות נגד הכבד (89-93%)^4,5. מודל העכבר האפקטיבי הוא הצורך בדחיפות לחקירה נוספת של מלנומה הכבד-גרורתי מסרטן. עבור מחקר translational, יש דרישה ברורה כדי ליצור מודל העכבר מלנומה גרורתית מסרטן הכבד uveal.

החולה-נגזר הגידול מבע (pdx) מודלים העכבר צפויים לספק אסטרטגיות תרופות מותאמת אישית. מודלים אלה עשויים להיות ניבוי של תוצאות קליניות, להיות שימושי עבור הערכת תרופות טרום קלינית, ולשמש למחקרים ביולוגיים של גידולים⁶. הנציג pdx מודלים הם למריחה על הגידול עכברים מבע, אשר יש גידול באתרים תת עורית. רוב החוקרים יכולים לעשות ניתוח להשתלה תת עורית ללא אימון מיוחד^7,8. הם יכולים גם לפקח על גידולים תת עורית בקלות. למרות מודלים PDX תת עורית הפך פופולרי בשלב המחקר, יש להם כמה מכשולים במעבר לשימוש מעשי. השרשה תת-עורית כוחות החולה-נגזר גידולים לתוך מיקרופט בסביבה שונה ממקור הגידול, כך שהוא מוביל לכשל בתיאום וצמיחה איטית הגידול ^{9,10,11, .12,13,14} אורתופפית מהווה גישה אידיאלית ורציונלית לדגם pdx, משום שהוא משתמש באותו איבר כמו הגידול המקורי^15,16.

לאחרונה, פיתחנו פרוטוקולים עבור טכניקות השרשה כירורגי השתלת החולה-נגזר בכבד-מלנומה בסרטן ושיטות הזרקת מחט טכניקות עם הגוף האנושי-גרורתי בכבד האדם מלנומה ומסרטן קו בהנהון. Cg-prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/szj (nsg) עכברים^17,18. הפרוטוקולים כתוצאה בעקביות שיעורי הצלחה טכנית גבוהה. כמו כן הקמנו CT סריקת טכניקות שימושיות כדי לזהות גידולים בכבד הפנים, ופיתחנו מחדש השרשה של גידולים בתוך פלטפורמת PDX. מצאנו כי uveal מלנומה גידול מודלים מבע לשמור על המאפיינים של גידול בכבד החולה המקורי, כולל תכונות histopathological ומולקולרית שלהם. יחד, טכניקות אלה מספקים פלטפורמה טובה יותר עבור מודלים הגידול הכבד הנושא עבור מלנומה uveal במחקר טרנסלtional.

Protocol

חולים הרשומים במחקר צריך לספק הסכמה בכתב המאפשר את השימוש של דגימות כירורגי שנמחקו למטרות מחקר ומחקרים גנטיים, על פי הלוח סקירה מוסדית מאושר פרוטוקול. פרוטוקול זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים של המוסדות הלאומיים לבריאות ומאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC).

1. אוסף של מטופל טרי- רקמת הגידול נגזר

1. השג רקמת סרטן נגזר החולה מהניתוח או ביופסיה מחט בחדר הניתוח של בית החולים.
2. לשים את רקמת הגידול במיכל 100 mL המכיל הנקס ' מאוזן תמיסת מלח (HBSS) פתרון על קרח.
3. להעביר את הרקמה לתוך מכסה סטרילי (Biosafety טיחות רמה 2) במעבדה.
4. . המשך לשלב 2 בהקדם האפשרי
   הערה: מטעמי בטיחות, לא לכלול חולים עם HIV ידוע או צהבת B או C זיהומים.

2. עיבוד של מטופל טרי-רקמת הגידול נגזר

1. שים את הרקמה בשפופרת 50 mL המכילה מלוחים מואגור פוספט (PBS) על קרח. כדי לשטוף את הרקמה, להוסיף PBS בצינור ולהיפטר PBS מהצינור פעמיים.
2. העבירו את הרקמה לצלוחית פטרי המכילה PBS על הקרח.
3. באמצעות מלקחיים ומספריים סטרילי, להסיר את החלקים נמק של הרקמה. השאר את הרקמה לחה וקרה במהלך השלבים 2.3 עד 2.5. עבור דגימות ביופסיה מחט, לדלג על צעד 2.3 ו 2.5, ואל תחתוך את הדגימות.
   הערה: רקמת הנקרוטיק מתפרקת לעתים קרובות בקלות כאשר היא נוגעת.
4. חותכים את הרקמה לתוך 1 מ"מ³ קוביות עבור השתלת כבד כירורגי.
5. חותכים את שאר הרקמה לקוביות של 2 מ"מ בצלחת פטרי.
6. להעביר אותם 1.7 מ"מ microtube עם 4% פורמלין ניתוח היסטולוגית לצינור אחר עבור הניתוח גנומית ופרוטמית אחרת.
7. שימו את המיקרוצינוריות בצנצנת חנקן נוזלי עם חנקן נוזלי. העבר את הצינורות ל-80 מקפיא ° c לאחסון קבוע.
   הערה: הזמן בין הסרת לדוגמה של המטופל ועיבוד רקמות לא יעלה על 30 דקות.

3. השתלת כבד כירורגי עם החולה-רקמת הגידול נגזר

1. רסס את כל החפצים שמגיעים לשכונה לניתוח עם 70% אתיל אלכוהול.
   הערה: הדבר כולל כלי ניתוח, רפידות חימום ומכונות הרדמה.
2. למדוד את המשקל של ספוגית כותנה סדין בד.
3. באמצעות הצבת אותו בחדר האינדוקציה, יש להניח עכבר עם 3 – 5% מכשיר אידוי.
4. לאחר העכבר מורדם לחלוטין, למקם אותו במיקום פרקדן על כרית חימום. הניחו את הקונוס של העכבר על חוטם העכברים כדי לשאוף 1.5 – 3% איזוofלשמירה על ההרדמה.
   הערה: העכבר צריך להיות על כרית החימום במהלך ההליך כולו. היעדר חימום עלול לגרום להיפותרמיה.
5. לאשר הרדמה נכונה על ידי תגובה לא כאשר הרגל של העכבר הוא נדקר עם מלקחיים ultrafine.
6. הכנס בופרנורפין (0.6 מ"ג/ק"ג) תת-עורי על הצלע באמצעות מחט של 27 גרם על מזרק מיקרו לפני הניתוח.
7. החל 70% אתיל אלכוהול לבטן ופזר את הפרווה כלפי מעלה וכלפי מטה. לאחר הפצת הפרווה, לאשר הדמיה קלה יותר של העור מתחת לאזור subcostal שמאל לחיתוך קל יותר. אל תגלח את הפרווה מהבטן.
   הערה: הפרווה תסתיר את האתר החתך לאחר הניתוח ולמנוע את העכבר מגרד את הפעולה לאחר החתך. עם זאת, אתה יכול לגלח את הפרווה כדי למנוע זיהום של אתר החתך בהתאם לסטנדרטים מוסדיים.
8. למרוח יוד ולתת לו להיקלט לתוך העור.
9. מניחים לעטוף כירורגי סטרילי עם חור 2 ס מ על העכבר.
10. מתיחת עור הבטן עם מלקחיים מעוקל ultrafine ולעשות 1 ס מ רוחב רוחבי שמאל חתך העור עם מספריים מעוקלים.
11. הכנס את קצה המספריים העקומים מתחת לעור החתך ופתח אותם מעט כדי להפריד את הצפק מהעור. למשוך את המספריים מן החתך עם להבים סגורים.
    הערה: פתיחה וסגירה של מספריים בתוך העכבר יכול לגרום לנזק ודימום.
12. . תאתר את הכבד מתחת לצפק אשר צבע אדמדם כהה דרך צפק.
13. עם מספריים עקומים, לעשות חתך רוחב 1 ס מ בצפק. אם עורק הצפק מדמם מהקצה החדשני, מייד לעצור את הדימום עם הקאטרי.
14. לתפוס רקמת שומן באמצעות מלקחיים מעוקל ultrafine עם יד אחת, להכניס את הקצה של מספוגית כותנה מתחת האונה השמאלית הכבד לגלגל את הספוגית כלפי מטה עם היד השנייה כדי להוציא את הכבד.
    הערה: רקמת שומן תופס חשוב לשמור על רקמת השומן לדבוק ספוגית כותנה.
15. לנקות את הכבד על משטח הכותנה ולהניח את הכבד על גיליון בד סופג שאינו ארוג.
    הערה: הסדין בד משחק שני תפקידים חיוניים בייצוב הכבד וקליטת דימום.
16. לעשות חתך 5 מ"מ ברוחב ועומק באמצעות להב סטרילי No. 11 אזמל ליצור כיס בתוך הכימומה בזמן לחיצה בעדינות על אתר החתך עם ספוגית כותנה.
    1. הכנס את הלהב במקביל עם פני השטח של הכבד לחתוך אופקית.
    2. לחצו על החתך עם משטח כותנה כדי לעצור שטף דם.
       הערה: אין לשמור על הלהב אנכית, אחרת תוכלו לפרוץ את הכבד ולפגוע בכלים גדולים באמצע הכבד.
17. לגלגל את משטח הכותנה כלפי מעלה כדי לפתוח את האתר החתך והשתל 1 מ"מ³ קוביה של רקמת הגידול לתוך הכיס עם מלקחיים באולטרסאונד מעוקל. למשוך את מלקחיים תוך כדי לגלגל את הכותנה בסיבוב הפוך לוחץ למטה.
    הערה: לחיצה על האתר החתך עם ספוגית כותנה תוך כדי לעצור את מלקחיים מסייע למנוע עקירה של הגידול בתוך הכיס.
18. בעדינות לקחת את הכותנה לנקות את האתר החתך לאחר השרשה. . המשך לשלב 3.19 בהקדם האפשרי
19. שימו השמת שנספג. באתר החתך
20. . תאשר הומוסטזיס אם הדימום ממשיך, הוסיפו. עוד הדימומים באתר החתך
21. לקלף את הכבד את הסדין בד עם מלקחיים (רצוי קהה-הסתיים) ולשים את הכבד בחזרה לחלל הבטן.
22. תפר צפק עם ליגטורה כפולה באמצעות תפר שנספג 5-0.
23. תפר עור עם ליגטורה משולשת באמצעות תפר 5-0.
    הערה: הקשירה המשולשת מסייעת. למנוע חתך ניתוחי
24. להתבונן בעכבר עד הערה לגמרי ולשים אותו בחזרה בכלוב.
25. למדוד את המשקל של הספוגית כותנה ואת הסדין בד עם דם על הנפח דימום במהלך הניתוח. להשוות אותם עם משקולות המקורי שלהם לפני הניתוח. להפחית את הדימום במהלך הניתוח פחות מ 10% של במחזור נפח הדם בעכבר.

4. איסוף ועיבוד של מתורבת שורה של הכבד האנושי מסרטן קו מלנומה

1. הכן תאים מתורבתים.
2. אסוף תאים וחשב את מספר התא באמצעות מונה תאים.
3. הכן כמות מתאימה של השעיית תאים עבור 10.0 x 10⁶ תאים בשפופרת של 15 מ ל.
4. ספין הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר.
5. הסר את הסופרנטנט. בצינור 15 מ ל תשאיר את הגלולה הסלולרית. בתחתית השפופרת
6. הוסף 50 μL של RPMI 1640 בינונית לתוך שפופרת של 1.7 mL.
7. גזור את הקצה של קצה 200 μL עם מספריים כדי להגדיל את פתיחת הקצה.
8. הוסף 60 μL של מטריצת קרום המרתף באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך לתוך הצינור 1.7 mL כי יש RPMI.
9. לערבב RPMI ומטריצה בצינור 1.7 mL. . מערבולת את זה
10. הוסף 110 μL של התערובת לתוך הגלולה התא בצינור 15 מ"ל. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חדש 1.7 mL.
11. שמור את השפופרת על הקרח לפני הזרקת המחט.

5. השתלת מחט כירורגית של מתורבת לכבד האדם מסרטן מלנומה קו לתוך הכבד

1. בצע את הפרוטוקול הנ ל משלבים 3.1 עד 3.15.
2. לאסוף את ההשעיה התא עם מיקרומזרק עם המחט 27 G.
3. הכנס את המחט לאורך המשטח של הכבד ולקדם את קצה המחט 5 מ"מ עמוק יותר.
4. הכנס 20 μL של תא הבולם לתוך הכבד.
5. לצרוב את נקודת ההכנסה של הכבד כדי למנוע את התאים מוזרק דולף החוצה. . תאשר הומוסטזיס
6. בצע את הפרוטוקול הנ ל משלבים 3.21 עד 3.24.

6. סריקת CT

1. מניחים את העכבר לתוך הרסן במצב ער.
2. נגב את הזנב עם כרית אלכוהול סטרילית לחיטוי והסנה.
3. הכנס 100 μL של סוכן ניגודיות CT דרך הווריד הזנב עם מחט של 27 גרם על מזרק 1 מ ל.
4. המתן 4 שעות לאחר ההזרקה לפני נטילת סריקת CT.
   הערה: זה לוקח 4 שעות עד שהסוכן. נלקח מתאי הכבד
5. ארבע שעות לאחר ההזרקה, מורדם את העכבר נושאת הגידול עם 3 – 5% מתאדה isofלאנה על ידי הצבת אותו בחדר אינדוקציה.
6. ברגע שהעכבר מורדם לגמרי, הצב אותו בתנוחה הנוטה ב-CT. מניחים את החרוט על החרטום של העכבר כדי לשאוף 1.5 – 3% isoffor תחזוקה של הרדמה.
7. לאשר הרדמה נכונה על ידי תגובה לא כאשר הרגל של העכבר הוא נדקר עם מלקחיים ultrafine.
8. . תעשה סריקת סי. טי. במשך 15 דקות
9. ודא כי העכבר עד שהוא התעורר במלואו לאחר סריקת ה-CT והחזר אותו לכלוב.
10. הערכה לקיומו של הגידול ולמדוד את גודל הגידול על תמונות CT.
    הערה: הסוכן ניגודיות מגביר את הכבד הרגיל מכימומה, כך שקל לזהות גידול בלתי משופר. לא לפרש את הכיס המרה ואת הבטן כמו גידול.

7. קציר ועיבוד רקמות

1. עכברים המתת חסד באמצעות CO₂ ואחריו פריקה צוואר הרחם על ידי הצבת אצבע המפתח ואת האגודל מאחורי הגולגולת ומושך את הגוף על ידי בסיס הזנב. . המשך לשלב 7.2 בהקדם האפשרי
2. מניחים את העכבר במצב פרקדן ולרסס את הבטן עם 70% אתיל אלכוהול.
3. השתמש מלקחיים סטרילי מספריים סטרילי לעשות חתך רוחבי 3 ס מ מתחת לתהליך xiphoid לחשוף את איברי הבטן.
4. בלו את רקמת הגידול ולבצע שלבים 2.1 כדי 2.2.
5. חותכים את שאר הגידול לתוך 2 מילימטר קוביות בצלחת פטרי.
6. להעביר אותם צינור הקפאה עם cryomedium עבור השרשה מחדש לאחר הקפאת ההזמנה.
7. שימו את הצינורות במיכל הקפאה מקפיא מלא באיזופנול.
8. העבירו את המכולה למקפיא של 80 ° c לאחסון זמני. לא לשים את הקריוצינורות עם cryomedium ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי. להקפיא אותם לאט בקצב קירור של 1 ° צ'/מינימום כדי לשמר את רקמת הגידול.
9. ביום למחרת, להעביר את הצינורות לתוך מיכל חנקן נוזלי עבור אחסון קבוע.

8. השרשה מחדש

1. לשמור על הצינורות קפואים צנצנת חנקן נוזלי עם חנקן נוזלי עד מוכן רקמת השתל. מזער את חשיפת הרקמה לטמפרטורת החדר כדי לשמור על יכולת הקיום ולשפר את סיכויי החרט.
2. הפשרת שפופרת הקפאה באמבט מים ב37 ° c.
3. בצע את שלבים 2.2 – 2.4.
4. שתל את הגידול המושתל לתוך עכברים כמתואר בשלבים 3.1 – 3.24.

תוצאות

השתלת כירורגית אורתוטופית באמצעות שיטת כיס הכבד יכולה להשתיל גידול מלנומה גרורתית של הכבד האנושי לתוך הכבד של העכבר עם שיעור הצלחה גבוהה של 80% בתוך שישה חודשים. הגידול של מבע מעפיב הכבד כגידול בודד ללא נודולים בת (איור 1 ואיור 3a). ההזרקה כיר...

Discussion

הדגמים הנוכחיים של מודלים של השתל הנוכחי הינם עתירי עבודה, זמן רב, ויקרים ליצירה. אורתובנושא הגידול מבע מודלים עכבר לסרטן הכבד הוקמו לפני יותר משני עשורים^19,20,21. עם זאת, טכניקה זו היא מסובכת ודורשת שימוש בציוד מיוחד, כגון בעל מחט מיקרו ו 6-0 כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent)	Miltenyl Biotec	130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium	Corning	21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver			All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane	Purdue Products	67618-150-17
Isopropanol	Fisher scientific	A416-1	Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC	BD	354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Lab	5557	4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium	Corning	21-031-CM
RPMI 1640	Corning	10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Nice-Pak products	B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	Wako	163-20145
70% Ethyl alcohol solution	Fisher Scientific	04-355-122
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Absorbable hemostat	Johnson and Johnson	63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery	Bovie Medical	MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container	NALGENE	5100-0001
Cryotube	SARSTEDT	72.379
Curved scissors	World Precision Instruments	503247
Curved ultrafine forceps	World Precision Instruments	501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister	Harvard Apparatus	600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer	Artisan Scientific	66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar	Thermo Fisher Scientific	2123
Micro-CT scan	Siemens
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood			Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel	AD Surgical	A300-11-0
Straight forceps	World Precision Instruments	14226
Surgical drape
Tail vein restrainer	Braintree Scientific	TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle	BD	309623
1.7 mL tube	Bioexpress	C-3260-1
5-0 PDO Suture	AD Surgical	S-D518R13
15 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9152N
27 G needle	BD	780301
27 G needle	Hamilton	7803-01
50 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9502N
50 µL micro syringe	BD	80630
50 µL micro syringe	Hamilton	7655-01
100 mL container	Fisher Scientific	12594997
200μL tip