מודל מורנה של השפעה בקליפת המוח הנשלטת על אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור האינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית מורמין באמצעות ראש פתוח השפעה בקליפת המוח.

Abstract

הערכת המרכז לבקרת מחלות ומניעת פציעה שכמעט 2,000,000 אנשים סובלים מפגיעה מוחית טראומטית (TBI) מדי שנה בארצות הברית. למעשה, TBI הוא גורם תורם ליותר משליש מכל התמותה הקשורה לפציעה. עם זאת, המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים העומדים בבסיס הפתופסולוגיה של TBI מובנים בצורה גרועה. כך, מודלים טרום קלינית של TBI מסוגל לשכפל את מנגנוני הפציעה הרלוונטיים TBI בחולים אנושיים הם צורך מחקר קריטי. מודל ההשפעה הקורטיקלית הנשלטת (CCI) של TBI מנצל מכשיר מכני כדי להשפיע ישירות על קליפת המוח החשופה. בעוד מודל לא יכול למלא את דפוסי הפציעה שונים ואת הטבע הטרוגנית של TBI בחולים אנושיים, CCI מסוגל לגרימת מגוון רחב של TBI קלינית ישימה. יתר על כן, CCI הוא מתוקננת בקלות ומאפשר לחוקרים להשוות תוצאות על פני ניסויים, כמו גם על פני קבוצות חקירה. הפרוטוקול הבא הוא תיאור מפורט של החלת CCI חמור עם מכשיר מסחרי זמין להשפיע במודל murine של TBI.

Introduction

המרכזים לבקרת מחלות ומניעת פגיעה מעריכים כי כ-2,000,000 אמריקנים מקיימים פגיעה מוחית טראומטית (tbi) מדי שנה^1,2. למעשה, tbi תורמת מעל 30% ממקרי המוות הקשורים בארצות הברית עם עלויות בריאות מתקרבים $80,000,000,000 בשנה וכמעט $4,000,000 לאדם בשנה ששרדו tbi חמור^3,4,5. ההשפעה של TBI מודגשת על ידי לטווח ארוך משמעותי נוירוקוגניטיבי הסיבוכים הנוירופסיכיאטריים שסבלו על ידי ניצולי עם התחלתה חתרני של התנהגות, קוגניטיבית, וליקויים מוטוריים הנקרא כרונית טראומטית אנצפלופתיה (CTE) מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן ,} בן שמונה ^, מיכל בן ^{10 , 10}. אפילו אירועים משניים של זעזוע-מוח-השפעות אלו שאינן מובילות לתופעות הקליניות — יכולות להוביל לתפקוד לקוי של נוירוג'יק בלתי ממושך^11,12.

מודלים בעלי חיים לחקר TBI המועסקים מאז סוף 1800 של¹³. בשנות ה-80 פותחה בשנת 1980 שחקן פניאומטי למטרת דוגמנות TBI. שיטה זו מכונה כעת השפעה מבוקרת הקורטיקלית (CCI)¹⁴. השליטה והתוכסות של CCI הובילו חוקרים להתאים את המודל לשימוש במכרסמים¹⁵. המעבדה שלנו משתמשת במודל זה כדי לגרום tbi באמצעות impactor חקן זמין מסחרית ואלקטרונית מכשיר הגשמה^16,17. מודל זה מסוגל לייצר מגוון רחב של מצבי TBI הישימים קלינית בהתאם לפרמטרים הביומכאני שבשימוש. הערכה היסטולוגית של מוחות TBI לאחר פציעה חמורה הנגרמת במעבדה שלנו מדגים משמעותי ביותר הקליפת המוח הקורטיתית ואובדן היפוקמאל, כמו גם בצקת מועלת צלעות ועיוות. בנוסף, CCI מייצרת ליקוי עקבית בתפקוד המוטורי והקוגניטיבית כפי שנמדד על ידי בחני התנהגותית מספר¹⁸. המגבלות של CCI כוללות את הצורך בפתיחת הגולגולת ועל הוצאות הרכישה של המכשיר המעורר.

מספר דגמים נוספים של tbi קיימים והם מבוססים היטב בספרות כולל מודל כלי ההקשה של נוזל לרוחב, מודל ירידה במשקל, ופציעה הפיצוץ דגם^19,20,21. בעוד כל אחד מדגמים אלה יש יתרונות ברורים שלהם החסרונות העיקריים שלהם הם פציעה מעורבת, תמותה גבוהה וחוסר סטנדרטיזציה, בהתאמה²². יתרה מזאת, אף אחד מדגמים אלה אינו מציע את הדיוק, הדיוק והתוכסות של CCI. על ידי התאמת הפרמטרים הביומכאני לתוך המכשיר האקטואלי, מודל CCI מאפשר לחוקר שליטה מדויקת על גודל הפציעה, עומק הפציעה, ואנרגיה קינטית המוחלת על המוח. זה נותן לחוקרים את היכולת ליישם את כל הספקטרום של TBI לאזורים ספציפיים במוח. זה גם מתיר את האפשרות הגדולה ביותר מניסוי להתנסות.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן. C57BL/6 העכברים נרכשו מהמעבדה ג'קסון קבוצה שוכנו במתקן מחסום במרכז לרפואה השוואתית באוניברסיטת נורת'ווסטרן (שיקגו, IL). כל החיות שוכנו ב 12/12 h מחזור אור/כהה עם גישה חופשית למזון ולמים.

1. לגרום הרדמה

1. להזריקו את העכבר עם קטמין (125 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) מוזרק intraperitoneally.

2. שלטים חיוניים מפקחים על כל 15 דקות

1. מוניטור הטמפרטורה, קצב הנשימה, וצבע העור. העכבר צריך להרגיש חם למגע. העור אמור להופיע ורוד ומלא. קצב הנשימה נע בין 50 ל-70 נשימות לדקה.

3. הליכים טרום כירורגי

1. שוקלים את כל העכברים ביום לפני הפגיעה האינדוקציה.
2. לעקר קבוצה אחת של כלי ניתוח על ידי אוטוקלינג עבור כל נושא ניסיוני. חטא את המכשיר הנוגע להשפיע לפני השימוש.
3. הכינו כלוב התאוששות על ידי הצבת כלוב נקי על כרית חימום חשמלי להגדיר "נמוך" הגדרה ממוקם בצורה כזאת, כי העכברים יכולים להתרחק החום פעם אמבולטורי.
4. הגדר את התיאטרון התפעולי בתוך כיסוי למינארי של זרימה מחוטאת.
   1. הצב את מסגרת ההפעלה הסטריאוטקאית.
   2. חברו את המכשיר הנוגע לה, למסגרת הסטריאוטקאית.
   3. הגדר את המכשיר האקטולי עם הפרמטרים הביומכאני הרצוי עבור מהירות וזמן להתעכב.
      הערה: בפרוטוקול זה מתוארת פגיעה מוחית חמורה באמצעות השפעה בקוטר 3 מ"מ באמצעות כריתת גולגולת בקוטר 5 מ"מ עם המהירות שנקבעה ב-2.5 מ מ וזמן משכון של 0.1 s. ניתן להשתמש במגוון רחב של פרמטרים ביומכאני כדי לזרז את הספקטרום המלא של TBI.
5. דון ציוד הגנה אישי חדש וכפפות סטרילי.
6. לגלח את הפרווה מהאתר הפעיל באמצעות קוצץ חשמלי.
7. החלת משחה עיניים מגן לעיניים של העכבר כדי למנוע פציעה הקרנית וייבוש.
8. הציבו את העכבר לתוך אולם ההפעלה.
9. להכין את העור עם הניתוח יוד מבוסס לסירוגין עם אלכוהול שלוש פעמים.

4. יישום של השפעה קורטיקלית מבוקרת

1. . באמצע הדרך עם אזמל שחושף את הגולגולת
2. הצב את העכבר בתוך מסגרת הפעלה סטריאוטקאית על-ידי אבטחת עצמות הזמן הדו בין ברים האוזן הזעירים ונעילת החותכות בתוך מהדק חותכת יצירת יציבה שלוש נקודות להחזיק על ראש העכבר.
3. למשוך את הקרקפת הרחק מהאתר הפעיל עם הדימום או מלקחיים נעילה כדי להבטיח את הקרקפת לא בא במגע עם סיבית המקדחה במהלך כריתת גולגולת.
4. זהה את התפרים המשונן והקורונאליות על הגולגולת החשופה.
   הערה: פרוטוקול זה מרכז את כריתת הגולגולת 2 מ"מ משמאל משונן תפר ו 2 מ"מ rostral לתפר ילתית.
5. בצע כריתת גולגולת באמצעות תרגיל עם סיבית של מקדחה טרפין.
   1. כדי לבצע את כריתת הגולגולת, הפעל תחילה את התרגיל במהירות מירבית ולאחר מכן החל את התרגיל הקודח של הפין בניצב לגולגולת באתר של כריתת גולגולת.
   2. החל בעדינות, אפילו לחץ על התרגיל פעם איש קשר נעשה עם הגולגולת. קל "לתת" יהיה הרגיש ברגע התרגיל חודר דרך הגולגולת. אין לחדור את השכבה הבסיסית.
      הערה: פרוטוקול זה מנצל מקדחה של 5 מ"מ בלבד כדי לבצע את כריתת הגולגולת.
6. מלקחיים להשתמש ו מד קטן המחט תת-עורית כדי להסיר את דש העצם, חשיפת מלא את הבסיס דורא מאטר.
7. סובב את הקצה של המדחף לתוך השדה הפעיל והנמך אותו עד שהוא יוצר קשר עם משטח השכבה החשוף. לאחר המגע מתבצע חיישן המגע של המכשיר יעשה צליל שקול כדי להתריע על המנתח שנוצר קשר. פעולה זו תסמן את נקודת האפס שממנה מוגדרת עומק הדפורמציה.
   הערה: פרוטוקול זה מנצל טיפ 3 מ"מ להשפיע כדי ליצור פציעה חמורה. ניתן להשתמש בטיפים קטנים כמו 1 מ"מ כדי להחיל פציעה מקומית יותר.
8. למשוך את הקצה המשפיעים ולקבוע את עומק ההשפעה הרצוי על-ידי הנמכת המיקום של המדחף במסגרת הסטריאוטקאית.
   הערה: בפרוטוקול זה אנו מתארים פציעה חמורה על ידי הגדרת עומק הדפורמציה ל-2 מ"מ.
9. החל את הפציעה על-ידי הפעלת impactor חקן בהתקן האקטולי.
10. סובב את התקן ההתנגשות מחוץ לשדה והסר את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקאית.

5. סגירת אתר כירורגי

1. שליטה דימום מהגולגולת ומשטח קליפת המוח נפצע עם לחץ ישיר של המוליך כותנה סטרילית משופעת.
2. תייבש את הגולגולת עם. מחבר כותנה סטרילי
3. סגרו את הקרקפת מעל לריתת הגולגולת באמצעות דבק כירורגי זמין מסחרית או תפר מונופינט.
   הערה: בפרוטוקול זה דבק כירורגי וטרינרי משמש לסגירת הקרקפת. כנף העצם אינה מוחלפת ונמחקת.

6. טיפול וניטור שלאחר הניתוח

1. מנהל כאבים שלאחר הניתוח (למשל, שחרור מתמשכת בופרנורפין 0.1 – 0.5 מ"ג/ק"ג מנוהל תת-עורי מתן 72 h של כאבים מתמשכת).
2. מניחים את החיה בתנוחת התאוששות לרוחב בכלוב נקי מראש מחומם.
3. להתבונן בחיות עד הערה וניידים, ואז להחזיר כל עכבר לכלוב הבית שלו.
4. הקפידו לקבל גישה חופשית לאוכל ולמים. צריכת המזון והמים הרגילים מחדשים בדרך כלל תוך שעתיים לאחר הפציעה.
5. מדידת משקל הגוף כל שלושה ימים לאורך הניסוי.

תוצאות

Impactor שחקן עולה ישירות על מסגרת סטריאוטקאית המאפשר ככל 10 יקרומטר רזולוציה לשליטה על נקודת ההשפעה, עומק וחדירה. הכוחות האלקטרומגנטיים המועסקים יכולים להקנות למהירויות השפעה החל 1.5 – 6/m. זה מאפשר דיוק ללא תחרות והוא מהווה שליטה על כל מגוון של TBI הרלוונטיות קלינית. החוקרים יכולים להפעיל ניסוי?...

Discussion

קיימים מספר שלבים קריטיים להחלת פציעה אמינה ועקבית. ראשית, העכבר חייב להגיע למישור עמוק של הרדמה כירורגית להבטיח שום תנועה במהלך הביצועים של כריתת הגולגולת. בעוד משטרי הרדמה רבים עשוי לשמש כדי לגרום הרדמה כללית במכרסמים, הרדמה לגרום לדיכאון נשימתי כגון הרדמה המערכת הימית עלולה לגרום לדום...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50