מערכת Microdrive היברידית עם בדיקה ההשבה Opto-סיליקון ו Tetrode עבור הקלטה כפול בצפיפות גבוהה בחופשיות העברת עכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של מערך microdrive היברידית המאפשר השרשה של תשעה באופן עצמאי tetrodes מתכווננת ובדיקה אחת opto-סיליקון מתכווננת בשני אזורי המוח בעכברים נעים בחופשיות. כמו כן הפגינו היא שיטה לשחזור בבטחה ושימוש חוזר במחקר opto-סיליקון למטרות מרובות.

Abstract

הקלטות עצביות מרובות-אזוריות יכולות לספק מידע חיוני להבנת אינטראקציות בציר הזמן העדין בין אזורי מוח מרובים. עם זאת, עיצובים מיקרו-כונן קונבנציונלי לעתים קרובות רק לאפשר שימוש בסוג אחד של אלקטרודה להקליט מאזורים בודדים או מרובים, הגבלת התשואה של יחידה אחת או פרופיל עומק הקלטות. זה גם לעתים קרובות מגביל את היכולת לשלב הקלטות אלקטרודה עם כלים אלקטרואופטיקה למטרה מסלול ו/או תא סוג פעילות מסוימת. מוצג כאן הוא מערך מיקרו-כונן היברידית עבור עכברים נע בחופשיות כדי למטב את התשואה ותיאור של הייצור שלה ושימוש חוזר של מערך microdrive. העיצוב הנוכחי מעסיקה תשעה tetrodes ובדיקה אחת opto-סיליקון מושתל בשני אזורי מוח שונים במקביל עכברים נע בחופשיות. The tetrodes ו opto-סיליקון בדיקה מתכווננת באופן עצמאי לאורך הציר הגזובנמי במוח כדי למקסם את התשואה של היחידה ופעילויות מנופדות. מערך זה של המיקרו-כונן משלב גם הגדרת מניפולציה של אור, מניפולציות אלקטרואופטיקה מדיה כדי לחקור את סוג האזור המקומי או התאים הספציפיים הפונקציות של מעגלים עצביים ארוכת טווח. בנוסף, בדיקה opto-סיליקון ניתן לשחזר בבטחה ושימוש חוזר לאחר כל ניסוי. מכיוון שמערך המיקרו-כונן מורכב מחלקים מודפסים תלת-ממדיים, ניתן לשנות בקלות את העיצוב של המיקרו-כוננים כדי להתאים להגדרות שונות. תיאר לראשונה הוא העיצוב של מערך microdrive וכיצד לחבר את הסיבים האופטיים כדי בדיקה סיליקון עבור ניסויים אלקטרואופטיקה, ואחריו הייצור של הצרור tetrode והשרשה של המערך לתוך מוח העכבר. ההקלטה של פוטנציאל השדה המקומי ויחידה העולה בשילוב עם גירוי אלקטרואופטיקה גם להפגין היתכנות של מערכת מערך microdrive בעכברים נעים בחופשיות.

Introduction

חשוב להבין כיצד הפעילות העצבית תומכת בתהליך קוגניטיבי, כגון למידה וזיכרון, על-ידי חקירת מאזורי מוח שונים הפועלים באופן דינאמי זה עם זה. כדי להבהיר דינמיקה של הפעילות העצבית הבסיסית משימות קוגניטיביות, בקנה מידה גדול אלקטרופיזיולוגיה לחילוץ כבר נערך באופן חופשי בעלי חיים בעזרת מערכים microdrive^{1,2,3, ד}. בשני העשורים האחרונים, מספר סוגים של מערך microdrive פותחו כדי השתל אלקטרודות לאזורים המוח מרובים עבור חולדות^5,6,7,8 ועכברים^9, מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ^{11 , 12}. עם זאת, עיצובים מיקרו כונן הנוכחי בדרך כלל לא מאפשרים שימוש בסוגי בדיקה מרובים, לאלץ חוקרים לבחור סוג אלקטרודה אחת עם הטבות ומגבלות ספציפיות. לדוגמה, מערכי tetrode פועלים היטב עבור אזורי מוח מאוכלסים בצפיפות כגון ההיפוקמפוס הCA1^1,13, בעוד שבדיקות סיליקון נותנות פרופיל גיאומטרי טוב יותר ללמידה של חיבורים אנטומיים^{14 ,} . ^{חמש עשרה}

Tetrodes ובדיקה סיליקון משמשים לעתים קרובות בהקלטה vivo כרונית, ולכל אחד יש יתרונות וחסרונות משלו. Tetrodes הוכחו יש יתרונות משמעותיים בבידוד יחידה אחת טובה יותר מאשר אלקטרודות יחיד^16,17, בנוסף האפקטיביות עלות קשיחות מכנית. הם גם מספקים תשואות גבוהות יותר של פעילות יחידה בודדת בשילוב עם microdrives^8,18,19,20. חיוני להגדיל את מספר הנוירונים הנרשמים בו זמנית להבנת התפקוד של מעגלים עצביים²¹. לדוגמה, מספר גדול של תאים נחוצים כדי לחקור אוכלוסיות קטנות של סוגי תאים הטרוגנית פונקציונלית כגון זמן הקשור²² או תגמול קידוד²³ תאים. מספרי תאים גבוהים הרבה יותר נדרשים כדי לשפר את איכות פענוח רצפי ספייק^13,24,25.

Tetrodes, עם זאת, יש חיסרון בהקלטת תאים מבוזרים מרחב, כמו בקליפת המוח או תלמוס. בניגוד tetrodes, סיליקון בבדיקות יכול לספק הפצה מרחבית ואינטראקציה של פוטנציאל השדה המקומי (lfps) ופעילויות העולה בתוך מבנה מקומי^14,26. Multi-shank בבדיקות סיליקון להגדיל עוד יותר את מספר אתרי ההקלטה ולאפשר הקלטה על פני מבנים יחיד או שכנים²⁷. עם זאת, מערכים כאלה הם גמישים פחות במיקום של אתרי האלקטרודה לעומת tetrodes. בנוסף, אלגוריתמים מורכבים של מיון דקר נדרשים בבדיקות בצפיפות גבוהה כדי לחלץ מידע על הפוטנציאל הפעולה של ערוצים שכנים כדי לשקף את הנתונים שנרכשו על ידי tetrodes^28,29,30. מכאן, התשואה הכוללת של יחידות יחיד היא לעתים קרובות פחות מאשר tetrodes. יתר על כן, בדיקה סיליקון הם חוסר יתרון בשל בסדר שלהם ועלות גבוהה. כך, הבחירה של tetrodes vs. סיליקון בדיקה תלוי במטרה של ההקלטה, שהיא שאלה אם קבלת תשואה גבוהה של יחידות יחיד או פרופיל מרחבי באתרי ההקלטה הוא העדיפות.

בנוסף הקלטת פעילות עצבית, מניפולציה אלקטרואופטיקה הפך לאחד כלים חזקים יותר במדעי המוח כדי לבחון כיצד סוגי תאים ספציפיים ו/או מסלולים תורמים פונקציות המעגל העצבי^{13,31, 32,33}. עם זאת, ניסויים אלקטרואופטיקה דורשים שיקול נוסף בעיצוב מערך microdrive כדי לחבר את מחבר סיבים גירוי מקורות אור^34,35,36. לעתים קרובות, חיבור סיבים אופטיים דורש כוח גדול יחסית, אשר עשוי להוביל לשינוי מכני של הגשוש במוח. לכן, זו אינה משימה טריוויאלית לשלב סיבים אופטיים מוהשתלות למערכים מיקרו-כוננים קונבנציונליים.

מהסיבות הנ ל, החוקרים נדרשים כדי למטב את הבחירה של סוג של האלקטרודה או להשתיל סיבים אופטיים בהתאם למטרה של ההקלטה. לדוגמה tetrodes משמשים כדי להשיג תשואה יחידה גבוהה יותר ההיפוקמפוס^1,13, בעוד הסיליקון בדיקה משמשים כדי לחקור את פרופיל עומק למינארי של אזורים קליפת המוח, כגון קליפת entorhinal המדיאלי (MEC)³⁷. כיום, מיקרו כוננים עבור השרשה בו של tetrodes ובבדיקות סיליקון דווחו עבור חולדות^5,11. עם זאת, זה מאוד מאתגר להשתיל tetrodes מרובים ובדיקות סיליקון בעכברים בגלל המשקל של מיקרו-כוננים, שטח מוגבל על ראש העכבר, ודרישות מרחבית לעיצוב microdrives להעסיק בדיקות שונות. למרות שניתן להשתיל בדיקה סיליקון ללא microdrive, הליך זה אינו מאפשר התאמה של החללית ומפחית את שיעור ההצלחה של סיליקון-בדיקה התאוששות^12,38. יתר על כן, ניסויים אלקטרואופטיקה דורשים שיקולים נוספים בעיצוב מערך microdrive. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות ולשתול מערך microdrive עבור הקלטה כרונית בעכברים נעים בחופשיות, אשר מאפשר השרשה של תשעה באופן עצמאי tetrodes מתכוונן אחד opto-סיליקון לבדוק. מערך זה מיקרודרייב מקלה גם על ניסויים אלקטרואופטיקה והתאוששות של לווין הסיליקון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של המרכז הרפואי הדרום-מערבי של אוניברסיטת טקסס.

1. ההכנות של חלקי מערך מיקרו-כוננים

1. הדפס את החלקים של מערך המיקרו-כונן במדפסת תלת-ממדית באמצעות שרף מודל דנטלי (איור 1A, B). ודא כי העובי של שכבות מודפסות בודדות תלת-ממד קטן מ-50 יקרומטר כדי לשמור על החורים הקטנים על החלקים המודפסים ברורים ומעשי.
   הערה: מערך המיקרו-כונן מורכב מחמישה חלקים (איור 1C): (1) הגוף העיקרי של מערך microdrive, הכולל תשעה מיקרודרייב-ברגים עבור tetrodes ובורג אחד עבור הסיליקון-לווין (איור 1c-d). התיאום של צרור החבילה והחור של המקדח opto-סיליקון בתחתית תלוי בקואורדינטות של אזור המוח היעד (איור 1Cd); (2) מעבורת לצרף סיליקון-בדיקה או optrode (איור 1Ce); (3) המכשיר החשמלי בחללית הר להחזיק את החיבור בדיקה סיליקון (איור 1Cf); (4) מחזיק סיבים בכלל כי התפסים לחלק המרכזי של הגוף כדי למנוע תנועות בלתי רצויות של בדיקה opto מושתל-סיליקון בעת חיבור/ניתוק מחבר סיבים אופטיים (איור 1Cg); (5) קונוס מגן המספק מיגון פיסי וחשמלי למערך המיקרו-כונן להקלטה יציבה (איור 1Ch). המשקל הכולל של מערך המיקרו-כונן הוא 5.9 g, כולל חרוט המגן (שולחן 1). אם החורים סתומים בחלקים המודפסים, לקדוח את החורים באמצעות חתיכות מקדחה: #76 עבור החורים הפנימיים ו#68 עבור החורים החיצוניים עבור ברגים tetrode-microdrive, #71 עבור מיקרודרייב מיקרו-כונן-בורג תומך החור, ו #77 עבור חורים עבור המדריך-הודעות בחלק התחתון של את הגופה
2. החדרת הודעות מדריך לגוף מערך המיקרו-כונן.
   1. גזור 2 16 מילימטר אורך של כבל נירוסטה 26-Ga. לחדד בעדינות את הטיפים בחוט באמצעות מטחנת רוטרי.
   2. הכניסו את החוטים לחורים התחתונים של הגוף (איור 2 א). החל כמות קטנה של דבק ציאנואקרילי בתחתית הגוף כדי לאבטח את הודעות המדריך.

2. הכנה לבדיקה באמצעות סיליקון

1. הכן את בורג המיקרו-כונן. לבדיקה של סיליקון
   הערה: בורג microdrive עבור בדיקה סיליקון מורכב בורג מותאם אישית (300 יקרומטר גובה), תמיכה צינור תמיכה, ו צינור L-צורה (איור 2b).
   1. הכן את העובש לראש המיקרו-כונן (איור 2C). כדי לבנות את העובש, הכינו את תבנית הפלסטיק המודפסת בתלת-ממד של המיקרו-כונן (איור 2Ca). ואז, יוצקים ג'ל סיליקון נוזלי לאחר יצירת קיר זמני על ידי הצבת קלטות סביב התבנית. להסיר בועות אוויר על ידי טלטול בעדינות, לחכות עד שהוא נרפא, ולאחר מכן להסיר את העובש ג'ל סיליקון מהתבנית (איור 2Cb).
   2. גזור 18 מ"מ ו 9.5 מילימטר לאורך של 23 גרם נירוסטה באמצעות מטחנת רוטרי. קשוחים העליון 2 – 3 מ"מ של החוטים עם מטחנת רוטרי כדי לשפר את הדבקה של אקריליק שיניים.
   3. קח בורג מותאם אישית אחד להחיל כמות קטנה של שמן סיליקון כדי להפחית את החיכוך עם אקריליק שיניים. הגדר את החוטים ובורג מותאם אישית לתבנית.
   4. יוצקים אקריליק שיניים לתוך העובש באמצעות מזרק לחסל בועות אוויר סביב החוטים ואת הברגים. זיהום בועות האוויר יגרום. למיקרו-כונן להיות שברירי המתן עד אקריליק שיניים הוא נרפא לחלוטין, ואז להוריד את הברגים microdrive מן העובש. לכופף 6 מ"מ של קצה חוט ארוך יותר זווית 60 מעלות באמצעות צבת.
   5. בדוק את האיכות של בורגי המיקרו-כונן (לדוגמה, סדקים, בועות אוויר וחיכוך) כדי לסובב את הבורג. אם יש חיכוך גבוה, לסובב את הבורג עד שהם הופכים להחליק באמצעות מנהל התקן בורג חשמלי עם קצה הנהג מותאם אישית, אשר זוגות עם בורג המיקרו-כונן.
   6. התקן את בורג המיקרו-כונן לתוך גוף המערך של המיקרו-כונן כדי לבדוק אם הוא נע בצורה חלקה למעלה ולמטה על-ידי הפיכת הבורג. האשכולות עבור הבורג נוצרים באופן אוטומטי בעת הכנסת הבורג לתוך חור הגוף.
2. הכן את המעבורת (איור 3Aa).
   1. גזור שני אורכים 5 מ"מ של polyetheretherketone (להציץ) אבובים באמצעות מספריים חדים. ליישר את הצינורות בשני צידי המעבורת. הדבק את הצינורות והמעבורת באמצעות אפוקסי.
   2. החלת כמות קטנה של שמן סיליקון בהצבות המדריך. בדוק את האיכות של המעבורת על ידי הוספת על הודעות מדריך של גוף מערך microdrive. ודא שהמעבורת זזה בצורה חלקה ללא חיכוך מוגזם.
3. הכן optorode (איור 3Ab). ניתן לדלג על שלב זה אם ניסוי אלקטרואופטיקה אינו נדרש.
   1. קליב סיבים אופטיים עד 21 מ"מ באורך באמצעות חותך אודם. לטחון את העצה סיבים כדי להפוך את הקצה שטוח ומבריק.
   2. בעדינות למקם את הסיבים האופטיים בצד הקדמי של לווין הסיליקון. טיפ סיבים ממוקם 200 – 300 יקרומטר מעל החלק העליון של אתרי האלקטרודה. החזק את הסיבים באופן זמני באמצעות סרט שקוף.
   3. הדבק את סיבים אופטיים לבסיס של סיליקון-בדיקה באמצעות כמות קטנה של אפוקסי. המתן לפחות 5 שעות עד שהאפוקסי נרפא לחלוטין.
      הערה: מומלץ לחבר את הסיבים האופטיים באותו צד כמו אתרי האלקטרודה. חיבור הסיבים בישבן עלול למנוע מהאור להאיר כראוי את אתרי ההקלטה.
4. לצרף את המעבורת לבדוק את הסיליקון (איור 3Ac): להחיל כמות קטנה של אפוקסי בחלק האחורי של הבסיס של הסיליקון-לווין. הצמד את החלק התחתון של המעבורת אל הבסיס של הסיליקון-בדיקה, ולהחזיק בעדינות במיקום עבור 2 – 3 דקות כדי למנוע היווצרות פער בין המעבורת סיליקון-בסיס בדיקה במהלך התרופה הראשונית של אפוקסי. המתן לפחות 5 שעות עד שהאפוקסי נרפא לחלוטין.
5. הכנס בזהירות את שפופרות ההסעות אל הודעות המדריך של הגוף העיקרי תחת המיקרוסקופ (איור 3B). במהלך הליך זה, להחזיק את החריץ של המעבורת עם פינצטה בסדר.
6. הכנס את בורג המיקרו-כונן לתוך חור הברגים על-ידי הפיכת הבורג. לעסוק בדיקה סיליקון ו microdrive-בורג על ידי הוספת קצה חוט L-צורה לתוך החריץ של ראש המעבורת (איור 3C).
7. חבר את מחזיק החיבור החשמלי המכשיר לגוף מערך microdrive (איור 3D).
   1. גזור שני ברגים #0 לאורך חוט 3.5 מ"מ. לטחון את הטיפים כדי להסיר burrs.
   2. הצב את מחזיק החיבור של המכשיר על הגוף. הניחו את המחבר החשמלי במכשיר הסיליקון למחזיק.
   3. אבטח את מחבר בדיקה סיליקון במחזיק באמצעות אפוקסי, והקפד לא להדביק אותו לגוף מערך microdrive כדי לאפשר את תהליך ההחלמה של הבדיקה סיליקון. הכנס את הברגים כדי להחזיק את מחזיק החיבור של המכשיר.
8. לצרף את מחזיק ferrule הבדיקה opto-סיליקון הגוף מערך microdrive (איור 3D).
   1. גזור שני ברגים #0 לאורך חוט 6 מ"מ. לטחון את הטיפים כדי להסיר burrs.
   2. לטחון את החלק החיצוני של שני #0 מכונת בורג אגוזים לעשות אגוזים hex קטן עם 2.5 – 3.0 מילימטר בקוטר החיצוני כדי להפחית את משקל וחלל.
   3. הכנס את הברגים לרכיב A של המחזיק. הדבק את ראשי הברגים באמצעות אפוקסי.
   4. החלת כמות קטנה של משחה סיליקון לרכיב A ו-B כדי להפחית את החיכוך עם הגוף. הוסף רכיב A לתוך הגוף ולאחר מכן החזק באופן זמני את השימוש בפינצטה הפיכה.
   5. הצב את הרכיב B אל רכיב ברגים. הפתיל אגוזים המותאם אישית לתוך הברגים. להשתמש צבת כדי להדק את האגוזים כדי לאבטח את מחזיק חזיות על הגוף.
   6. הכנס את כלל הסיבים לתוך החריץ של בעל כללי הסיבים (רכיב B). ודא כי הסיבים בכלל נדבקת 4 – 5 מ"מ מבעל.
   7. החלת כמות קטנה של אפוקסי בין הסרגל לבין חריץ המחזיק. המתן עד שאפוקסי נרפא לחלוטין ובדוק כי הכלל אינו זז. בדוק את המעבורת ואת מחזיק חזיות עבור תנועה חלקה על ידי התרופפות אגוזים לפני הפיכת microdrive-בורג.
   8. בדוק את מרחק העבודה של הגשוש. ודא כי הטיפ בדיקה לחלוטין מופרע הזה בו לתוך הגוף כאשר מחזיק ferrule הוא בעמדה העליונה בעוד הצינורות המעבורת עדיין משויך המדריך-פוסטים. מרחק העבודה המקסימלי נקבע לפי אורך בדיקת הסיליקון ואזור המוח היעד.
   9. אם המיקרו-כונן-בורג רופף, להחיל כמות קטנה של אקריליק שיניים סביב הבורג כדי להוסיף יותר הליכי תמיכה. כאשר הוא נרפא, לסובב את הבורג כדי לבדוק את האטימות והיציבות.

3. הכנה לטטרגדה

הערה: הליך זה דומה למאמרים שפורסמו קודם לכן^8,19,20,39.

1. הכן את בורגי המיקרו-כונן עבור הטטרוידה. המיקרו-כונן עבור tetrode מורכב בורג המכונה מנהג 23 G (איור 2B). הליך זה דומה לסעיף 2.1.
2. הפוך צרור של 30 צינור פלדה אל חלד כי יש 5.5 מיליון תיל בתוך. במקרה זה, סך של 9 30 G אבובים (שמונה tetrodes הקלטה אחד התייחסות אלקטרודה) שימשו.
3. הפתיל צרור של 30 גרם מהחלק התחתון של הגוף הכונן, ולאבטח אותם עם 20 G-החומה דק צינורות לגוף הראשי. חתוך את החלק התחתון של צרור עם מטחנת רוטרי כדי להפוך את הקצה אפילו וסומק. לקצץ בחלק העליון של 30 צינורות G עם מטחנת סיבוביים כך 30 G צינור מקלות החוצה על 0.5 מ"מ מהגוף הראשי.
4. טען 5.5 מיל פוליאימיד בידוד צינורות לתוך הצינורות 30 G. להכין חוטים tetrode ולטעון אותם לתוך לוח 32 ערוץ חשמלי ממשק (EIB). בדוק את החיבור החשמלי עם הבוחן עכבה לפני חיתוך דיוק סופי.
5. התנגדות התחתון עצה העכבה ל 250 – 350 kΩ עם פתרון ציפוי זהב. . תתקן את כל הטטרודס עם דבק-על
6. מילוי פער מוגזם בין צינור פוליאימיד לבין tetrode עם שמן מינרלי לאיטום ושימון. הובל את התיל הקרקעי אל EIB.
   הערה: במקרה הצורך, ניתן לשלב את הסיבים האופטיים לאורך חוטי הטיק¹².

4. חיבור חרוט המגן

1. צבע מגינים מוליכי כסף על החלק הפנימי של החרוט המודפס. הצב את מערך המיקרו-כונן בתוך החרוט (איור 3E).
2. גזור שני ברגים #0 לאורך חוט 3.5 מ"מ. הדק את הברגים מחוץ לחרוט כדי להחזיק את מערך המיקרו-כונן במקומו.
3. החלת צבע כסף סביב ראש הבורג כדי לחבר את קונוס המגן עם הקרקע החשמלית. תבדקו את הקישוריות החשמלית. בין חוט הקרקע לקונוס החל כמות קטנה של אפוקסי בין גוף מערך המיקרו-כונן לבין חרוט המגן כדי לחבר את הגוף בצורה מאובטחת.
   הערה: דרך נוספת להכין את קונוס המגן היא להשתמש בסרט אלומיניום⁴⁰ (איור 3f). ראשית, הכן את נייר הדפוס לקונוס המגן לאחר שנדבק ברדיד אלומיניום לנייר (איור 3Fa). ואז, לגלגל את הנייר ולצרף אותו לגוף microdrive באמצעות כמות קטנה של דבק ציאנואקרילי (איור 3Fb). המשקל של חרוט זה הוא 0.72 g והמשקל הכולל של מערך microdrive מופחת ל 4.7 g (שולחן 1).

5. ניתוח שתל

הערה: הליך זה משתנה ממאמרים שפורסמו קודם לכן^18,39,41 עבור השרשה באתר כפול. ודא כי המשקל של בעל החיים הוא מעל 25 g עבור השתל microdrive להתאוששות מהירה יותר לאחר הניתוח.

1. כנה
   1. כדי להכין בורג הקרקע, לצרף את חוט הכסף לבורג הגולגולת להחיל צבע כסף. ואז, לצרף סיכת זהב לצד השני של החוט באמצעות צבע כסף.
   2. הכן את מתאם החזקת הכונן כך שיחזיק את מערך המיקרו-כונן להתקן סטריאוטקטיקה. חברו חיבור גברי לידית אל חלד באמצעות אפוקסי. ודא כי יישור של החיבור והידית אל חלד הוא ישר.
   3. במקרה כי האימות היסטולוגית נדרש לאחר ההקלטה, להחיל Di-I כדי tetrodes או הישבן של הסיליקון-בדיקה³⁸.
   4. הנמך את הסיליקון-בדיקה למטה כדי להיות בעומק הרצוי. לשחרר את האגוזים של מחזיק חזיות באמצעות צבת, להוריד את הסיליקון-בדיקה (opto-סיליקון בדיקה) על ידי הפעלת המיקרו-בורג סיליקון של בדיקה, לאחר מכן להדק את האגוזים כדי לאבטח את המחזיק חזיות. כאשר השתילה tetrodes באזור CA1 היפוקמאל ו סיליקון-בדיקה ב-MEC, המרחק בין הצינורית tetrodes ו סיליקון-בדיקה של הטיפ הוא 3 – 4 מ"מ.
2. הגדר את העכבר הורדם (0.8% – 1.5% isofלוריאן) במכשיר סטריאוטקאית. מצב ההרדמה של העכבר הוא אישר על ידי העדר רפלקס צביטה הבוהן. החלת משחה ברורה על העיניים כדי למנוע ייבוש. לכסות את העיניים עם פיסת נייר כסף כדי להגן מפני חשיפה חזקה באור כירורגי.
3. חטא את הקרקפת של העכבר עם יוד ו איזופנול לאחר גילוח הפרווה. הפוך את החתך 1.5 – 2.0 ס מ על הקרקפת באמצעות מספריים כירורגי רגיל, ולהסיר את הרקמה מעל הגולגולת באמצעות מטליות כותנה לאחר תת-עורי החלת לידוקאין.
4. יישר את ראש העכבר עם הכלי הסטריאוטקאית. ודא שהפרש הגובה בין ברסגמה לבין למדא קטן מ-100 μm. לקבוע את המיקום בפתיחת הגולגולת באמצעות אטלס ולסמן מיקומים אלה עם עיפרון מעוקר.
5. עגן את בורגי הגולגולת (0.8 מ"מ בקוטר, 0.200 מ"מ הפתיל המגרש) על ידי סיבוב אותם 1.5 פונה (0.3 מ"מ) על הגולגולת, באמצעות מלקחיים כירורגי מברג לאחר קידוח 8 – 11 חורים בגולגולת באמצעות מקדחה בגודל של 0.5 mm.
   הערה: 2 – 4 חורים בגולגולת הקדמית, 2 – 3 חורים בכל צד של הגולגולת הקודקודית, ו 1 – 2 חורים בגולגולת הבין-קודקודית מוצעים.
6. הצמד את בורג הקרקע אל החור על ידי סיבוב אחד להפוך (0.2 מ"מ) לאחר קידוח חור בעצם הדופן הפנימי. ודא כי החור הזה לא חודר דרך העצם לתוך המוח מקרה; אחרת, אותות המוח יזהם את ההקלטה. בדוק כי העכבה היא פחות מ 20 kΩ ב 1 kHz בין בורג הקרקע ברגים הגולגולת באמצעות מד עכבה.
   הערה: עכבה גדולה יותר תגרום למבוא של חפצי תנועה במהלך ההקלטה.
7. בצעו את פתיחת הגולגולת. במקומות המסומנים ניתן להשאיר את הדורא ללא פגע בעכברים.
8. חברו את הסיכה הגברית של בורג הקרקע ואת מחבר הקרקע של מערך המיקרו-כונן. בדוק את הקישוריות באמצעות מד העכבה על ידי מדידת בין בורג הקרקע לבין הגנה.
9. הגדר את מערך המיקרו-כונן למתאם, הגדר אותו למכשיר הסטריאוטקאלי, והנמך באיטיות את לווין הסיליקון עד לעומק הרצוי. ודא כי צרורות tetrode ממוקמים מעל פני השטח המוח אבל עדיין בתוך מערך microdrive כאשר בדיקה סיליקון מוכנס למוח (איור 4A).
10. בזהירות להחיל את משחה סיליקון כדי לאטום את האזור של לווין הסיליקון ואת הצרור tetrode (איור 4B). לשים כמות קטנה של משחה סיליקון בקצה המחט 20 G ולהחיל את גריז סביב הגששים באמצעות המחט. חזור עד שגריז סיליקון מכסה לחלוטין את האזור סביב החללית כך אקריליק שיניים אינו זורם אל או מתחת אלקטרודות/בדיקה. להיזהר לא לתת את הגריז לגעת באתרי האלקטרודה, אחרת זה יהיה באופן דרמטי להגדיל את העכבה של אתרי ההקלטה.
11. החלת אקריליק שיניים כדי לתקן את מערך microdrive כדי ברגים עיגון בגולגולת.
    הערה: מומלץ להחיל אקריליק שיניים בשלוש שכבות כדי למנוע את החום מוגזמת המיוצר במהלך הריפוי של אקריליק.
12. הסר את המתאם ממערך המיקרו-כונן בזהירות. הכנס 1 mL של PBS תת-עורי כדי למנוע התייבשות. הכנס 5 מ"ג/ק"ג מלוקסיאם תת-עורי כטיפול כאבים.
13. לכסות את המחבר סיליקון-בדיקה על ידי פיסת קלטת כדי למנוע כל לכלוך להיכנס פנימה של חיבורי חשמל. כסו את מערך המיקרו-כונן באמצעות סרט פרפין פלסטי והדבק אותו במקומו.
14. ניהול טיפול כאבים המתאים 3 ימים (למשל, זריקות תת עורית של 2 מ"ג/ק"ג מלוקסיאם פעם ביום). אפשר 3 – 5 ימים להתאוששות לפני תחילת התאמת tetrode. העכבר מושתל לאחר תקופת ההחלמה מוצג באיור 4C.

6. שחזור סיליקון-בדיקה (איור 4D)

1. הכנס קטמין (75 מ"ג/ק"ג) ו דקדמדטומדין (1 מ"ג/ק"ג) הרדמה intraperitoneally והעדר אישור של רפלקס הבוהן. לתקן את העכבר מורדם על ידי מימוש ישיר 4% פאראמפורמלדהיד דרך הלב באמצעות ברדס. שיטות כירורגיות למכרסמים מתוארות בעבר⁴².
2. שחרר את האגוזים של בעל חזיות באמצעות plier. אז, בזהירות להעביר אותו לחלק העליון של הגוף על ידי הפיכת בורג הכוונון כדי למשוך באופן מלא את הסיליקון-בדיקה לכיוון בתוך הגוף מערך microdrive. להדק את האגוזים להחזיק את הגשוש בעמדה העליונה.
3. להוציא את המוח העכבר מלמטה על ידי פיצוח הגולגולת מהצד. מערך המיקרו-כונן מופרד כעת מהחיה.
4. להסיר לחלוטין את בצורת המיקרו-כונן-בורג המניע את בדיקת סיליקון. לשחרר ולהוציא את האגוזים של המחזיק חזיות באמצעות צבת. תוציא את הרכיב. ממחזיק הפרשול
5. להתיר את המחבר מחבר הגשוש וניתוק מגוף הכונן. בדוק כי מחבר הגשוש יכול לרדת מגוף מערך המיקרו-כונן.
6. החזיקו את החלק העליון של המעבורת עם מספריים, ולאחר מכן החלק בזהירות את ההרכבה הסיליקון-בדיקה מתוך מערך microdrive.
7. נקה את העצה בדיקה עם מנקה עדשות מגע (הראשון עם אנזים, ואז 3% חמצן מימן) עבור יום אחד לפחות. נגב בזהירות את העצה האלקטרודה באמצעות רפידות איזופנול מתחת למיקרוסקופ. שמור את הגשוש בתיבת אחסון ללא סטטי.
   הערה: המעבורת ואת הרכב בדיקה המחבר להישאר מחובר הבדיקה סיליקון ניתן להשתמש חוזר בהשתלה הבאה.
   הערה: חלק מבדיקות הסיליקון לא נסבלים עם מי חמצן מימן. במקרה זה, להשתמש בפתרון עדשות מגע המכיל אנזים פרוטנוגד חרדה בלבד.
8. כדי לעשות שימוש חוזר בגוף מערך microdrive עבור הניתוח הבא, להסיר אקריליק שיניים באמצעות שילוב של מקדחים טיפים עדינים מצבתים. לאחר מכן, לשחזר את בורגי הגולגולת על ידי הסרת אקריליק שיניים הוסרו לאצטון. שימו לב כי אצטון ימוסס חלקי פלסטיק של מערך microdrive.
9. הסירו את האפוקסי בין גוף המיקרו-כונן לבין חרוט המגן בעזרת אזמל.
   הערה: אין צורך להדפיס חלקים נוספים לניתוח הבא אם המיקרו-כונן אינו מקולקל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מערך המיקרו-כונן נבנה בתוך 5 ימים. ציר הזמן של הכנת המיקרו-כונן מתואר בטבלה 2. באמצעות מיקרו-כונן זה, תשעה tetrodes ואחד בדיקה סיליקון היו מושתלים לתוך היפוקמאל CA1 ו-MEC של העכבר [21 שבוע/29 משקל גוף האדם pOxr1-המין הגברי (C57BL/6 רקע)], בהתאמה. זה עכבר הטרנסגניים מבטא את היצור ב-MEC שכבה III הנוירונים ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול מדגים כיצד לבנות ולשתול מערך microdrive היברידית המאפשר הקלטה של פעילויות עצביות משני אזורים המוח באמצעות tetrodes עצמאית מתכווננת ו סיליקון-בדיקה בעכברים מתנהגים בחופשיות. זה גם מדגים הניסויים אלקטרואופטיקה והתאוששות של בדיקה סיליקון לאחר ניסויים. בעוד בדיקה סיליקון מתכווננת

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#00-90 screw	J.I. Morris	#00-90-1/8	EIB screws
#0-80 nut	Small Parts	B00DGB7CT2	brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw	Small Parts	B000FMZ57G	brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes	Small Parts	SLPT-22-24	for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing	Small Parts	HTX-23R	for tetrode
23 Ga stainless wire	Small Parts	HTX-23R-24-10	for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire	Small Parts	GWX-0200	for guide-posts
30 Ga stainless wire	Small Parts	HTX-30R	for tetrode
3-D CAD software package	Dassault Systèmes	SolidWorks 2003
3D printer	FormLab	Form2
5.5mil polyimide insulating tubes	HPC Medical	72113900001-012
aluminum foil tape	Tyco	Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape	for the alternative shielding cone
conductive paste	YSHIELD	HSF54	for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive	AMT	UNM1.25-HalfMoon	half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive	AMT	Yamamoto_0000-160_9mm	slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic	Stoelting	51459
dental model resin	FormLab	RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool	Dremel	model 800	a grinder
drill bit	Fine Science Tool	19007-05
electric interface board	Neuralynx	EIB-36-Narrow
epoxy	Devcon	GLU-735.90	5 minutes epoxy
eye ointment	Dechra	Puralube Ophthalmic Ointment	to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet	Thorlabs	LFG5P	for polishing the optical fiber
fine tweezers	Protech International	15-368	for loading/recovering the silicon probe
gold pins	Neuralynx	EIB Pins Small
ground wire	A-M Systems	781500	0.010 inch bare silver wire
headstage preamp	Neuralynx	HS-36
impedance meter	BAK electronics	Model IMP-2	1 kHz testing frequency
mineral oil	ZONA	36-105	for lubricating screws and wires
optical fiber	Doric	MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system	Neuralynx	Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe	Thorlabs	S90R	for cleaving the optical fiber
silicon grease	Fine Science Tool	29051-45
silicon probe	Neuronexus	A1x32-Edge-5mm-20-177	Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177	Fig. 4C
silicon probe washing solution	Alcon	AL10078844	contact lens cleaner
silicone lubber	Smooth-On	Dragon Skin 10 FAST	for preparation of microdrive mold
silver paint	GC electronic	22-023	silver print II coating, used for ground wires
skull screw	Otto Frei	2647-10AC	0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors	ROBOZ	RS-5880
stereotaxic apparatus	Kopf	Model 942
super glue	Loctite	LOC230992	for applying to guide-posts
surgical tweezers	ROBOZ	RS-5135
Tetrode Twister	Jun Yamamoto	TT-01
tetrode wires	Sandvik	PX000004