הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

Abstract

תאי גזע האדם בעלי עוצמה מציעים מערכת חזקה כדי לחקור את תפקוד הגנים ואת המודל מוטציות ספציפיות הרלוונטיות למחלה. הדור של שינויים גנטיים heterozygous מדויק מאתגר בשל CRISPR-CAS9 מתווך indel היווצרות ב allele השני. כאן, אנו להדגים פרוטוקול כדי לסייע להתגבר על הקושי הזה באמצעות שתי תבניות תיקון שבו רק אחד מבטא את שינוי הרצף הרצוי, בעוד שתי התבניות מכילות מוטציות שקטות כדי למנוע גזירה מחדש ומבנה indel. מתודולוגיה זו היא היתרון היעיל ביותר עבור הקוד לעריכת גנים באזורים של DNA כדי ליצור שליטה איזוגניים וקווי גזע האדם האנושי ללמוד מחלות אנושיות וביולוגיה. בנוסף, אופטימיזציה של העברת החצייה ומתודולוגיות ההקרנה בוצעו כדי להפחית את העבודה והעלות של ניסוי בעריכת גנים. בסך הכל, הפרוטוקול הזה הוא ישים נרחב לעריכת הגנום רבים באמצעות המודל האנושי pluriפוטנטי.

Introduction

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) הם כלים יקרי ערך למידול מחלות האדם בשל יכולתם להתחדשות, תוך שמירה על היכולת ליצור סוגי תאים של שונות לושלות^{1,2 ,3,4}. מודלים אלה לפתוח את האפשרות לחקור פונקציה גנטית, ולהבין כיצד מוטציות ספציפיות פנוטיפים קשורים מחלות שונות^5,6. עם זאת, כדי להבין כיצד שינוי מסוים מקושר לפנוטיפ מסוים, שימוש בפקד איזוגניים משויך ובקווי תא של מוטציה חשוב לשלוט בשורה לשונות שורה^7,8. תמלול activator כמו נוקלאוסיס (TALENs) והנוקלאוסים אצבע אבץ שימשו כדי ליצור הוספה או מחיקה (indels) מוטציות במודלים גנטיים מגוונים, כולל תאים ראשוניים; אבל הנוקלאוסים האלה יכולים להיות מסורבל לשימוש ויקר^{9,10,11,12,13,14}. הגילוי של באשכולות באופן קבוע הכולל מרווחים לחזור קצר palindromic (crispr)-CAS9 נוקלאז יש מהפכה בשדה בשל יעילות היווצרות indel כמעט בכל אזור של הגנום, פשטות השימוש, וצמצום עלות^{15 ,} מיכל ^{בן 16 ,} מיכל ^{בן 17 ,} מיכל ^{בן 18 ,} . ^{בן 19}

אתגר בשימוש crispr-CAS9 מבוסס הגנום לעריכת הטכנולוגיה כבר הדור או תיקון של מוטציות ספציפיות אלל אחד בלי ליצור מוטציה indel ב אלל השני²⁰. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להתגבר על האתגר הזה על ידי שימוש בשני משתמשים בעלי התקן בודד ומבודד (ssODN) תיקון תבניות כדי להפחית את היווצרות indel ב allele השני. שני ssODNs נועדו להכיל מוטציות שתיקה כדי למנוע חיתוך מחדש על ידי CAS9 nuclease, אבל רק אחד מכיל שינוי של עניין. שיטה זו מגבירה את היעילות של יצירת שינוי גנטי מסוים heterozygous מבלי לגרימת היווצרות indel ב allele השני. באמצעות פרוטוקול זה, הניסויים בעריכת גנים בשישה מיקומים גנומית עצמאית להפגין את המבוא המדויק של שינוי גנומית הרצוי באחד אלל ללא היווצרות indel ב אלל השני ומתרחשת עם יעילות כוללת של ~ 10%. הפרוטוקול המתואר הותאם מ מגווייר ואח '²¹.

Protocol

1. עיצוב ובנייה של מדריך RNA (gRNA)

הערה: כל gRNA מורכב של 2 60 בסיס זוג (bp) oligונוגראודים, כי הם מוגלים כדי ליצור 100 bp כפול תקוע (ds) oligונואוטייד (איור 1א-ג). ציר הזמן עבור העיצוב gRNA, הדור, ויעילות חיתוך בדיקות הוא כ 2 שבועות (איור 2).

1. בחר את אזור ה-DNA של עניין להיות הגנום נערך ולזהות 3-4 23 הרצפים bp להתאים את הפורמט, 5 '-G (N₁₉) ngg-3 '. רצפים אלה צריך להיות ממוקם בתוך 20 bp של אזור הריבית.
   הערה: ניתן לבצע את המיקוד במובן או בחוט האנטי-חוש.
2. הערכת רצפי gRNA עבור יתירות גנומית והסתברות מחוץ ליעד באמצעות משאב כגון CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. שילוב רצף היעד של 20 bp (למעט מוטיב הסמוך פרוטומונט או פאם) לתוך 2 60-מאמר oligונומטר מוצג (רצפים הם 5 ' כדי 3 "ו אדום ירוק הם משלים הפוכה כפי שמוצג באיור 1ג).
4. להזמין את ה2 60. לאחר החלת החמצן מתקבלים, להשעות כל אחד לריכוז הסופי של 100 μM ב ddH₂O. לעשות מלאי עובד של 10 μm.
5. מייצרים את שני החומרים המגנטיים ויוצרים מקטע 100 bp dsDNA באמצעות דנ א פולימראז (טבלת חומרים). לשלב 5 μL של 10 μM קדימה olig, הגאות ו-5 μL של 10 μM הפוכה הפוך בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) שפופרת הרצועה והדגירה ב 95 ° c עבור 5 דקות. קריר התגובה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
6. הגדר את ה-PCR כפי שמתואר בטבלה 1. בצע הגברה של ה-PCR בציקלייר תרמי באמצעות הפרמטרים המתוארים בטבלה 2.
7. המחש את מוצרי ה-PCR ב-1.5% (w/v) אתידיום ברומיד (EtBr) agarose ג'ל אלקטרופורםב 80-100 V עבור 40 דקות. בלו את הלהקה bp ה100 (איור 3a), דמיינו על תיבת אור LED, מן הג באמצעות להב תער ולטהר באמצעות ג'ל ערכת חילוץ (רשימת חומרים).

2. עיצוב התחל של ה-PCR להקרנה

1. בצע הקרנה של ה-DNA שנערך באמצעות מקדימה והפוכה PCR התחל אשר נועדו במיוחד כדי להגביר את אזור bp 400-500 של הגן של עניין (שולחן 2). השתמש ב-DNA בודד מכל שליטה ipsc קו כדי לאשר אמפליקון נקי בעת ביצוע ההקרנה PCR.
2. הדמיה PCR מוצרים על 1.5% (w/v) ג'ל לאחר האלקטרופורזה ב 80-100 V עבור 1 h.
   הערה: רצף של שיבוטים שנערכו מבוצע באמצעות פריימר מקונן המתוכנן לאחר אישור של מערכת ההקרנה להגדיר. . הדגימות נשלחות למקור מסחרי לרצף

3. הכנת פלgRNA_cloning וקטורי

1. כדי לעבור שיבוט וקטור השיבוט, לקחת שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ולהוסיף 1-5 μg של ה-DNA של וקטור gRNA_cloning יחד עם 4 μL של הגבלה Aflii מאגר אנזים ו 1.5 μl של האנזים aflii הגבלה. העלה את התגובה ל 24 μL של ddH₂O. לערבב את התגובה על ידי ליטוף למעלה ולמטה. מודטה ב 37 ° c ללילה (O/N).
2. אלקטרופורסה על 1% העלה ג'ל ב 80-100 V עבור 1 h ולהקות בלו (גודל הלהקה צפוי הוא ~ 3519 bp).
3. לחלץ ולטהר כמו בשלב 1.6.

4. הרכבת וקטור gRNA

1. להגדיר את התגובות ולהרכיב קטעי DNA באמצעות ערכת ההרכבה (טבלה של חומרים) ב 1:5 היחס של aflII מתעכל grna שיבוט וקטור 100 bp ג'ל מטוהרים להוסיף, כפי שמתואר בטבלה 3.
2. דגירה את התגובה ב 50 ° c עבור 15 דקות. לדלל את התגובה 1:3 ddH₂O ולהשתמש 3 μl לשינוי חיידקי, לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). תאי צלחת על קנאמיסינ ליברות/לוחות אגר.
3. לבחור 3-5 מושבות לכל gRNA. האיחסן כל מושבה ב 4 מ ל של LB ולצמוח O/N ב 37 ° c בתוך החממה לרעוד מסלולית.
4. לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת הבידוד miniprep, והרצף כל gRNA באמצעות התחל הבאים כדי להבטיח שיבוט מוצלחת: קדימה: GTACAאאאכאגאג; הפוך: TGCCAACTT.

5. הבדיקה gRNA חיתוך יעילות

1. צלחת hESCs על לקרינה עובריים מורנה מורטין (MEFs) בצלחת 6-באר, כפי שתוארה בעבר²¹. כאשר התאים מגיעים ל-70-80% שליטה, הכינו את המיקס הראשי של התרגום המתואר בטבלה 4.
2. מערבבים על ידי ליטוף ו-דגירה ב-RT עבור 15 דקות. הוסף dropwise לתאים ו-דגירה ב 37 ° c עבור 48 h (עם שינוי מדיה לאחר 24 שעות).
3. הקציר תאים למיון לאחר 48 h.
   1. הסר (טבלת חומרים) באמצעות דגירה של 3 דקות.
   2. לשטוף תאים 1x עם hESC בינונית (שולחן 5) ולגרד לתוך hesc בינונית + 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (טבלת חומרים).
   3. כדוריות התאים ב 300 x g עבור 3 דקות ו-resuspend ב 0.5 ML של hesc בינונית + 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון.
   4. מסנן לתוך צינור 5 מ ל באמצעות כובע מסננת תאים 35 יקרומטר.
4. באמצעות מיון תא המופעל על ידי זריחה (FACS), שער על תאים חיים ולמיין חלבון פלורסנט ירוק (GFP) תאים חיוביים.
5. העברת מקסימום של 1.5 x 10⁴ תאים ממוינים ישירות לתוך 10 ס מ² צלחת מצופה עם 1:3 מטריקס קרוםהמרתף (טבלה של חומרים) ו-Mefs הקרינה ב hesc בינונית (שולחן 5) המכיל Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון.
6. שינוי בינוני מדי יום באמצעות hESC בינונית (שולחן 5) ללא Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון ולבחור שיבוטים באופן ידני לאחר 10-15 ימים, כאשר המושבות הם ~ 1 מ"מ קוטר.
   1. באמצעות פיפטה P200 ומיקרוסקופ, בזהירות לגרד שיבוט יחיד לצייר תאים לתוך הפיפטה.
   2. לפזר את התאים על ידי ליטוף בעדינות 3-4x ב 96 צלחת היטב בינונית שצוירה עם המושבה.
   3. מוותר לצינורות הסרט PCR להקרנה ולגלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות. לבחור 20 מושבות לכל grna.

6. הקרנת שיבוט

1. בודד ה-DNA על ידי הדגירה כדורי תא ב 20 μL של מאגר פרוטטינואז K (שולחן 5) (1 h ב 55 ° צ' ו 10 דקות ב 95 ° c) ו מערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את סופרנטאנט.
2. לבצע הקרנה PCR (סעיף 2) בנפח הכולל של 20 μL באמצעות מיקס הורים כולל תחל שנועד להגביר את האזור של ריבית 5 μL של התקציר הפרוטאינאז K. השתמש ב-DNA גנומית מבודדים מקו התא שהיה גן שנערך כפקד.
3. הערכת שינויי גודל של מוצרי PCR לאחר 1 h אלקטרופורזה ב 70-90 V על 2.5% (w/V) agarose ג'ל (איור 3ב, ג). כל הבדל גודל מעיד על המחשוף.

7. הגנום המדויק עריכת בתאי גזע pluriפוטנטי באמצעות ה-DNA בודד סטרנד oligo (ssODNs)

1. עיצוב 100 bp ssODNs ממורכז סביב רצף gRNA היעיל ביותר נחוש לקבל את יעילות הגזירה הטובה ביותר.
2. למנוע המחשוף מחדש של ODN משולב על ידי החדרת מוטציות שתיקה ברצף gRNA. מוטציה שתיקה אחת ברצף פאם הוא מספיק, אבל אם לא אפשרי, 3-4 מוטציות שתיקה יעבוד.
   הערה: כדי להקל על ההקרנה של שיבוטים ממוקד, המבוא של אתר הגבלה בתוך ~ 20 bp של רצף gRNA הוא אידיאלי.
3. עיצוב ODN אחד עם שינוי הבסיס הרצוי כדי ליצור את מוטציה של ריבית ו-ODN אחד ללא שינוי בסיס (ים).
   הערה: שינויים אלה צריכים להיות לא יותר מ-~ 20 bp מהאתר החזוי CRISPR/CAS9, כמו שילוב מחדש יורד באופן משמעותי במרחקים גדולים.
4. להזמין את שני ssODNs מן הספק של בחירה להשעות מחדש במים לעשות 1 μg/μL מניות. חנות מניות ב-20 ° c.

8. התקנת מעבר החצייה

1. כדי לעבור החוצה את ssODN ו-CRISPR-CAS9 ds, הצלחת קו התא היעד בצלחת 6-טוב על הקרינה הוקרן כדי להגיע 70-80% שליטה לאחר הדגירה O/N.
2. הגדר את תגובת המשגר כמתואר בטבלה 6. מערבבים את התגובה על ידי ליטוף ו-דגירה עבור 15 דקות ב-RT. הוסף את התערובת תגובת העברה התגובה לתאים.
3. לאחר 48 h, הכן את התאים למיון התא כמתואר בסעיף 5.3.
4. לבחור מושבות ~ 10 ימים לאחר ציפוי תאים בודדים באמצעות הפיפטה 200 μL. העברת 100 μL של תאים אחד טוב של 24 או 48 צלחת הבאר בעבר מצופה בג ו MEFs לקרינה בינונית hESC עם Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון. השתמש בשאר 100 μL עבור בידוד DNA כמתואר בסעיף 6.

9. בדיקת מוטציות במושבות יחיד

1. כדי לבדוק שילוב מוצלח של ssODN, לקחת 5 μL של דנ א מבודדים מכל מושבה כדי לבצע PCR באמצעות ההקרנה התחל המתוכנן בסעיף 2. לטהר את מוצרי ה-PCR (טבלת חומרים) ולהכין את מגבלת העיכול באמצעות אתר האנזים הייחודי שנוצר ב-ssODN.
   הערה: עיכול זה כולל גם את מאגר האנזים ההגבלה ואת הריכוז המומלץ של היצרן של אנזים ההגבלה בנפח של 40 μL.
2. מערבבים את התגובה על ידי ליטוף ו-דגירה בטמפרטורה המומלצת של היצרן עבור 1-3 h.
3. המחש את מוצרי ה-PCR המתעכל ב-1.5% (w/v) EtBr agarose ג'ל אלקטרופורםב 80-100 V עבור 40 דקות. אם שילוב מוצלח של ה-ssODN התרחש, רצף מוטציות ספציפיות באמצעות תחל מקונן.

תוצאות

דור של gRNAs והקרנה עבור אינדלים

כל gRNA ישוכפל לתוך וקטור פלמיד וביטא באמצעות מקדם U6. האנזים AflII הגבלה משמש כדי לאתר את הפלסמיד (addgene #41824) והוא ממוקם לאחר מקדם U6. הלהקה 100 bp שנוצר לאחר הריפוי של 2 60 bp oligos משוכפל לתוך הביטוי gRNA ביטוי באמצעות הרכבה DNA. לאחר הפקת פלמידים של...

Discussion

בפרוטוקול זה, את השימוש CRISPR-CAS9 יחד עם שני ssODN לתקן תבניות כדי לייצר heterozygous מסוימים או שינויים הגנום homozygous מוצג בתאי גזע האדם pluriפוטנטי. שיטה זו הביאה את הדור המצליח של קווי התא isogenic המבטא heterozygous גנומית שינויים עם יעילות קרוב ל 10%. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה עבור ESCs האנושית ו iPSCs גדל על MEFs הקר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Corning	352235
6-well polystyrene tissue culture dishes	Corning	353046
AflII restriction endonuclease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector	Addgene	44719
PCR strip tubes	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells	Takara	636763
SOC medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzyme	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254