JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.

Abstract

תאי גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הקרדיוציטים (iPSC-CMs) לספק מקור אנושי יקר ללמוד את המדע הבסיסי של סידן (Ca2 +) טיפול מסלולים איתות, כמו גם הקרנות התפוקה גבוהה הקרנת תרופות רעילות. להלן, אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיות המשמשות להפקת iPSC-CMs באיכות גבוהה שיכול לשחזר בעקביות מאפיינים מולקולריים ופונקציונליים על פני קווי תאים שונים. בנוסף, מתוארת שיטה להעריך באופן אמין את האפיון הפונקציונלי שלהם באמצעות הערכה של מאפייני Ca2 + טיפול. חמצן נמוך (O2) התנאים, בחירת לקטט, וזמן ממושך בתרבות לייצר טוהר גבוהה ואיכות גבוהה, המוח כמו הקרדיוציטים. בדומה מבודד עכברוש מבוגר חולדה (ARCMs), 3-חודש-התערוכה iPSC-CMs גבוה יותר Ca2 + משרעת, שיעור מהיר יותר של ca2 + קליטה (ריקבון-טאו), ו תגובה lusitropic חיובית β-אדראררגיות גירוי לעומת יום 30 ipsc-CMs. האסטרטגיה היא טכנית פשוטה, חסכונית, והיא מתוכמת. הוא מספק פלטפורמה חזקה למודל לב מחלות ועבור הקרנת סמים בקנה מידה גדול כדי למקד Ca2 + טיפול בחלבונים.

Introduction

תא גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הגוף הנגזר (ipsc-CMs) הם פלטפורמה מבוססת אדם אטרקטיבי למודל מגוון גדול של מחלות לב מבחנה1,2,3,4,5,6,7,8. יתר על כן, ipsc-CMs יכול לשמש לחיזוי של תגובות המטופל לתרופות הרומן או הקיים, כדי למסך תרכובות פגע, ולפתח תרופות אישיות חדשה בהתאמה אישית9,10. עם זאת, למרות ההתקדמות המשמעותית, יש לשקול מספר מגבלות ואתגרים בעת שימוש ב-iPSC-CMs11. כתוצאה מכך, שיטות לשיפור פרוטוקולי בידול הלב, כדי לשפר את היעילות ipsc-CMs והתבגרות, וכלה לייצר מיני קרדיולוגית מסוימים (חדרית, פרפור, ו nodal) כבר למדו והובילו לאסטרטגיות רבות בתרבות כדי להתגבר על מכשולים אלה12,13,14,15.

על אף החוסן של פרוטוקולים אלה, הדאגה העיקרית לשימוש iPSC-CMs היא מהווה את האפשרות של הליכים ארוכים ומורכבים כדי להשיג קרדיוומיציטים באיכות גבוהה שיכול להבטיח ביצועים זהה ותוצאות לאורך זמן. הנוזפות היא קריטית לא רק בעת השוואת קווי התא עם רקעים גנטיים שונים, אלא גם כאשר חוזר השוואות סלולר ומולקולרי של אותו קו התא. שינויים בתאים, כגון הבדלים היטב בצפיפות iPSCs, עשויים להשפיע על בידול הלב, הפקת תשואה נמוכה ומנוציטים באיכות ירודה. תאים אלה עדיין יכול לשמש כדי לבצע ניסויים שאינם דורשים אוכלוסייה טהורה של CMs (למשל, בעת ביצוע Ca2 + ארעי מדידות). ואכן, בעת ביצוע ניתוח אלקטרולוגי, אי-CMs לא יכה, לא באופן ספונטני ולא מתחת לגירוי חשמלי, כך יהיה קל להוציא אותם מהניתוח. עם זאת, בגלל האיכות הירודה, iPSC-CMs יכול להראות מאפיינים אלקטרופיסיולוגיים שונה (למשל, Ca לא סדיר2 + ארעי, נמוך ca2 + משרעת) אשר אינם בשל האיפור הגנטי שלהם. לכן, במיוחד כאשר באמצעות iPSC-CMs למודל לב מחלות, חשוב לא לבלבל את התוצאות מ-CM באיכות נמוכה עם פנוטיפים למחלה. תהליכי הקרנה והדרה מזהירים נדרשים לפני שממשיכים ללמוד אלקטרופיסיולוגיים.

שיטה זו כוללת פרוטוקולים ממוטבים להפקת שימוש בטוהר גבוה ובאיכות גבוהה ולהערכת תפקידם על-ידי ביצוע מדידות של Ca2 + ארעי באמצעות מערכת הפקת סידן וניתוח. טכניקה זו היא פשוטה, אך רבת עוצמה, דרך להבדיל בין יעילות גבוהה לבין יעילות נמוכה ההכנות iPSC-CM ולספק אפיון מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי של iPSC-CMs אנושי.

Protocol

הניסויים בעזרת קרדיוקרדיציטים מבוגרים במחקר זה נערכו עם מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש (IACUC) פרוטוקולים של בית הספר Icahn לרפואה בהר סיני. הקרדיוציטים הבוגרים היו מבודדים מהלבבות העכברים של ספראג באמצעות השיטה המבוססת על לאנגדורף כמתואר בעבר16.

1. הכנת מדיה

  1. הכינו מדיית היפאנט.
    1. משקל התוספת ואת המדיום הבסיס לטמפרטורת החדר (RT). ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 400 ml של המדיום בסיס 100 mL של תוספת ומסנן באמצעות 0.22 יקרומטר מונחה ואקום מסנן. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
  2. הכן RPMI + B27.
    1. השפה הB27 ואת תוסף הבסיס (RPMI 1640) ל-RT. ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 490 ml של המדיום הבזליים 10 מ ל של תוספת 50x ומסנן באמצעות 0.22 יקרומטר ואקום מונחה מסנן. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
  3. הכינו RPMI + B27 (-) אינסולין.
    1. השפה הB27 (-) תוספת אינסולין והמדיום הבסיס (RPMI 1640) ל-RT. ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 490 ml של המדיום הבזליים 10 מ ל של תוספת 50x ומסנן באמצעות 0.22 יקרומטר ואקום מונחה מסנן. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
  4. הכנת מדיית בחירה (RPMI (-) גלוקוז + B27 + לקטט).
    1. השפה B27 תוסף ואת המדיום הבסיס (RPMI 1640 (-) גלוקוז) כדי RT. ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 490 mL של המדיום הבזליים 10 מ ל של תוספת 50x, להוסיף 4 מ"מ נתרן לקטט היוו מים סטרילי, ומסנן באמצעות מסנן מונחה ואקום 0.22 יקרומטר. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
  5. . הכן RPMI 20
    1. המדיום מדיום בסיס (RPMI 1640) כדי RT. לערבב סרום העוברי (FBS) (20% ריכוז סופי) ו-RPMI. סנן באמצעות מסנן מונחה ואקום 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c. לפני שימוש בשפה מעורפלת.
  6. הכן מדיה על ידי הוספת Rho משויך, מתפתל-סליל המכילים חלבון קינאז (ROCK) מעכב (2 הריכוז הסופי μM) כדי מדיה היפנוsc.
  7. להכין D0 מדיה על ידי הוספת GSK-3 מעכב, CHIR 99021 כדי RPMI + B27 (-) אינסולין מדיה (10 μM הסופי).
  8. להכין D3 ו-D4 מדיה על ידי ערבוב RPMI + B27 (-) אינסולין מדיה עם IWR-1 (5 μM הסופי).
    הערה: D1 ו-D5 מדיה היוו RPMI + B27 (-) אינסולין. D7 מדיה היא היווה של RPMI + B27.
  9. הכנת מאגר חסימת (2% בסרום של שור), 2% FBS, 0.05% NP-40 במלח פוספט באגירה [PBS]): בצינור שפופרת משנת 50 המאה mL, מוסיפים 1 גרם של BSA, 1 מ ל של FBS, 49 mL של PBS, ו-250 μL של NP-40. מערבבים עד התפרקה לחלוטין.

2. הכנת תא גזע מתחלקים האדם (hESC)-מטריצות מצופה מטריקס צלחות כיסוי

הערה: בצע את כל השלבים תחת מכסה התרבות רקמה מחוטאת.

  1. הפשרת מניות hESC מוסמך פתרון בלילה על הקרח ב 4 ° c. עיין בגיליון מפרט המוצר כדי לקבוע אמצעי אחסון מתאימים מכיוון שפעולה זו עשויה להשתנות בהתאם למניה. לאחסן אלה מובחנות ב-20 ° צ' בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  2. כדי להשתמש במטריקס לציפוי לוחות או כיסויים לזכוכית, הפשרת תחילה מטריצה מוסמכת של hESC ב -4 ° c עבור 30 דקות.
  3. מחלק 24 מ"ל של בינונית משתנה הנשר של דולבקה (DMEM): תערובת מזינים F-12 (DMEM/F: 12) מדיה לתוך צינורית חרוט 50 mL.
  4. ערבבו את הג/F: 12 מדיה עם פיפטה זכוכית 2 מ ל על מנת לצנן את המשטח של הפיפטה.
  5. באמצעות אותו הצינור, לקחת בערך 500-700 ליטר μL של הגברת הקרה/F: 12 ולערבב עם מטריצה hESC מוסמך בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה עצמה.
  6. פעם אחת מעורבב כראוי, להעביר את הפתרון לצינורית חרוט 50 mL המכילה את ההצטננות/F הקרה: 12 ו לערבב שוב.
  7. לצלחת מתקן 6 היטב, להוסיף 1 mL של תערובת זו לכל טוב. ודא כי הבאר מכוסה כולו. השאירו את הצלחות ב-RT מתחת למכסה התרבות של הרקמה לפחות 30 דקות. אם תרצה, לאחסן ב 4 ° c מיד לאחר הציפוי עד 1 שבוע ו equi, עד RT עבור 30 דקות לפני השימוש.
  8. על מנת להשתמש בלוחות, מאחד את המטריצה ומחליף אותם באמצעי התקשורת המתאימים. . השתמש באופן מיידי
  9. אחסן את שמיכות הזכוכית בסביבה סטרילית (למשל, בתוך מכסה של תרבות רקמה סטרילית).
  10. לפני ציפוי, לנגב כל שמיכות יחיד עם 70% אתנול. ברגע שהוא יבש, מניחים אותו בתוך הבאר של צלחת 6 היטב סטרילי.
  11. קח 250 ליטר μL של פתרון מטריצה hESC-מוסמך ובזהירות לוותר אותו ישירות על מרכז שמיכות זכוכית. השאר את הכיסויים ב-RT מתחת למכסה המנוע של הרקמה לפחות 30 דקות לפני השימוש.

3. הכנת מולקולות קטנות

הערה: מרכיבים מחדש את כל המולקולות הקטנות ו-Wnt מאפטורים ב DMSO אלא אם נכתב אחרת.

  1. הכינו 10 מ"מ מילימטר של 25 μL כל אחד IWR-1 ו-CHIR 99021 ולאחסן ב-20 ° c.
  2. מרכיבים מחדש 10 מ"מ מ50 μL כל אחד מהטיזוויבין (מעכב רוק) ומאחסן ב-20 ° c.

4. תחזוקה והפסנת iPSCs

הערה: בצע את כל השלבים הבאים תחת המכסה התרבותי של הרקמה הסטרילית.

  1. שמרו על iPSCs בסטנדרט 6 צלחות ובצעו את כל הצעדים בתנאים סטריליים. שמור על התאים עם 2 מ ל של מדיית היפנוסק לכל היותר. . להחליף את התקשורת כל יום לשמור על התאים ב 37 ° c, 6% O2, 5% CO2. מעבר בין התאים כאשר הם בין 70 ל-80% שוטפת.
  2. השפה הPBS ללא Ca2 + ו Mg2 + כדי RT.
  3. כדי להתחיל את תהליך ההתיישנות, להוסיף 1 מ ל של PBS ללא Ca2 + ו-Mg2 + אל הבאר שצריך להיות מיושן. מודקון ב RT עבור 7-10 דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי הטיפול PBS לא הביא את הדיסוציאציה המלאה של המונאולייר.
  4. הסר את PBS והחלף ב-1 מ ל של מדיית הפאסאייג. השתמש מרים תא כדי לגרד בעדינות ולהרים את התאים מהמשטח של הבאר.
  5. מכנית הנתק את התאים באמצעות צינורות זכוכית סטרילית 2 mL. חזור על הפעולה עד שהתאים מושקלים באופן שווה למושבות קטנות כאשר הוא נצפה תחת מיקרוסקופ.
  6. לאחר התאים כבר הנתק מספיק, להוסיף 5 מ ל של מדיה passaging לפצל את התאים 1:6. התאם את כמות מדיית הפאסגיול שתתווסף כדי להתאים ליחס הפיצול המועדף.
  7. מנושף את מטריצת hESC-מוסמך מהצלחת hESC-מצופה מטריקס ולהחליף עם 1 מ ל של מדיה passaging לכל טוב. הוסף 1 mL של תאים שאינם מתאיהם בו.

5. קרדיוציט בידול

  1. השתמשו בקווי היפנואס שהוקמו היטב (יותר מ -20 מעברים) ומציגים מורפולוגיה אחידה לפני תחילת הבידול בהלב.
  2. ודא שiPSCs הם בערך 70-80% שוטף.
  3. שטוף את התאים 1x ב-PBS ללא Ca2 + ו-Mg2 +.
  4. הוסף 2 מ ל של D0 מדיה (שלב 1.7) לכל טוב ולהעביר את התאים בחזרה לחממה.
  5. לאחר 24 שעות, החלף עם 3 מ ל של D1 מדיה לכל טוב עבור 48 h.
  6. ביום 3, להחליף את המדיה עם 2 מ ל של D3 מדיה לכל טוב. חזור על הפעולה עם מדיה D4 ביום 4.
  7. ביום 5, החלף את המדיה עם 3 מ ל של D5 מדיה לבאר.
  8. ביום 7, להחליף את המדיה עם 3 מ ל של D7 מדיה לכל טוב ולהעביר לאינקובטור עם 37 ° צ', 5% CO2, ו-2 הריכוז הרגיל O. החלף את המדיה D7 (RPMI + B27) כל יומיים.

6. נוהל בחירה ו-iPSC-ס מ לדיסוציאציה

  1. עשרה ימים לפני ביצוע המידות של Ca2 + ארעי או ניתוח פונקציונלי כלשהו, החלף את המדיה RPMI + B27 עם 3 מ ל של מדיית בחירה לכל טוב עבור 48 h.
  2. החלף את המדיה עם 3 מ ל של מדיית בחירה עבור 48 שעות נוספות.
  3. החלף את המדיה עם 2 מ ל של RPMI + B27 מדיה לכל טוב עבור 24 שעות.
  4. תקן מעיל 6 טוב לוחות כמתואר בסעיף 2.
  5. הוסף 1 מ ל של סטרילי 0.25% טריפסין עם EDTA לכל טוב. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 5 דקות.
  6. באמצעות 1,000 μL הצינורות, מכנית הנתק את התאים כך תאים בודדים ניתן לראות כאשר נצפתה תחת מיקרוסקופ.
  7. העבר את התאים לצינור חרוטי מעוקר של 15 מ"ל והוסף 2 מ ל של RPMI 20 מדיה לבאר. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 800 x g.
  8. מריף את הסופר ומשהה מחדש את התאים במדיה RPMI + B27. מתיף את המטריצה המאושרת של hESC מן הצלחות ולהחליף עם 1 מ ל של RPMI + B27 מדיה.
  9. שימוש בטיפ 1,000 mL, הנתק מכנית את הגלולה התא עד הפתרון מופיע הומוגנית.
  10. העברה בערך 500,000 תאים לכל היותר. העברה לחממה עבור 24 שעות.
  11. החלף את המדיה עם 3 מ ל של מדיית בחירה עבור 48 h.
  12. החלף את המדיה עם 3 מ ל של RPMI + B27 לכל טוב. שמור על תאים ב-D7 media (RPMI + B2 החלפת מדיה כל יומיים עד שהוא מוכן לניתוח פונקציונלי.

7. הכנת iPSC-CMs לצורך זרימה הציטומה

  1. לאחר התאים הם בגיל הרצוי ועברו בחירה מטבולית (סעיף 6), לשטוף את התאים עם PBS ללא Ca2 + ו-Mg2 +.
  2. הוסיפו כ-mL ל-0.25% ומכאן ב-37 ° c למשך 5/7 דקות.
  3. פיפטה את התערובת 5-10x עם טיפ P1000 כדי singularize את התאים, ולהעביר לצינור 15 מ ל המכיל 2 מ ל של RPMI 20.
  4. לסובב את התאים ב 600 x g עבור 5 דקות.
  5. הוסף 100 μL של פתרון קיבעון (4% בתחתית) אל הגלולה התא. הוסף את הפתרון dropwise עם רציפה, רך ומבוקר ולאחר מכן להגדיר על קרח עבור 15 דקות.
  6. הוסף 1.5 מ ל של PBS. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ומכה את סופרנטאנט.
  7. עבור כל ניסוי, לכלול שליטה בלתי מוכתם אחד למצב קיבעון/חדירות.
  8. השהה תאים מחדש ב-500 μL של פתרון חסימה (2% FBS/2% BSA ב-PBS עם 0.1% NP-40) עבור 30 דקות ב-RT.
  9. מבלי להסיר את הפתרון חסימה, להוסיף את הנוגדן העיקרי MLC2V/MLC2A (5 מ"ג/mL), ו-דגירה 45 דקות ב RT.
  10. שטוף באמצעות מאגר חסימות. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והפתרון מרוב.
  11. הוסף נוגדן משני אלקסה Fluor 555/488 (1:750) מדולל במאגר חסימת עבור 45 דקות ב RT או לילה ב 4 ° c.
  12. הוסף 1.5 מ ל של PBS. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והפתרון מרוב.
  13. השהה תאים מחדש ב-250/300 μL של PBS. השתמש בפיפטה P1000 כדי לשלול את התאים.
  14. להכין צינורות התחתונה עגול עם כיפה 35 יקרומטר ניילון מסננת תא כובע. טרום להרטיב את מסננת התא עם 50 μL של PBS ולהגדיר את השפופרת על הקרח.
  15. העבר את הפתרון עם התאים המצטברים לצינורות התחתונים העגולים עם כמוסות המסננת של התא. אפשר לפתרון התאים לנקז באופן טבעי או להקיש בתחתית הצינורית על משטח שטוח, בהתאם לצורך, כדי להבטיח ניקוז מלא ואיסוף של תאים לתוך הצינור. ודא שאתה מחזיר את השפופרת חזרה לקרח בהקדם האפשרי.
  16. לשטוף את מסננת התא עם 250 μL של PBS כדי לשחזר את כל התאים שיורית.
  17. לשמור על הצינורות על הקרח לכסות עם רדיד אלומיניום עד הזרימה cy, try ניתוח.

8. ציפוי מחליק על כיסוי זכוכית

הערה: בצע את כל השלבים בסביבה סטרילית.

  1. הכן את שמיכות הזכוכית כפי שמתואר בשלבים 2.10 ו 2.11.
  2. לאחר iPSC-CMs נבחרו והם של הגיל הרצוי, בצע את שלבים 6.5-6.7 כדי לנתק את iPSC-CMs.
  3. מריף את supernatant ולהשעות מחדש את התאים בכמות מספקת של RPMI 20 מדיה יש בערך 300,000 תאים לכל 250 μL.
  4. באמצעות צינורות זכוכית 2 mL, מכנית הנתק את הגלולה התא עד הפתרון מופיע הומוגנית.
  5. . מהמטריקס המוסמך מהכיסויים
  6. שימוש בפיפטה 1000 μL, מערבבים ומושכים 250 μL של הפתרון מצינור השפופרת החרוט 15 מ"ל.
  7. לאט לוותר על 250 μL של הפתרון על שמיכות זכוכית, לוקח טיפול נוסף רק להוסיף לאזור שבו ציפוי מטריצה hESC מוסמך הוא נוכח.
  8. העבר בזהירות לחממה ולעזוב את הלילה, מקפיד לא ללחוץ או לפזר את התאים על הכיסויים. למחרת בבוקר, להוסיף בעדינות 2 מ ל D7 (RPMI + B27) מדיה לכל טוב עם שמיכות. שינוי המדיה לאחר 24 שעות. ושני ימים לאחר מכן

9. תיקון תאים

  1. ודא שסכום הולם של PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + הוא שווה ל-4 ° c.
  2. הכן 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון השני) פתרון מדולל ב-PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + ו-משקל 4 ° c.
  3. לאחר iPSC-CMs הם בגיל המתאים, עברו בחירה מטבולית (סעיף 6), והיה מצופה שמיכות (סעיף 8), לשטוף את התאים 3x עם 1 מ ל של PBS קר עם Ca2 + ו-Mg2 + לכל טוב.
  4. הוסף 1 מ ל של קר 4% בתחתית ולהשאיר את התאים בשעה RT מתחת למכסה המנוע עבור 15 דקות.
  5. לשטוף את התאים עם PBS קר כדי להסיר את העודף בלגון.
  6. הוסף 2 מ ל של PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + ואחסן ב 4 ° c.

10. כתמים אימונולואורוסנס

  1. הסר את ה-PBS מהתאים הקבועים והוסף 1 mL של מאגר חסימה. . מודטה בשביל 1 h ב-RT
  2. הסר מאגר חוסם והוסף את הנוגדן העיקרי (5 מ"ג/mL) מדולל במאגר חסימת. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
  3. שטוף 3x ב-PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + עבור 5 דקות כל אחד.
  4. הוסף נוגדן משני מדולל במאגר חסימת 1:1000.
  5. לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ו-דגירה עבור 45 דקות ב RT. לשמור על רדיד אלומיניום עבור השלבים הבאים.
  6. שטוף 3x ב-PBS עם Ca2 + ו-Mg2 +, 5 דקות כל אחד.
  7. הוסף כמות מספקת של פתרון עבודה DAPI כדי לכסות לחלוטין את התאים ו-דגירה ב-RT עבור 10 דקות.
  8. לשטוף את המדגם ביסודיות עם PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + כדי להסיר dapi עודף.
  9. לקחת שקופיות זכוכית חדשה ולהוסיף טיפה של מדיה להרכבה באמצע. השתמש בטפטפת כדי להפיץ באופן שווה את המדיה ההרכבה. שים את הכיסויים עם התאים. עם הפנים למטה על השקופיות
    הערה: ניתן לאחסן תאים במשך 30 יום אם הם מוגנים מפני האור.

11. הערכה של Ca התאיים2 + ארעיות

  1. לאחר iPSC-CMs הם לפחות 3 חודשים, עברו בחירה מטבולית (סעיף 6), והיה מצופה על כיסוי, להתייחס אליהם עם 2 μL של Fura-2, AM (ריכוז סופי: 1 μM) ו-דגירה ב 37 ° c עבור 10 דקות.
    הערה: Fura-2 הוא רגיש לאור. בצע את כל הליכי הטעינה והניסויים בחשכה.
  2. הכינו את מערכת הטיפול בסידן ובניתוח.
    1. הפעלה של המערכת מבטיחה שנורת הקשת תופעל (איור 1B).
    2. הניחו את החדר על המערכת וחברו את הצינורות מהמשאבה אל השקע והשקעים המתאימים והחוט החשמלי מהגירוי אל החדר כפי שמוצג באיור 1ג.
    3. ממלאים את צינור ההיתוך הזורם דרך התנור הפנימי flu, עם 37 ° c הפתרון של מראש Tyrode.
    4. להתאים את המצלמה ואת ממדי הצמצם מסגור כדי למזער את אזור הרקע.
  3. שמיכות זכוכית עם iPSC-CMs לתוך החדר ולחגור.
  4. הוסף 500 μL של הפתרון של Tyrode ישירות על גבי שמיכות זכוכית הידק בעדינות ולהתחיל לעשות את החדר (1.5 mL/min) עם הפתרון של Tyrode.
  5. Pace iPSC-CMs עם גירוי שדה 1 הרץ באמצעות גירוי חשמלי (10 V, 4 אלפיות הראשונה).
  6. דגירה iPSC-CMs בחדר עם גירוי לפחות 3 עד 5 דקות עבור התאים כדי לשטוף את הצבע Fura-2 להסתגל לסביבה לשטוף את צבע הפלורסנט.
  7. כוונן את חלון הצפייה לאזור העליון השמאלי של שמיכות הזכוכית.
  8. . התחל בהקלטה
  9. לאחר איסוף זרם עקבי של 5 עד 10 פסגות, לחץ על השהה כדי להפסיק את ההקלטה באופן זמני.
  10. להבטיח כי לא המיקוד או הממדים של חלון הצפייה משתנים, להעביר את הבמה של המיקרוסקופ אל האזור הסמוך, נע לעבר הקצה הנגדי, ולחדש את ההקלטה.
  11. חזור על שלבים 11.9 ו 11.10 לסרוק על פני שמיכות, בתחילה מעבר שמאלה, ולאחר מכן כלפי מטה בצורה זיג זג כדי לכסות את כל אזור coverslip. זה מורכב מ-80 מדידות לכל שמיכות.
    הערה: הגבל את זמן המדידה הכולל ל-10 דקות כגורמים משניים גורמים לירידה ב-Ca2 + ארעי.
  12. לאחר הרכישה של Ca2 + טרנסיאנטים, יש לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח העקבות הפלואורסצנטית לפי הוראות היצרן.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר באיור 1A שנוצר הקרדיוציטים טהור אשר לרכוש שיטת למבוגרים, כמו פניטיפ עם הזמן בתרבות. כפי שמוערך על ידי immunofluorescence כתמים עבור הפרפור ואת הרירן החדרית שרשרת האור הרגולציה 2 איזופורמים (MLC2A ו MLC2V, בהתאמה), רוב התאים שנוצר על ידי פרוטוקול זה היו MLC2A-חיוביים...

Discussion

שלבים קריטיים לשימוש ב-iPSC-CMs האנושי כמודלים ניסיוניים הם: 1) היוצרים הקרדיוציטים באיכות גבוהה (CMs) שיכולים להבטיח את הביצועים העקביים ואת התוצאות הנוזניות; 2) המאפשר לתאים להבשיל בתרבות לפחות 90 ימים כדי להעריך כראוי את פנוטיפ שלהם; 3) ביצוע מחקרים אלקטרולוגיים, למשל סידן (Ca2 +) מדידות ארעי...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המענק AHA מדען פיתוח מענק 17SDG33700093 (F.S.); פרס מKL2 של הר סיני לחקר המחקר הקליני והטרנסג KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ו AHA 18TPA34170460 (סי סי).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonalSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouseInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbitInvitrogenA21428
B27 SupplementGibco17504-044
B27(-) insulin SupplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI nuclear stainThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM HepesGibco11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 wellCorning353046
Fluidic inline heaterLive Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-qualified matrixCorning354277Matrigel Matrix
hPSC mediaGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Live cell imaging chamberLive Cell InstrumentEC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse AntibodySynaptic Systems311011
Myocyte calcium and contractility systemIonoptixISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES MembraneThermoFisher124-0045
PBS with Calcium and MagnesiumCorning21-030-CV
PBS without Calcium and MagensiumCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Sodium L-lactateSigma AldrichL7022
StemFlex SupplementGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher25200056
Tyrode's solutionBoston BioproductsBSS-355wAdjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

References

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155iPSC CMsiPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved