הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

Summary

אנו מתארים טכניקות לבידול אינדוקציה של שני קווי אפיתל השד, HC11 ו EpH4. בעוד ששניהם דורשים סרום עגל עוברי, אינסולין, ו פרולקטין לייצר חלבונים חלב, EpH4 תאים יכולים להבדיל באופן מלא לתוך ממוגרפיה בתרבות תלת ממדית. המודלים המשלימים הללו שימושיים למחקרים של הneoplasia בידול ומדידה.

Abstract

קדהרנס ממלאים תפקיד חשוב בוויסות בידול התא וכן בneoplasia. כאן אנו מתארים את המקורות ואת השיטות של אינדוקציה של הבידול של שני העכבר שורות האפיתל התאים, HC11 ו EpH4, ואת השימוש שלהם ללמוד בשלבים משלימים של התפתחות בלוטת החלב וטרנספורמציה נאופלסטית.

שד HC11 העכבר קו האפיתל מקורו בלוטת החלב של עכבר Balb/c בהריון. זה מבדיל כאשר גדל למפגש מחובר משטח צלחת פטרי פלסטיק בינוני המכיל סרום עגל עוברי ו- Hydrocortisone, אניNsulin ו PROLACTIN (מדיום היפ). בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר את החלבונים בחלב β-קזאין, חלבון חומצי מי גבינה (WAP), בדומה לתאי הנקה המניקה התאים, וצורות בלוטת החלב בצורת בלוטה הנקרא "כיפות".

קו התא EpH4 נגזר באופן ספונטני בלוטת החלב של העכבר תאים אפיתל מבודדים מעכבר Balb/c בהריון. שלא כמו HC11, תאים EpH4 יכולים להבדיל באופן מלא לתוך spheroids (המכונה גם ממוגרפיה) כאשר התרבות תחת תלת מימדי (3D) תנאי גדילה במדיום HIP. תאים הם טריסינטזציה, התלויה ב 20% מטריצה המורכבת מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי אנגלברב-הולם-נחיל (EHS) עכבר בתאי סרקומה, מצופה על גבי שכבה של ציפוי מטריצה מרוכזת צלחת פטרי או צלחת multiwell יטב, מכוסה בשכבה של 10% מטריקס מכיל מדיום הירך. בתנאים אלה, תאי EpH4 מהווים מספרואידים חלולים המוצגים קוטביות-בסיס, לומן חלול, ומייצרים β-קזאין ו-WAP.

באמצעות טכניקות אלו, התוצאות שלנו הראו כי עוצמת האות של קדהרין/מירוץ היא קריטית עבור הבידול של תאים HC11. בעוד Rac1 הוא הכרחי עבור בידול ורמות נמוכות של מירוץ המופעל^{רובוטית v12} להגדיל את הבידול, מירוץ גבוה^{רובוטית v12} רמות לחסום בידול תוך גרימת neoplasia. לעומת זאת, תאי EpH4 מייצגים שלב מוקדם יותר בידול האפיתל הפטמות, אשר מעוכב על ידי רמות נמוכות אפילו של^{מרובוטית v12}מירוץ.

Introduction

ברקמות רגילות או גידולים, לתאים יש הזדמנויות נרחבות הדבקה לשכניהם בארגון תלת מימדי, וזה מחקה בתרבות על ידי צמיחת תאים בצפיפות גבוהה. הדבקה תא לתא מתווכת בעיקר באמצעות קולטני קדהרין, המגדירים את ארכיטקטורת התאים והרקמה. מעניין, זה הוכיח לאחרונה כי cadherins גם לשחק תפקיד רב עוצמה התמרה האות, במיוחד הישרדות איתות¹. אופן פרדוקסאלי, חלק האותות האלה תא לתא הדבקה הנובע cadherins נמצאו לאחרונה להיות משותפים על ידי בידול וגם neoplasia². כאן, אנו מתארים שיטות של אינדוקציה והערכה של בידול שני סוגים של הנציג של שד העכבר האפיתל קווים, HC11 ו EpH4.

שד HC11 העכבר האפיתל קו התאים יכול לספק מודל שימושי למחקר של בידול התא אפיתל. תאי HC11 הם קו שנגזר באמצעות פסיקים-1D, שמקורם בבלוטת החלב של עכבר באמצע ההיריון בגודל Balb/c³. בניגוד אחרים פסיקים-1D שיבוטים נגזרים, HC11 שיבוט אין דרישה לשימוש באופן אקסוגנטי מטריצה מוסף או טיפוח עם סוגי תאים אחרים עבור האינדוקציה מחוץ לשני של הגן האנדוגניים β-קזאין על ידי הורמונים lactogenic³. קו תא זה נעשה שימוש נרחב במחקרים בידול כי הוא שמרו מאפיינים חשובים של אפיתל הפטמות נורמלי: HC11 תאים יכול באופן חלקי ליצור מחדש את האפיתל ductal בתוך משטח שומן החלב העבה⁴. יתר על כן, הם יכולים להבדיל בתרבות דו-ממדית (2d) כאשר גדל למפגש המצורפת משטח צלחת פטרי פלסטיק בנוכחות של סטרואידים כגון Hydrocortisone או דקאמתאסone, בנוסף אניnsulin ו Prolactin (היפ בינוני) חסר גורם גידול עוריות (egf), מעכב של בידול^5,6,7. בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר חלבונים חלב כגון β-קזאין ו-WAP, אשר מ על ידי בלוק המערבי בתוך 4 ימים לאחר האינדוקציה. באותו זמן, חלק של תאים HC11 צורות בלוטת הפטמות בצורת בלוטה הנקרא "כיפות" באופן סטוכסטי. כיפות גלויות 4 – 5 ימים לאחר האינדוקציה ולהגדיל בהדרגה בגודל של עד היום 10, במקביל עם גידול בייצור β-קזאין⁸. מעניין, HC11 תאים בעלי מוטציה p53⁹, ולכן מייצגים מדינה preneoplastic. מסיבה זו, המודל HC11 מתאים באופן אידיאלי כדי לחקור רשתות איתות של בידול בשילוב עם neoplasia באותה מערכת התא.

EpH4 תאים, נגזרת של התאים IM-2, הם קו תא התאים המקורי נגזר במקור באופן ספונטני בלוטת החלב העכבר תאים אפיתל בודד מ באמצע בהריון Balb/c העכבר¹⁰. תאים EpH4 טופס אפיתל מונאולאיירס בתרבות 2D, אבל לא להבדיל לתוך^{מבנים כמו בלוטות 10,11}. עם זאת, בעקבות צמיחה תלת-ממדית בחומר המורכב מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי תאים EHS העכבר סרקומה¹² (EHS מטריקס, מטריקס, או מטריצות, ראה טבלה של חומרים), בנוסף גירוי עם היפ, EpH4 תאים יכול ללכוד את השלבים הראשוניים של בלוטת החלב בידול. בתנאים אלה, תאי הEpH4 היוצרים בצורת הספרואידים (המכונים גם ממוגרפיה) המוצגים קוטביות-בסיס ולומן חלול, ומסוגלים לייצר את חלבוני החלב הβ-קזאין ו-WAP, בדומה לתאי האפיתל מניקות. בניגוד HC11 תאים, אשר מובחן, וכמה סמנים mesenchymal מהיר¹³, תאים EpH4 להציג מורפולוגיה גרידא הלומיאל¹⁴. תאים EpH4 גם דיווחו לייצר חלבונים חלב בתרבות דו-ממדית באמצעות גירוי עם דקאמתאס1, אינסולין, ו פרולקטין¹⁵. עם זאת, גישה זו מונע את המחקר של השפעות רגולטוריות המחקים את מיקרואקולוגיה של בלוטת החלב בתרבות תלת-ממדית.

Protocol

1. ציפוי תאים HC11

1. במכסה של זרם למינארי באמצעות טכניקות סטרילי להכין בקבוק עם 50 mL של HC11 cell בינונית: RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 5 μg/mL אינסולין, ו 10 ng/mL EGF (ראה לוח חומרים).
2. צלחת כ 400,000 תאים לכל 3 ס מ צלחת פטרי: לעבור 2 10 ס"מ, 50% confluent מנות פטרי לתוך עשרים 3 ס"מ מנות במדיום HC11. את התאים יש לפזר היטב אך יש להימנע מייבוש.
   1. לשאוב את המדיום לתוך בקבוקון. בעזרת משאבת ואקום
   2. הוסף 250 μL של טריפסין (ראה טבלת חומרים) לכל לוחית 10 ס מ. מערבולת ולהכות את הצלחת מהצדדים תוך שמירה על אופקי כדי לפזר את טריפסין ולהוציא את התאים המחוברים
   3. להתבונן תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה 4x כדי לוודא את התאים החלו להתנתק מהקצוות לפני ליטוף.
   4. מנושף כ 1.5 מ ל של HC11 בינוני בתוך סטרילי, 9 פסטר בגודל אינץ ' ולהתיז אותו אנכית נגד התאים. לסובב את הצלחת פטרי בעוד גמירה להוציא את כל התאים. אתה חייב לעבוד מהר כדי למנוע ייבוש של התאים.
   5. העבר את כל התאים לבקבוק עם HC11 בינוני ומערבולת.
   6. פיפטה 2 מ ל של השעיית תאים בכל צלחת פטרי 3 ס מ. נענע את מנות פטרי בצורה שווה להתפשט. מניחים את התאים ב 37 ° c, 5% חממה₂ .
3. למחרת, או כאשר התאים הם ~ 90-100% confluent, לשאת את המדיום, ולהחליף אותו עם בינוני עם FBS ואינסולין אבל חסר EGF.

2. הבדלה, ניטור וכימות הHC11 תאים

1. לאחר גידול התאים בינונית חסר EGF עבור 24 שעות, להוסיף את המדיום בידול (HIP בינונית) עד עשרה 3 לוחות ס מ: RPMI-1640 שיושלם עם 10% FBS, 1 μg/mL hydrocortisone (ראה טבלת חומרים), 5 Μg/ml אניnsulin ו 5 μg/ml Prolactin (ראה לוח חומרים) עד 10 ימים.
2. לשמור על 10 השני לוחות ס מ כפקדים: שינוי למדיום עם 10% FBS ו 5 μg/mL אינסולין חסר EGF ו היפ.
3. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים שני התאים מטופלים היפ ופקדים. פיפטה בינוני בזהירות כדי לוודא כי תאים לא לנתק.
4. כדי לנטר בידול (כלומר, היווצרות "כיפות"), התבונן בתאים הנמצאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור 1א', פאנל שמאלי). אם התאים הם ביטוי חלבון פלואורסצנטית ירוק (GFP), להתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (עירור = 485/20; פליטה = 530/25; הגדלה 240x; 20x המטרה) (איור 1A, הלוחהימני).
5. כדי לכמת את מידת הבידול, יש לחלץ חלבונים מצלחת פטרי אחת בכל אחד מהתאים והבקרות שטופלו בהיפ-הופ, פעם ביום למשך 10 ימים ולבדוק את הגושים המערביים לβ-קזאין (ראו טבלת חומרים) (איור 1B).
   1. גרד את התאים על הקרח עם 1.5 mL קר פוספט באגירה-מלוחים (PBS) לתוך שפופרת צנטריפוגה מפלסטיק של 1.8 mL.
   2. צנפה את התאים בשעה 350 x, 1 דקות, 4° c.
   3. שטוף במהירות את הגלולה 2x עם הקרח קר הערוץ. . רוקן את כל השאריות
   4. לעשות מאגר פירוק: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 מ"מ ביותר, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"מ Na₄P₂O₇, 1% NP-40, 100 Mm naf, 2 מ"מ Na₃VO₄, 0.5 mm פנילמתילסוליווריד (pmsf), 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml לוקיטין¹⁶. הוסף 100 μL לכל 3 ס מ צלחת פטרי.
   5. להבהיר את הליפוסט על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 10 דקות בקור.
   6. קביעת ריכוז חלבון (ראה טבלת חומרים) וטען 10 – 20 μg של חלבון מכל מדגם ל-10% פוליאקרילאמיד-sds ג'ל.
   7. אלקטרופורזה עבור 15 h ב 45 V, או ב 100 V עבור ~ 2 – 2.5 h.
   8. העברה אל הממברנה התאית או ממברנה PVDF באמצעות מנגנון העברת אלקטרולותרפיה (ראה טבלת חומרים).
   9. בלוק עם החלבון 5% בסרום אלבומין (BSA) ב-Tris מלוחים באגירה עם 0.1% רצף-20 (TBST).
   10. הוסף את הנוגדן העיקרי, עז נגד β-קזאין מדולל 1:2000 או העכבר נגד β אקטין מדולל 1:1000 (ראה טבלת חומרים).
   11. כביסה 3x עם TBST, 5 דקות בכל פעם.
   12. הוסף את הנוגדן המשני, חזרת peroxidase (HRP) מקושרים חמור נגד עז מדולל 1:2500, או HRP מקושרים נגד הסוס נוגדן מדולל 1:10000.
   13. כביסה 3x עם TBST, 5 דקות בכל פעם.
   14. הוסף את הריאגנטים ECL לקרום בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

3. ציפוי וצמיחה תלת-ממדית של תאים EpH4 ב EHS מטריקס

הערה: המטריצה נוזלית בטמפרטורות < 10 ° c ומוצקה בטמפרטורות שלעיל. חנות ב-80 ° c. להפשיר ב 4 ° c בלילה לפני השימוש. טרום לצנן את לוחיות התרבות הרקמה והפיפטה טיפים ב-20 ° c לפני הטיפול ולשמור על מטריקס, צלחות, ו פיפטה טיפים על הקרח כדי למנוע את זה מליצוק.

1. לגדל תאים EpH4 ב 2D ב RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS ו 5 μg/mL אינסולין (EGF אינו נדרש).
2. להכין EpH4 הצמיחה בינונית בתוספת 10% (v/v, 3,500 μL) או 20% (v/v 2,000 μL) מטריצה ב2 50 ליטר חרוטי. לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש.
3. מעיל 10 בארות (1 ס מ² כל אחד) של 24 צלחת עם 150 μl של מטריצה בלתי מדולל. הפיצו את המטריצה בעזרת עצת פיפטה. להימנע מיצירת בועות. הקש בעדינות את צדי הלוח תוך החזקת האופקי כדי להבטיח שמטריצה תהיה מופצת באופן שווה לאורך החלק התחתון של הבאר.
4. מודקת את הצלחת 24 הבאר ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי לאפשר את המטריצה כדי לגבש.
5. טריסילזציה EpH4 תאים כפי שמתואר לעיל עבור HC11 תאים ולספור אותם עם הומוציטוטומטר. העברה 5 x 10⁴ תאים לכל טוב עד 1.5 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה והספין החרוטי ב-250 x g עבור 5 דקות.
6. . ומניחים את השפופרת על הקרח
7. השעיית תאים מחדש ב-350 μL של EpH4 בינוני גדילה שיושלם עם 20% מטריצה באמצעות טיפ 1 מ ל צינור בזמן שמירה על שפופרת חרוט על קרח. להימנע בועות. חשוב להבטיח השעיית תא בודד.
8. לאחר מטריצה השכבה התחתונה התחזק (המטריצה צריכה להופיע שקוף ובהיר בצבע לעומת הציפוי הראשוני של הבארות), להוסיף את 350 μL של השעיית התא לכל מצופה היטב ומקום בחממה₂ שכונתיות ב 37 ° צ' עבור ~ 1 h כדי לאפשר את שכבת מטריצה 20% כדי לחזק.
   1. שימו לב לתאים המיקרוסקושים בניגוד לשלב עם מטרת 4x. על תאים בודדים להיות גלויים.
9. הוסף 200 μL של EpH4 בינונית המכילה 10% מטריצה מעל 350 μL של תאים מושעה 20% מטריצה. מודטה ב 37 ° c.

4. בידול אינדוקציה של תאים EpH4 גדל ב 3D (איור 2)

הערה: מלבד בידול, תאים EpH4 יכול גם לעבור tubulogenesis כאשר מגורה עם HGF (הגידול גורם הצמיחה) בתרבות תלת-ממד. Outgrowths צינורי ניתן לראות לאחר 10 ימים של היפ ו-HGF גירוי.

1. התחל בידול השראה של תאים EpH4 1 יום לאחר ציפוי במטריצה. הסר בזהירות 150 μL של המדיום העליון המכיל 10% מטריצה מבארות באמצעות קצה הצנרת פלסטיק. הוסף 200 μL של EpH4 בינוני המכיל היפ ו 10% מטריצה.
2. החלף את המדיום 10% מטריקס-היפ מדי יומיים עד 10 ימים. לגדול בתאי שליטה באותו 10% בינונית מטריצה ללא HIP.
3. הצגמערך ממוגרפיהלפי ניגוד פאזה (איור 3A, לוח תחתון).

5. tubulogenesis אינדוקציה של תאים EpH4 גדל ב 3D (איור 3A ו 3d)

1. הכינו 24 צלחות ותאים EpH4 לצמיחה במטריצה כמפורט בשלבים 3.1 – 3.9. היום לאחר ציפוי התאים במטריצה, להסיר את 150 μL של EpH4 בינוני המכיל 10% מטריצה מבארות באמצעות קצה הצינורות פלסטיק. הוסף 200 μL של EpH4 בינוני המכיל 10% מטריצה, היפ, ו 20 ng/mL HGF (ראה לוח חומרים).
2. להחליף את 10% מטריקס/היפ/HGF בינונית כל 2 ימים עד 12 – 14 ימים.
3. הצג כדורית מיקרוסקוקטאני באמצעות מטרה 20x או 40x (איור 3a, הלוח הימני).

6. כימות הבידול: בβ המערבי לקזאין

1. פיפטה בזהירות מתוך מדיום 10% מטריקס-היפ מבארות. לשטוף את 20% שכבת מטריצה 2x עם 350 μL של קרח קר PBS. הרוהרואידים צריכים עדיין להיות נוכחים בשכבת המטריקס.
2. הוסף 700 – 1000 μL של PBS קר קרח עם 1 מ"מ חומצה ethilenedimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiia בעדינות לנתק את השכבה התחתונה של 100% מטריקס מבאר עם קצה הצנרת כדי לשחזר spheroids נוכח בשכבה זו. טלטל בעדינות למשך 30 דקות ב-4 ° c.
3. העבר בזהירות את השעיית הספרואיד לשפופרת חרוט. לשטוף את הבארות עם ~ 500 μL של PBS-EDTA לשחזר את הספרואידים שנותרו בבארות ולהוסיף לצינור חרוט.
4. רוק על קרח עבור 30 דקות נוספות. ודא כי המטריצה התפרקה לחלוטין. אם ניתן לראות את הגושים הגלויים של המטריצה, הוסיפו יותר PBS-EDTA או נענעי יותר.
5. צנטריפוגה את הפתרון כדי לצנפה את הspheroids ב 350 x g עבור 5 דקות.
6. מנושף את הסופרנטאנט, מעלה את הספרואידים במאגר לפירוק קרח קר, ומחפש לβ-קזאין, ציקלא D1, וp120RasGAP על ידי המערב כמו בשלב 2.5 מעל¹⁶. כמו נוגדנים העיקרי, להשתמש עז נגד β-קזאין מדולל 1:2000, ארנב אנטי ציקלב D1 מדולל 1:2000, ועכבר anti-p120 מדולל 1:2000. עבור נוגדנים משנית, השתמש HRP החמור מקושרים נגד עז מדולל 1:2500, HRP מקושרים החמור נגד הארנב מדולל 1:2500, ו HRP מקושרים סוס נגד העכבר מדולל 1:10000.

תוצאות

זה זמן רב ידוע כי הבידול של תאים אפיתל ו adipocytes דורש המפגש וההתחייבות של קדהרנים². אנחנו ואחרים הדגמנו שההזיה הסלולרית והאירוסין של E-או N-קדהרין ו קדהרין-11, כפי שהוא מתרחש עם המפגש של תאים מתורבתים, מפעיל עלייה דרמטית בפעילות של מירוץ הקטן gtpases וחילוק התא בקרת חלבון 42 (Cdc42), ותהליך ...

Discussion

התאים הHC11 מתאימים באופן אידיאלי לחקר הבידול בשילוב עם טרנספורמציה נאופלסטית. יתרון נוסף הוא כי תאים HC11 הם בקלות infectable עם מו-MLV מבוססי וקטורים retroviral יעיל לבטא מגוון של גנים. בידינו, תאים EpH4 היו קשים יותר להדביק עם אותו וקטורים retroviral יעיל מאשר HC11².

מגע מתאים לתאים ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution	Bio Rad	1610154	Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibody	rabbit, Santa Cruz	sc-717	Western Blotting
Anti-p120 antibody	mouse, Santa Cruz	sc-373751	Western Blotting
Anti-β actin antibody	mouse, Cell Signalling technology	3700	Western Blotting
Anti-β casein antibody	goat, Santa Cruz Biotechnology	sc-17971	Western Blotting
Aprotinin	Bio Shop	APR600	Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid Solution	Sigma	B9643-1L-KC	Protein Determination
Bovine serum albumin	Bio Shop	ALB007.500	Protein Determination
Clarity Western ECL Substrate	Bio Rad	170-5061	Western Blotting
Copper(II) sulphate	Sigma	C2284-25ML	Protein Determination
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306	Staining
Digitonin	Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd	14952-500	Staining
EDTA	Bio Shop	EDT001.500
Epidermal Growth Factor	Sigma	E9644	Medium for HC11 Cells
Fetal calf serum	PAA	A15-751	Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRP	Santa Cruz	SC-2004	Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinant	Gibco	PHG0321
Hepes	Sigma	7365-45-9	Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRP	Cell Signalling Technology	7076	Western Blotting
Hydrocortisone	Sigma	H0888	HIP Medium
insulin	Sigma	I6634	HIP Medium
Laminar-flow hood	BioGard Hood		Cell Culture
Leupeptin	Bio Shop	LEU001.10	Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)	Corning	CACB 354230
Mouse Anti-Goat HRP	Santa Cruz	sc-8360	Western Blotting
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd	475904-100GM	Staining
Multi-photon confocal microscope	Leica TCS SP2
Na3VO4	Bio Shop	SOV850	Lysis Buffer
Na4P207	Sigma	125F-0262	Lysis Buffer
NaCl	Bio Shop	SOD001.1	Western Blotting
NaF	Fisher Scientific	7681-49-4	Lysis Buffer
Nikon digital Camera	Coolpix 995
Nitrocellulose	Bio Rad	1620112	Western Blotting
NP-40	Sigma	9016-45-9
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	Staining
Phase Contrast Microscope	Olympus IX70		Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluoride	Sigma	329-98-6	Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12V	Addgene	14567
Prolactin	Sigma	L6520	HIP Medium
RPMI-1640	Sigma	R8758	Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35	Sarstedt	83.3900.	Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 well	Sarstedt	83.1836.300	Cell Culture
Transfer Apparatus	CBS Scientific Co	EBU-302	Western Blotting
Tris Acetate	Bio Shop	TRA222.500	Western Blotting
Trypsin	Sigma	9002-07-7.	Cell Culture
Tween-20	Bio Shop	TWN510.500	Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis System	CBS Scientific Co	MGV-202-33	Western Blotting