תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

Summary

כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.

Abstract

במהלך התהליך שיתוף תרבות אמבה, יותר מווירוס אחד יכול להיות מבודד באר אחת. בעבר פתרנו את הבעיה הזאת באמצעות דילול נקודת הסיום ו/או מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS) שהוחלו על האוכלוסייה הנגיפית. עם זאת, כאשר וירוסים בתערובת יש תכונות דומות מורפולוגיים ואחד הווירוסים מכפיל לאט, הנוכחות של שני וירוסים מתגלה בשלב של הרכבת הגנום והווירוסים לא ניתן להפריד לאפיון נוסף. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו תא בודד השאיפה מיקרו הליך המאפשר הפרדה ושיבוט של וירוסים דומים מאוד. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים כיצד אסטרטגיה חלופית זו אפשרה לנו להפריד את האוכלוסיות הקטנות ויראליות של הST1 וירוס מLCD7, וירוסים ענקיים הגדלים לאט ואינם מובילים לליזה אמבות בהשוואה לליטיק ולגידול מהיר . וירוס פאוסטוו בקרת טוהר הוערך על ידי הגברה גנטית ספציפיים ווירוסים יוצרו לאפיון נוסף.

Introduction

נוקלאוציטופטוצימיק וירוסי DNA גדולים (NCLDV) הם מגוונים ביותר, המוגדרים על ידי ארבע משפחות להדביק eukaryotes¹. הווירוסים הראשונים שתוארו עם גנום מעל 300 kbp היו phyd,כולל הנגיף כלורלה בורסאריה 1 PBCV1². הבידוד והתיאור הראשון של Mimivirus, הראה כי הגודל של וירוסים הוכפל במונחים של גודל של החלקיק (450 ננומטר) ואת אורך הגנום (1.2 Mb)³. מאז, וירוסים ענקיים רבים תוארו, בדרך כלל מבודדים באמצעות שיתוף תרבות אמבה הליך. כמה וירוסים ענקיים עם מורפולוגיות שונות ותכנים גנטיים יכולים להיות מבודדים מתאי האקאטאמבה sp., כולל Marseilleviruses, פנדוראוירוסים, Pithoviruses, Mollivirus ירוס, Cedratviruses, Pacmanvirus ירוס, tupanvirus, ולאחרונה וירוס^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17}. במקביל, הבידוד של vermamoeba vermiformis מותר בידוד ותיאור של וירוסים ענקיים faustovirus, kaumoebavirus, ו orpheovirus^18,19,20. וירוסים ענקיים אחרים היו מבודדים עם protists המארחים שלהם, כגון קפטריה roenbergensis²¹, האוראוקוקוס anopהגאולה²², כריזוכרומלינה אבינה²³, ו bodo saltans . ^{עשרים וארבע} כל הבודדים האלה היו תוצאה של מספר גדל והולך של צוותים העובדים על בידוד והמבוא של עדכוני אסטרטגיית תפוקה גבוהה^25,26,27,28, כגון ה שיפור של מערכת שיתוף התרבות עם השימוש של cy, הזרמת הזרימה.

ב 2016, השתמשנו אסטרטגיה שיוך שיתוף התרבות והזרימה cy, נסה לבודד וירוסים ענקיים²⁷. אסטרטגיה זו פותחה כדי להגדיל את מספר הדגימות מחוסן, כדי לגוון הפרולנים המשמשים כתומך התא, וכדי לזהות במהירות את הליזה של תמיכת התא. המערכת עודכנה על ידי הוספת צעד משלים כדי למנוע זיהוי ראשוני הביולוגיה המולקולרית וזיהוי מהיר של אוכלוסיה נגיפית לא ידוע כמו במקרה של Pacmanvirus²⁹. הזיווגים זרימה cy, לנסות מיון התא מותר להפרדה של תערובת של Mimivirus ו Cedratvirus A11³⁰. עם זאת, נתקלנו מאוחר יותר במגבלות של הפרדה וגילוי של אוכלוסיות משנה ויראליות אלה על ידי זרימה cy, לנסות. לאחר ברצף, כאשר הרכבנו את גנום של faustovirus ST1²⁵ ו faustovirus LCD7 (נתונים שלא פורסמו), אנו מוצאים במפתיע בכל הרכבה שני גנום משלים של שני וירוסים רומן לא מזוהה במסדי נתונים הגנום הציבורי. עם זאת, לא להזרים cy, או מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) הראו כי האמבות היו נגועים על ידי שני וירוסים שונים, ST1 הנגיף ו לחאבפטיב LCD7. עיצבנו מערכות PCR ספציפיות כדי להגביר את הנגיף, את הנגיף ואת סמני הפינווירוס בהתאמה על בסיס הגנום שלהם; המטרה שלנו הייתה לקבל מערכות מבוססות PCR המאפשרות אימות של טוהר הווירוסים המופרדים. עם זאת, דילול הנקודה הסופית והזרימה cyאני try לא הצליחו להפריד ביניהם. הבידוד של האוכלוסייה הנגיפית היחידה הזאת היה קשה משום שלא התאפיין במרכיבים מורפולוגיה ולא מרכיבים מחקריים של אוכלוסיות הנגיף והליפאיות. גילינו רק אוכלוסייה אחת ויראלית על ידי זרימה cy, לנסות בגלל חופפים של שתי האוכלוסיות (נבדק לאחר ההפרדה האפקטיבית). ניסינו להפריד ביניהן באמצעות מיון חלקיקים אחד על 96-צלחות, אבל לא הבחנו בשום השפעות סייטואטמית, ולא גילינו את ההשפעות השליליות של הנגיף או החאפיפטיו על ידי ה-PCR. לבסוף, זה היה רק שילוב של דילול נקודת הקצה ואחריו אמבה מיקרו-שאיפה אחת הזמינה הפרדה של שני אלה נמוכה שפע וירוסים ענקיים מן פאוסטוירוסים. שיטת הפרדה זו היא האובייקט של מאמר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. אמבה התרבות

1. השתמש Vermamoeba vermiformis (זן CDC19) כתמיכה תא.
2. הוסף 30 מ ל של פרוטאז-peptone-שמרים לחלץ-גלוקוז בינוני (שולחן 1) ו 3 מ ל אמבות בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL ב 75 ס מ² תרבות התא בקבוקון.
3. שמור על התרבות ב -28 ° c.
4. לאחר 48 h, מכמת את האמבות באמצעות ספירת שקופיות.
5. כדי לשטוף, לקצור את התאים בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL ו הגלולה אמבות הצנטריפוגה ב 720 x g עבור 10 דקות. להסיר את supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח המתאים של הרעב בינונית כדי לקבל 1 x 10⁶ תאים/mL (טבלה 1).

2. הפצת וירוס מניות באמבות

הערה: לפני דילול, חשוב לתרבות את דגימת המניה כדי להשיג מספיק תרבות טרייה, ולאחר מכן להמשיך לסינון.

1. השתמש 1 x 10⁶ של התרבות אמבה ב רעב בינוני.
2. איחסן את התערובת של וירוסים שהונפקו מתוך פתרון המניה (פאוסטווירוס/LCD7 או פאוסטווירוס/מST1) לאחר התהליך המשותף של התרבות על התמיכה הסלולרית בריבוי של זיהום (מוי) של 0.01.
   הערה: משרד הראשי חשוב להפחית את שפע האוכלוסיה הנגיפית הגדולה ומספר התאים הנגועים.
3. דגירה ב 30 ° צ' עד ההשפעות אפקט ציטופתי (cpe) הם המושרה, כגון מעגל אמבות או הליזה, כ 10 כדי 14 h לאחר ההדבקה.
4. לאסוף את המדיה פילטרט דרך מסנן 5 יקרומטר כדי להסיר פסולת תאית.

3. דילול נקודת הקצה

1. בצע דילול טורי (10^-1 עד 10^-11) של המדגם הנגיפי ב רעב בינונית (שולחן 1).
2. האיחסן 2 מ ל של 1 x 10⁶ vermamoeba vermiformis הכלול כל צלחת פטרי עם 100 μl של התערובת התרכובת.
3. מניחים את מנות פטרי בשקית פלסטיק בקצב של 30 ° c.
4. התחילו להתבונן במנות פטרי עם מיקרוסקופ אופטי הפוך ב -6 החותמות ולבדוק מורפולוגיה של התאים כל 4 עד 8 h.
5. במראה של האפקט אפקט ציטופתי המאופיינת על ידי עיגול התאים, להתחיל את התהליך בודד מיקרו השאיפה.

4. תא יחיד מיקרו השאיפה

1. . הכן את הפונדקאי
   הערה: הכנה זו מורכבת לשחרור של תאים בודדים נגועים לתמיכה בתאים טריים.
   1. לטפל אמבות בתרבות עם סוכן מיקרוביאלית המכיל 10 μg/mL של vancomycin, 10 μg/mL של שפחקות, 20 μg/mL של ציפרופלוקסאצין, 20 μg/mL של דוקסיציקלין, ו 20 μg/mL של וריקונזול. תערובת זו משמשת כדי למנוע זיהום חיידקי ופטרייתי.
      הערה: ההליך מתרחש על ספסל מחוץ לתחנת הבטיחות הביולוגית. הוסף 2 מ ל אמבות מרוכז ב 1 x 10⁶ תאים/mL כל אחד לתוך 15 מנות פטרי. לצורך הדבקות אמבה, התרבות ב 30 ° c עבור 30 דקות.
2. בחר את צלחת פטרי המשמש מיקרו שאיפה מן הגבלת דילול על פי הקריטריונים הבאים: 1) היעדרות של זיהום גלוי על ידי סוכנים פטרייתי וחיידקיים, 2) ראיות של השפעה אפקט ציטופתי של אמבות עקב וירוסים, ו 3) לקדם הפרה ועיגול של האמבות (כדי למנוע שאיפה של חלקיקים ויראליות).
3. הגדר תחנת עבודה עם החומרים הבאים (ראה איור 1א, ב):
   מיקרומניפולציה, המאפשרת מיצוב מיקרונימי;
   שליטה ידנית המכשיר הלחץ, משמש לסחיטת ולשחרר את התאים לתוך המיקרונימים;
   מיקרוסקופ הפוך;
   הכנס-הפעל מודולים מוטוריים;
   מצלמה
   מודול מחשב להמחיש מניפולציה ולצלם.
4. בחרו מיקרוקפילר (ראו איור 1ג).
   הערה: גודל התאים, הדפורמציה והדבקה של הקרומים שלהם למשטחים, והתנועתיות הסלולרית יכולה להשפיע על ההתקדמות החלקה של השאיפה הזעירה. הקוטר המיקרונימי יכול להיבחר במדויק ולהתאים לסוגי תאים ספציפיים בהתאם לגודלם ולשיטות השאיפה שלהם. מיקרוקפילר של 20 יקרומטר קוטר פנימי שימש כדי לבשל אמבה מעוגל (קוטר ~ 10 יקרומטר). הדבר מאפשר לתחזוקת מעמד פנימי ולשחרור קל של התא.
5. . לטעון את המערכת
   1. לתקן את זווית הפעולה של המערכת מרתק על מודול מוטורי ב 45 °.
   2. בצע התקנה כפולה, תחילה על מערכת האחיזת, ולאחר מכן על המיקרונימים.
   3. להתמקד בתאים לאחר הפעלת כמה טיפות שמן דרך המיקרונימים.
      הערה: השמן המינרלים עם התאימות הביולוגית מסופק על ידי המכשיר.
   4. השלם התקנה מלאה לאחר ההמלצות של היצרן.
6. תאים לשכפול (ראה איור 2א, ב).
   הערה: הליך זה דומה לזו המתוארת על ידי Fröליך ו-König³¹.
   1. מניחים את צלחת פטרי המכילה 2 מ ל אמבות נגוע מתחת למיקרוסקופ.
   2. התמקד הראשון על התאים, ולאחר מכן על המיקרונימים שקוע בתרבות.
   3. בחרו תא בודד עגול והביאו את המיקרונימים הקרובים יותר למיקרומניפולציה.
   4. להפעיל שאיפה רכה עם בקרת לחץ ידני על התא, לקחת אותו בתוך המיקרונימים. הסר את התא היחיד מהדוגמה הראשונה ושחרר בתמיכה הסלולרית, ולאחר מכן הכתיאת הדגם ב-30 ° c.
   5. היערכו תצפיות יומיות עם מיקרוסקופ אופטי הפוך כדי להתבונן במראה של התאים ולפקח על הופעתה של אפקט אפקט ציטופתי.

5. הקרנת PCR

הערה: לאחר שלב 4, הקרנה שיטתית של ה-PCR היא חיונית לאישור ההפרדה. בשני וירוס לחגם/פאוסטווירוס ובנגיף/פאוסטווירוס, העיצוב והיישום של מערכות תחל ובדיקה ספציפיות שנעשו באמצעות פריימר-הפיצוץ באינטרנט³² (שולחן 2).

1. לחלץ DNA מחלק של דגימות תרבות חיובית (כלומר, שם אפקט אפקט ציטופתי הוא נצפתה), באמצעות מערכת החילוץ אוטומטי על פי פרוטוקול של היצרן.
2. השתמש בתחל מעוצב כראוי.
   הערה: כאן עיצבנו התחל כדי להגביר את הגנים המרכזיים מסומן כמו RpB2 (Faustovirus), LCD7 הגדול capsid חלבון (לדעה) ו capsid הקטין חלבון (הנגיף)
3. השתמש ב-PCR הסטנדרטי באמצעות הציקלהטרטרנר.
   1. בצע את 20 μL PCR תגובות עם 50 μM של כל פריימר (שולחן 2), 1X מיקס מאסטר, ו RNase מים חופשיים.
   2. להפעיל את ה-DNA Taq פולימראז עבור 5 דקות ב 95 ° c, ולאחר מכן לעקוב אחר 45 מחזורים של 10 הדנטורציה ב 95 ° צ', ריפוי של התחל עבור 30 s ב 58 ° c, ואת השלוחה של 30 ב 72 ° c.
4. הפעל את מוצרי ה-PCR על 1.5% agarose ג'ל, כתם עם הכתם ג'ל DNA (טבלת חומרים), ולהמחיש עם UV.

6. וירוס הייצור וטיהור

1. שימי את שאר התרבות של צלחת פטרי. בבקבוקון קטן
2. עבור ייצור וירוס, להכין 15 מבחנות של 145 ס"מ², המכיל 40 ML של Vermamoeba vermiformis ב רעב בינוני ו 5 מ ל של וירוס מבודד כבר הועבר ממנה פטרי לצלוחיות קטנות.
3. לטפל עם אנטיביוטיקה ותערובת פטריות בשימוש בשלב 4.1.
4. מודטה ב -30 ° c. צפו בכל יום עם מיקרוסקופ אופטי הפוך.
5. לאחר הזיהום המלא, הבריכה כל מבחנות. השתמש במסנן 0.45 יקרומטר כדי למנוע שרידים.
6. Ultracentrifuge כל supernatants ב 50,000 x g עבור 45 min.
7. לאחר צנטריפוגה, להסיר את הסופרנטאנט מכל צינור על ידי שאיפה ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS).
8. לטהר את הנגיף המיוצר באמצעות 25% סוכרוז (27.5 g סוכות ב 100 מ ל של PBS, מעוקר על ידי סינון).
9. צנטריפוגה 8 מ ל של סוכרוז 2 מ ל של הבולם הנגיפי ב 80,000 x g עבור 30 דקות. השהה את הגלולה הנגיפית ב-1 מ ל של PBS. אחסן אותו ב-80 ° c.

7. שלילי כתמים ושידור אלקטרון מיקרוסקופ

הערה: בו ח'ליל ואח ' פרסם בעבר את פרוטוקול²⁷זה.

1. הפקדה 5 μL של הליזה סופר על הרשת משוחררת זוהר. השאירו כ-20 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הזוהר-פריקה מאפשר לנו להשיג רשת הידרופילית על ידי יישום פלזמה.
2. יבש את הרשת בזהירות להפקיד טיפה קטנה של 1% אמוניום molybdate על זה 10 s. להשאיר את הרשת להתייבש 5 דקות.
3. המשך לתצפיות המיקרוסקופיה האלקטרונים ב200 קוו

8. אפיון מST1 וירוס הLCD7

1. אפיון אוכלוסיות טהורות של הST1 וירוס הLCD7 באמצעות רצף הגנום, הרכבת הגנום, ניתוחים בביואינפורמטיקה וחקר מחזור replicative שלהם כפי שעשינו עבור וירוסים אחרים^10,20, . ^עשריםושבת

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מיקרו-שאיפה תא יחיד הוא תהליך מיקרומניפולציה הממוטב בכתב יד זה (איור 1). טכניקה זו מאפשרת לכידת של אמבה מעוגל, נגוע (איור 2א) ושחרורו בלוח הרומן המכיל אמבות נגוע (איור 2). זהו אב-טיפוס פונקציונלי שחלה על מערכת התרבות המשותף והיא מבודדת ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

משך הטיפול במיקרו-שאיפה התא היחיד ותפקודו התקין הוא תלוי-מרכזיה. השלבים השונים של הניסוי דורשים דיוק. השימוש ברכיבי המיקרומניפולציה של תחנת העבודה חייב להיות תחת שליטה מתמדת על-ידי התבוננות בתהליך של שאיפה מיקרו ושחרורו של התא. המעקב אחר התבוננות מיקרוסקופית הוא הכרחי ללכידה והעברה של תא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification