JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

Abstract

J-תחום חלבונים (jdps) הטופס הגדול ביותר משפחת שותף מגוון ביותר בתאי איקריוטית. הממצאים האחרונים מראים כי חברים ספציפיים של משפחת JDP יכול ליצור הטרוקומפלקסי ארעי ב eukaryotes כדי לכוונן בחירת המצע עבור 70 kDa חום בהלם חלבון (Hsp70) חלבון מבוסס הסוכר disצוברי. JDP מתחמי מטרה חריפה/כרונית לחץ המושרה חלבונים מצטברים וכנראה לעזור להרכיב את disצוברי ידי גיוס Hsp70s מרובים על פני משטח של אגרגטים חלבון. היקף השליטה באיכות החלבון (PQC) שנוצר על ידי האינטראקציה הפיזית האלה של JDPs שרידים במידה רבה לא מאופיין בvivo. כאן, אנו מתארים מיקרוסקופ מבוסס על באתרו האינטראקציה חלבון בתוך שיטת הקשר הקרבה הקירבה (PLA), אשר מסוגל מכבש ללכוד מתחמי המלווה האלה בנויים בתאים סלולריים ברורים של תאים איקריוטית. העבודה שלנו מרחיבה את התעסוקה של PLA מן התאים האנושיים כדי שמרים (שאיפהcerevisiae ס) וחיידקים (esהמאביקcoli), ובכך עיבוד כלי חשוב כדי לפקח על הדינמיקה של מכלולים בעלי החלבון שנוצרו בשני תאים prokaryotic ו איקריוטית.

Introduction

כמות עצומה של מידע גנומי נשאר שולחן בלתי מתרגם בשל ההבנה השלמה שלנו של interactomes סלולריים. מתודולוגיות לגילוי חלבון בחלבון קונבנציונאלי, כגון חלבון co-immunoprecipitation עם/ללא קישור כימי ושיתוף לוקליזציה של חלבונים, אף שימוש נרחב, מהווים מגוון חסרונות. חלק מהחסרונות העיקריים כוללים קוונפיקציה ירודים של האינטראקציות והמבוא הפוטנציאלי של אירועי איגוד שאינם מקומיים. לעומת זאת, טכניקות מבוססות-קירבה מספקות חלופה וגישה רבת עוצמה ללכידת אינטראקציות חלבונים בתאים. שיטת החיבור (PLA)1, הזמינה כעת כערכה קניינית, מעסיקה נוגדנים למטרות במיוחד של מכלולי חלבונים המבוססים על הסמיכות של יחידות המשנה של האינטראקציה.

PLA הוא יזם על ידי היווצרות של פיגום המורכב של נוגדנים הראשי והמשני עם תגי DNA קטן (משחק משחק) על פני השטח של קומפלקס חלבון ממוקד (איור 1, שלבים 1-3). לאחר מכן, נקבע על ידי הקרבה של תגי ה-DNA, מולקולת DNA מעגלית נוצרת באמצעות הכלאה עם מחבר olig, מחברים (איור 1, שלב 4). היווצרות ה-DNA המעגלי מושלם על ידי צעד לפני הריסוס. פיסת ה-DNA שנוצרה לאחרונה משמשת כתבנית עבור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המבוססת על הגברה מראש של הזרם המבוסס על ידי אחד מתגי הגאות והביות. זה יוצר מולקולה חד-הורית של הקונקטאממית מחוברת למכלול החלבון דרך פיגום הנוגדן (איור 1, שלב 6). מולקולת ה-DNA הconcatic הוא דמיינו באמצעות fluorescently המסומן בתווית olig, הhybridize לרצפים ייחודיים מרובים פזורים ברחבי ה-DNA מוגבר (איור 1, שלב 7)2. אות ה-PLA שנוצר, המופיע כנקודה פלואורסצנטית (איור 1, שלב 7), מתאים למיקום של מתחם החלבון המיועד בתא. כתוצאה מכך, היכולת לזהות מתחמי חלבונים בעלי דיוק מרחבי ברמה גבוהה. הטכניקה אינה מוגבלת פשוט לכידת אינטראקציות חלבונים, אבל יכול להיות גם מנוצל כדי לזהות מולקולות יחיד או שינויי חלבון על חלבונים עם רגישות גבוהה1,2.

Hsp70 טפסים מערכת המלווה מאוד רב-תכליתי חשוב באופן מהותי לשמירה על הומאוסטזיס חלבון הסלולר על ידי השתתפות במערך של משק הבית, הקשורות למתח פונקציות. פעילות משק הבית של מערכת Hsp70 המלווה כוללים קיפול חלבון דה נובו, טרנסלוקציה חלבונים על פני קרומים סלולריים, הרכבה ופירוק של מכלולי חלבון, רגולציה של פעילות החלבון וקישור קיפול חלבון שונים/ בקרת איכות machineries3. מערכת המלווה אותו גם מקפלים מחדש/שפרש החלבונים, מונע צבירת חלבון, מקדם את פירוק חלבונים ומשתף פעולה עם הפרוטסים הסלולר לבזות מוטעית סופני/פגום חלבונים כדי להקל על תיקון הסלולר לאחר מדגיש רעלים רעילים4,5. כדי להשיג את הגיוון הפונקציונלי הזה, המלווה Hsp70 מסתמך על שיתוף המלווים שותפים של משפחת JDP ונוקלאוטיד החליפין גורמים (NEFs) זה בסדר לכוונן את השליטה Hsp70's ATP תלויי התלות של כריכת מצע ושחרור3, . שישה מטרים יתר על כן, המלווה המשותף JDP לשחק תפקיד חיוני בבחירת מצעים עבור מערכת זו המלווה צדדי. בני משפחה זו מחולקת לשלושה כיתות (A, B ו-C) על בסיס הומולוגיה המבנית שלהם לאבטיפוס של JDP, E. coli dnaj. Class A JDPs להכיל N-טרמינל J-תחום, אשר מקיים אינטראקציה עם Hsp70, אזור עשיר גליצין-פנילאללין, אזור איגוד מצע המורכב של אזור כמו אצבע אבץ (ZFLR) ושני תחומים β-חבית, ו-C-טרמינל dimerization התחום. JDPs עם אזור N-טרמינל J-מתחם ומחוז גליצין-פנילאלנין, אבל חסר את הזפלאר, ליפול לכיתה ב'. באופן כללי, חברים בשני הכיתות הללו מעורבים בתפקודים מלווים. חברים נופלים תחת הכיתה הכוללת C, אשר מכיל JDPs כי רק לשתף את ה-J-domain4, לגייס Hsp70s לבצע מגוון של פונקציות שאינן מלווים. התפקיד החשוב של JDPs כמו הכרה מצע להחלפה "מתאמים" של מערכת Hsp70 משתקף על ידי התרחבות של בני המשפחה במהלך האבולוציה. לדוגמה, לבני אדם יש יותר מ-42 חברי JDP ברורים4. הפונקציות האלה jdps כמו monomers, הומודימרס ו/או הומו/הטרו oligomers4,5. לאחרונה, שיתוף פעולה פונקציונלי באמצעות היווצרות מורכבות ארעית בין מחלקה A (למשל, H. DNAJA2; S. cerevisiae ס Ydj1) ו-class B (למשל, H. DNAJB1; S. cerevisiae ס Sis1) איקריוטית jdps דווח כדי לקדם הכרה יעילה של אגרגטים החלבון אמורפיים ב מבחנה7,8. אלה מחלקה מעורבת jdp מתחמי ככל הנראה להרכיב על פני השטח של חלבונים צבורים כדי להקל על היווצרות Hsp70-ו Hsp70 + Hsp100 מבוססי חלבון בחוסר הסוכר7,8,9, 10. הראיות הקריטיות לתמוך הקיום של אלה בעקבות מתחמי מעורבות jdp מחלקה בתאים איקריוטית סופק עם PLA8.

PLA מועסק יותר ויותר להערכת אינטראקציות חלבונים במטתים, בעיקר בתאי יונקים. כאן, אנו מדווחים על התרחבות מוצלחת של טכניקה זו כדי לעקוב אחר מתחמי המלווה שנוצרו באופן מידי בתוך איקריוטית ו-prokaryotic אורגניזמים חד-תאיים כגון מראה שמרים S. cerevisiae ס ו חיידק E. coli. חשוב מכך, התרחבות זו מדגישה את השימוש הפוטנציאלי ב-PLA בזיהוי וניתוח של חיידקים שידביקו תאים אנושיים ובעלי חיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנה לתאי הלה

  1. הכינו את החומרים הבאים: PBS (137 מ"מ, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ2hpo4, 1.8 mm KH2PO4), pH 7.4; DMEM, בתוספת עם 10% FCS ו 1% עט-דלקת; 4% פאראמפורמלדהיד ב-PBS; 0.5% טריטון-X100 בערוץ הPBS; TBS-T (150 מ"מ היאl, 20 מ"מ טריס, 0.05% רצף), pH 7.4; 0.0001% פתרון פולי-ל-ליזין סטרילי; 10-היטב שקופיות אבחון; תא לח; נייר טישו; וצנצנות מכתים שקופיות של קופלין.
    הערה: כדי להבטיח יעילות קיבעון אופטימלית, פתרונות פאראמפורמלדהיד צריך להיות מוכן טרי לפני כל ניסוי.
  2. הכינו תא לח על ידי כיסוי החלק התחתון של קופסה סגורה עם רקמות רטובות. הניחו את החדר הלח ב-37 ° c לפני תחילת הניסוי, כדי להבטיח שטמפרטורת החדר תהיה ב-37 ° צ' בעוד שהיא מודסת את התגובות האנזימטיות.
  3. התרבות הלה בתאי ב T25 מבחנות, ב 5 מ ל של DMEM (גלוקוז גבוה, גלוטמט ו נתרן Pyruvate תוספת) שיושלם עם 10% FCS ו 1% עט-דלקת, ב 37 ° c משני החממה המכילה 5% co2. הנתק תאים חסיד באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA. לאחר הוספת DMEM טרי לתאי הנתק, ספירת תאים באמצעות תא ספירת תאים ולגדול על שקופיות אבחון בתוך תא לח.
  4. לעקר שקופיות אבחון על ידי UV-הקרנה במכסה של תרבות התא סטרילי עבור 30 דקות.
  5. הוסף 100 μL של מסונן סטרילי 0.0001% פולי-L-ליזין לכל הנדרש עבור הניסוי. דגירה עבור 30 דקות. לשטוף את העודף פולי-L-ליזין ידי שטיפת כל טוב 3x עם 50 μl אלקטרופורזה מים.
  6. טריזיסיזציה של תאי הלה והוספת כ-15,000 תאים לכל היותר. במידת הצורך, לדלל תאים לפחות 30-50 μL של DMEM לכל טוב.
  7. לגדול תאים בתא לח בתוך 37 ° c 5% CO2 חממה עבור כ 24 h. תאים אמורים להיות 60% – 80% מאגד לפני התחלת ה-PLA.
    הערה: שליטה גבוהה מדי מקטינה את ספיגת ריאגנטים, הפחתת האות המתקבל בסוף הפרוטוקול.
  8. הסרת המדיום על-ידי הצבת נייר טישו בקצה הבאר. שטוף בארות 3x עם 50 μL של PBS.
    הערה: תאים כפופים לניתוק כאשר נוזלים מתווספים בחומרה. זה יכול להיות מונע על ידי לא לתת את הבארות יבש לחלוטין לפני הוספת נוזל חדש על ידי הוספת נוזל חדש בעדינות לקצה הבאר.
  9. תקן תאים על ידי הוספת 50 μL של טרי מוכן 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS לכל טוב. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף שקופיות 3 x ב-PBS. לבצע שוטף צנצנת שקופיות מכתים שקופית המכילה 100 mL של PBS. עבור כל כביסה, הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר בלי לרעוד.
  11. החדירות קרום התא על ידי מיזוג השקופיות ב 100 mL של 0.5% טריטון-X100 ב PBS בצנצנת מכתים שקופיות Coplin. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר בלי לרעוד.
  12. לשטוף שקופיות 3 x ב-TBS-T. לבצע שוטף צנצנת שקופיות מכתים שקופית המכילה 100 mL של TBS-T. עבור כל כביסה, הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר בלי לרעוד.
  13. לאחר השטיפה האחרונה, הסר מאגר עודף עם נייר טישו. בשלב זה התאים מוכנים לפרוטוקול של שיטת הסמיכות שיידונו בסעיף 4.

2. S. cerevisiae ס הכנה לתא

  1. הכינו את החומרים הבאים: 100 mM KPO4, pH 6.5, המכונה מאגר לשטוף; 37% פורמלדהיד; 4% פאראמפורמלדהיד ב 100 mM KPO4, pH 6.5; 1.2 M סורביטול ב 100 mM kpo4, pH 6.5; lyticase פתרון (500 μg/mL lyticase, 20 מ"מ β-mercaptoethanol, 100 mM KPO4, pH 6.5); 0.0001% הפתרון פולי-ל-ליזין; 1% טריטון-X100 ב 100 מ"מ KPO4, pH 6.5; 10-היטב שקופיות אבחון; תא לח (מוכן בשלב 1.2); נייר טישו; וצנצנות מכתים שקופיות של קופלין.
    הערה: כדי להבטיח יעילות קיבעון אופטימלית, פתרונות פאראמפורמלדהיד צריך להיות מוכן טרי לפני כל ניסוי.
  2. לגדל תרבות לילה בתמצית שמרים לא סלקטיבית, Peptone ו דקסטרוז (YPD) בינונית 30 ° c תוך כדי טלטול.
    הערה: בהתאם לדרישות הניסוי S. cerevisiae ס ניתן לגדל בינונית השלם (SC) בינוני או סלקטיבי מינימלי (SM) בינוני סינתטי במקום.
  3. לדלל את התרבות הנייחת כדי OD600 של 0.1 ב 20 מ ל בינוני. לגדול את התאים 30 ° צ' תוך כדי לרעוד עד OD600 מגיע 0.5.
  4. העבר את התרבות 20 מ ל לצינור הצנטריפוגה של 50 mL. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 665 x g עבור 3 דקות. להסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של בינוני טרי.
  5. תקן את התאים על ידי הוספת 550 μL של 37% פורמלדהיד לתרבות. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
  6. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 665 x g עבור 3 דקות. להסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של המוכן טרי 4% פאראפורמלדהיד מאגר לשטוף. מודטה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. במהלך הדגירה, להכין את שקופיות אבחון על ידי הוספת 100 μL של 0.01% פולי-L-ליזין פתרון כל טוב. מודקון את השקופיות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. לאחר 30 דקות, לשטוף את העודף פולי-L-ליזין עם מים באולטרטהורים ולתת את השקופיות אוויר יבש. השקופיות היבשות מוכנות לשימוש.
  9. שטוף תאים פעמיים עם 1 mL של מאגר לשטוף. בצע שוטף על ידי צנטריפוגה של התאים ב 665 x g עבור 3 דקות. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים במאגר הכביסה.
  10. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 665 x g עבור 3 דקות. להסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את התאים ב-1 מ ל של 1.2 M סורביטול במאגר לשטוף.
  11. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 665 x g עבור 3 דקות. להסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-250 μL של פתרון Lyticase טרי לעכל את קיר התא. מודאת התאים בפתרון Lyticase עבור 15 דקות ב 30 ° צ' בעודו רועד.
  12. לאחר העיכול, לשטוף את התאים 3x על ידי צנטריפוגה ב 665 x g עבור 3 דקות ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את התאים ב-250 μl של 1.2 M סורביטול במאגר לשטוף.
    הערה: כי תאים הם שבריריים לאחר העיכול הקיר התא, להשעות אותם בזהירות רבה כדי לא לפגוע בתאים.
  13. הוסף 20 μL של תאים שהושעו מחדש לשקופיות מצופות פולי-ליזין. אפשר להם לצרף לשקופיות עבור 30 דקות. לשטוף את התאים הלא מחסיד על ידי שטיפת בארות 3x עם 50 μL של מאגר לשטוף.
  14. החדירות קרום התא על ידי כביסה 3x עם 50 μL של 1% טריטון-X במאגר לשטוף.
    הערה: בשלב זה התאים מוכנים לפרוטוקול הנוגע לסדר הסמיכות שיידונו בסעיף 4.

3. E. coli תא הכנה

  1. להכין את החומרים הבאים: PBS-T (140 mM הנאקל, 2 מ"מ KCl, 8 מ"מ K2hpo4, 1.5 mm KH2PO4, 0.05% רצף-20), pH 7.4; פתרון ליזוזים (2 מ"ג/mL ליזוזים, 25 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 50 mm גלוקוז, 10 מ"מ edta); 0.0001% הפתרון פולי-ל-ליזין; 99% קרח קר מתנול; 99% טמפרטורת החדר מתנול; 99% אצטון; 10-היטב שקופיות אבחון; תא לח (מוכן בשלב 1.1.1); נייר טישו; וצנצנות מכתים שקופיות של קופלין.
  2. לגדל תרבות לילה במדיום לוריא-ברגאני (LB) ב 30 ° צ' בעודו רועד.
  3. לדלל את התרבות הנייחת כדי OD600 של 0.02 בינוני ליברות טרי. הגדל את התאים ב-30 ° צ' תוך כדי טלטול עד ל-OD600 מגיע 0.4 עבור תאים של שלב יומני רישום.
  4. כ 15 דקות לפני התאים להגיע OD600 של 0.4, להכין שקופיות פולי-l-ליזין מצופה על ידי הוספת 100 μl של 0.0001% פולי-L-ליזין לכל באר. מודקון את השקופיות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לאחר 30 דקות לשטוף את העודף פולי-L-ליזין עם מים באולטרסאונד ולתת שקופיות יבש. השקופיות היבשות מוכנות לשימוש.
  6. כאשר התאים מגיעים OD600 של 0.4, להעביר 1 מ ל של התרבות לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ותאים גלולה ב 2,650 x g עבור 2 דקות.
  7. השהה תאים מחדש ב-50 μL של מדיום LB.
  8. תקן תאים על ידי הוספת 1 מ ל קרח קר 99% מתנול. מערבבים בעדינות רבה ביד. מודקון תאים עבור 30 דקות ב-20 ° c.
  9. לאחר קיבעון להוסיף 20 μL של התאים לשקופיות פולי ליזין מצופה. . האוויר יתייבש ל -30 דקות
  10. הוסף 50 μL של תמיסת ליסוזים טריים שהוכנו לכל טוב כדי לעכל את קיר התא. מודקון בתא לח במשך 30 דקות ב -25 ° c.
  11. הסר את פתרון ליזוזים מן הבארות על ידי הוספת נייר טישו לקצה הבאר. שוטפים שקופיות 3x ב 100 mL של PBS-T. לבצע כל לשטוף בצנצנת מכתים שקופיות של Coplin עבור 30, מבלי לרעוד.
  12. הסר את מאגר הכביסה מהשקופיות על-ידי הקשה על השקופיות על נייר טישו.
  13. מחלחל את ממברנות התא על ידי הוספת 50 μL של 99% מתנול לכל טוב. מודטה למשך 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. הסר מתנול על ידי הצבת נייר טישו לקצה הבאר.
  15. הוסף 50 μL של 99% אצטון לכל טוב. . מודטה למשך 1 דקות
  16. הסירו אצטון עודף על ידי הצבת נייר טישו לקצה הבאר. אפשר לשקופיות להתייבש באוויר. בשלב זה התאים מוכנים לפרוטוקול הנוגע לסדר הסמיכות שיידונו בסעיף 4.

4. שיטת היטל קירבה

  1. הכן את החומרים הבאים: חסימת מאגר; מאגר דילול הנוגדן; לשטוף את מאגר "A" – (10 מ"מ טריס, 150 מ"מ היאl, 0.05% רצף-20) pH 7.4; לשטוף מאגר ' B ' – (200 mM טריס, 100 מ"מ הנאל) pH 7.4; נוגדן אנטי ארנב משני פלוס; נוגדן נגד העכבר משני מינוס; מאגר ליטל 5x; ליגאז מאגר הגברה 5x (כתום: λex 554 ננומטר; λem 576 nm); פולימראז מים באולטרה-טהורים; והרכבה בינונית המכילה DAPI.
    הערה: ריאגנטים לזיהוי PLA זמינים גם בגרסאות גרין (λex 495 ננומטר; λem 527 nm), אדום (λex 594 ננומטר; λem 624 nm), פארורד (λex 644 ננומטר; λem 669 nm) או ברייטפילד (מperoxidase) מצומנת).
  2. חסום את התאים על-ידי הוספת טיפה של מאגר חסימת חסימה לכל באר. המשך 30 דקות ב-37 ° c בחדר לח.
  3. הכנת פתרונות נוגדנים על ידי דילול נוגדנים מלאי נוגדן מאגר דילול. עבור כל טוב 40 μL של פתרון נוגדן נדרש.
  4. הסר מאגר חוסם על-ידי הצבת נייר טישו בקצה הבאר. הוסף 40 μL של נוגדן מדולל מאגר דילול נוגדן לכל טוב. מודקון עבור 60 דקות בתא לח ב 37 ° c או לילה ב 4 ° c.
  5. הסרת פתרון נוגדן מבארות על ידי הצבת נייר טישו בקצה הבאר. כביסה שקופיות 2x ב 100 mL של מאגר לשטוף ' A ' בצנצנת מכתים שקופיות של Coplin עבור 5 דקות, מבלי לרעוד.
  6. במהלך השלבים לשטוף, לדלל את הנוגדנים 5x משני בדיקה, אנטי ארנב פלוס & נגד העכבר מינוס (המינים הספציפיות של הגששים תלוי בנוגדנים העיקריים בשימוש), ב מאגר דילול נוגדן. הכינו 40 μL של פתרון נוגדן לכל טוב.
  7. הוסף 40 μL של פתרון נוגדן משני לכל טוב. מודטה עבור 60 דקות ב 37 ° c בחדר לח.
  8. הסרת פתרון נוגדן משני מן הבארות על ידי הצבת נייר טישו בקצה הבאר. כביסה שקופיות 2x ב 100 mL של מאגר לשטוף ' A ' בצנצנת מכתים שקופיות של Coplin עבור 5 דקות, מבלי לרעוד.
  9. במהלך שוטף להכין 40 μl של תערובת ליטל גם, על ידי ערבוב 8 μl של מאגר ליטל 5x, 31 μl של מים אלקטרופורזה 1 μl של ligase.
  10. הוסף 40 μL של תערובת הארכה לכל באר. המשך 30 דקות ב-37 ° c בחדר לח.
  11. להסיר תערובת הפרשות מבארות על ידי הצבת נייר טישו בקצה הבאר. כביסה שקופיות 2x ב 100 mL של מאגר לשטוף ' A ' בצנצנת מכתים שקופיות של Coplin עבור 2 דקות, מבלי לרעוד.
  12. במהלך שוטף להכין 40 μl של תערובת הגברה לכל טוב, על ידי ערבוב 8 μl של פתרון הגברה של 5x, 31.5 μl של מים אלקטרופורזה, ו 0.5 μl של פולימראז.
    הערה: הגברה 5x מכיל בבדיקות פלורסנט. הגן על תערובת זו מהאור. כמו כן, הגן על השקופיות מהאור במהלך כל אחד מהשלבים הבאים. אם משתמשים בצנצנות מכתיפות שקופיות של Coplin ובתאי לח, עטפו אותם ברדיד אלומיניום.
  13. הוסף 40 μL של תערובת הגברה לכל טוב. מודטה עבור 100 דקות ב 37 ° c בחדר לח.
  14. להסיר את תערובת הגברה מן הבארות. כביסה שקופיות 2x ב 100 mL של שטיפת מאגר ' B ' בצנצנת מכתים שקופיות של Coplin עבור 10 דקות ללא טלטול.
  15. לשטוף את השקופיות ב 100 mL של מאגר לשטוף ' B ' מדולל 1:100 במים באולטרסאונד בצנצנת מכתים שקופיות של Coplin עבור 30 s.
  16. הוסף 20 μL של DAPI המכיל בינוני גובר לשקופיות. סגור שקופיות עם מחליק ושקופיות חותמות עם לק.
  17. אם הדמיה, הדמייה מיידית של DAPI המכיל הרכבה בינונית במשך 10 – 15 דקות, תוך הגנה מפני אור. אם לא, אחסן את השקופיות ב-20 ° צ' עד שבוע אחד, מוגן מפני אור.

5. זיהוי

  1. השתמש במיקרוסקופיה מיקרוקלית כדי להשיג תמונות של הלה, S. cerevisiae ס ו -E. coli תאים עם 20x/0.8 na, 63 x/1.4 na ו 100X/1.4 Na תוכנית apochromat מטרות, בהתאמה. לרגש DNA מוכתם DAPI עם 405 ננומטר לייזר דיודה פעמו. עבור האות PLA (עבור מחקר זה) להתרגש עם לייזר 561 nm-מדינה מוצק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הקודם שלנו במחקרים מבחנה באמצעות חלבונים מטוהרים חשף כי תת-קבוצה של המעמד האנושי A ו-class B JDPs טופס ארעי מעורב מתחמי מחלקה JDP כדי למקד ביעילות מגוון רחב של חלבונים צבורים ואולי להקל על ההרכבה של Hsp70 מבוסס חלבון מחוסר-גזים7. אנו המועסקים PLA כדי לקבוע אם מחלקה מעורבת (A + B) מתחמי JDP להתר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיתוף הimmunoprecipitation וגישות מבוססות לוקליזציה שימשו כשיטות ארוכות-עמידה לאפיון מרכיב החלבונים. הגילוי של באופן מרובה באמצעות מתחמי מלווה ספציפיים הוא אתגר גדול עם שיטות קונבנציונליות כאלה, וכתוצאה מכך, ממצאים קודמים מוגבלים במידה רבה לפרשנויות איכותיות. שיטות הimmunoprecipitation המבוססות על פירוק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

NBN נתמך על ידי מענק גיוס מיוחד של אוניברסיטת מונש הפקולטה לרפואת סיעוד ומדעי הבריאות עם מימון של ממשלת המדינה של ויקטוריה והממשלה האוסטרלית. אנו מודים Bernd בוקובזה (ZMBH, אוניברסיטת היידלברג, גרמניה) ופגע H. Kampinga (המחלקה למדעים ביו-רפואיים של תאים & מערכות, אוניברסיטת חרונינגן, הולנד) על תמיכה יסולא בפז שלהם שיתוף של ריאגנטים, הולגר לורנץ (ZMBH מתקן הדמיה, אוניברסיטת היידלברג, גרמניה) על תמיכתו במיקרוסקופיה ועיבוד תמונה, וקלייר הירסט (ARMI, אוניברסיטת מונש, אוסטרליה) לקריאה קריטית של כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
37% FormaldehydeMerck103999
AcetoneSigma-Aldrich32201
anti-DNAJA2 antibodyAbcamab157216
anti-DNAJB1 AntibodyEnzo Life SciencesADI-SPA-450
anti-DnaK antibodyIn house
anti-mCherry antibodyAbcamab125096
anti-Sis1 AntibodyCosmo Bio CorpCOP-080051
anti-Ydj1 antibodyStressMarq Biosciences SMC-150,
anti-YFP antibodyIn house
Coplin slide-staining jarSigma-AldrichS5516
Diagnostic slidesMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPISigma-AldrichDUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, FluorescenceSigma-AldrichDUO82049
Fetal Calf SerumThermo-Fischer10082147
LysozymeSigma-Aldrich62971
MethanolSigma-Aldrich32213
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin/StreptomycinThermo-Fischer15070063
Poly-L-LysineSigma-AldrichP47-07
SorbitolSigma-AldrichS7547
Triton-X100Merck108643
TrypsinThermo-Fischer25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolase 100T / / LyticaseUnited States BiologicalZ1004

References

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679(2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151JHsp70E coliS cerevisiae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved