מערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד להערכת תרופות פרמקוקנטיות וטוקסיקולוגיות

Summary

חשפנו מערכת מיקרופיזיולוגית (MPS) עם אורגנואידים במעי וכבד פרצטמול (APAP). מאמר זה מתאר את השיטות לייצור אורגנואידים והערכות רכוש פרמקוקינטי וטוקסיקולוגי APAP ב MPS. הוא גם מתאר את ניתוחי פונקציונליות הרקמה הדרושים כדי לאמת את התוצאות.

Abstract

מערכות מיקרופיזיולוגיות שהוצגו לאחרונה (MPS) טיפוח אורגנואידים אנושיים צפויים לבצע טוב יותר מאשר בעלי חיים בשלב בדיקות פרה-לקלינליות של תהליך פיתוח תרופות כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. במחקר זה, מחסום המעי האנושי (חיקוי על ידי תרבות שיתופית של תאי Caco-2 ו HT-29) ואת המקבילה בכבד (חיקוי על ידי spheroids עשוי תאי HepaRG מובחן ו תאי סטלה כבד אנושיים) שולבו בשבב שני איברים (2-OC) מכשיר מיקרו-נוזלים כדי להעריך כמה פרצטמול (APAP) פרמקוקינטיקה (PK) ומאפיינים טוקסיקולוגיים. MPS היו שלוש הרכבות: המעי רק 2-OC, כבד רק 2-OC, ו מעיים / כבד 2-OC עם אותה מדיה תפרוק שני אורגנואידים. להערכות PK, אנחנו מינון APAP בתקשורת בנקודות זמן מוגדרות מראש לאחר ניהולו או מעל מחסום המעיים (לחקות את המסלול אוראלי) או במדיה (לחקות את המסלול תוך וריד), ב 12 μM ו 2 μM בהתאמה. דגימות המדיה נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה הפוכה (HPLC). אורגנואידים נותחו לביטוי גנים, לערכי TEER, לביטוי ולפעילות של חלבונים, ולאחר מכן נאספו, תוקנו ונשלחו לערכה של הערכות מורפולוגיות. טכניקת MTT ביצעה היטב בהערכת הכדאיות אורגנואיד, אבל ניתוחי תוכן גבוה (HCA) הצליחו לזהות אירועים רעילים מוקדמים מאוד בתגובה לטיפול APAP. אימתנו כי זרימת המדיה אינה משפיעה באופן משמעותי על ספיגת APAP ואילו זה משפר באופן משמעותי את הפונקציונליות המקבילה לכבד. ספיגת המעיים האנושית APAP וחילוף החומרים של hepatic יכול להיות חיקוי MPS. הקשר בין נתוני MPS ומידול silico יש פוטנציאל גדול כדי לשפר את יכולת החיזוי של שיטות מבחנה ולספק דיוק טוב יותר מאשר מודלים של בעלי חיים במחקרים פרמקוקינטיים וטוקסיקולוגיים.

Introduction

בשל הבדלים גנומיים ופרוטונומיים, למודלים של בעלי חיים יש ערך חזוי מוגבל למספר תוצאות אנושיות. יתר על כן, הם גוזלים זמן, יקרים ומנויים^{מבחינה אתית 1}. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית שמטרתה לשפר את העוצמה החזויה ולהפחית את העלויות והזמן שהושקעו בבדיקות פרה-קליניות. הם מכשירים מיקרו-נוזלים המטפחים אורגנואידים (יחידות פונקציונליות של פנטומימטיקה מלאכותית של איברים) תחת זרימת מדיה המקדמת תקשורת אורגנואיד-אורגנואיד. אורגנואידים עשויים תאים אנושיים להגדיל את הרלוונטיות^{תרגום 2,3,4}. MPS צפוי לבצע טוב יותר מאשר ניסויים בבעלי חיים כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ייצור רקמות שוות ערך לטיפוח ב 2-OC

1. ייצור שווה ערך למחסום מעיים קטן
   1. לשמור על תאי Caco-2 ו- HT-29 באמצעות המדיום המקביל למעי: DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין, ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות, אשר נקרא "DMEM S" בכתב יד זה.
   2. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם DPBS 1x ולהוסיף 8 מ"ל של 0.25% Trypsin / EDTA כדי לנתק Caco-2 תאים גדל במבחנות תרבות התא (175 ס"מ^2). דגירה במשך 5 דקות ב 37 ° C ולעצור את התגובה על ידי הוספת לפחות את הנפח הכפול של מעכב שלושה. בצע את אותו הליך עבור תאי HT-29, התאמת אמצעי האחסון של היריגנט מאז כמות קטנה יותר של תאים אלה נדרשת והם נשמרים במבחנות קטנות יותר (75^{ס"מ 2).}
   3. צנטריפוגה ב 250....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לבצע את בדיקות APAP PK ב 2-OC MPS, הצעד הראשון הוא לייצר את המעי האנושי וכבד שווה ערך (אורגנואידים). הם משולבים בהתקן מיקרו-נוזל 2-OC (איור 1A) 24 שעות לפני תחילת תוואי APAP PK. למחרת, המדיום משתנה, והמודל נחשף APAP. איור 1 ממחיש את המקבילות של המעי והכבד הממוקמות בתוך התקן 2-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ההערכה המדויקת והאמינה של המאפיינים הפרמקולוגיים של תרופות חדשות חוקרות היא קריטית להפחתת הסיכון בשלבי הפיתוח הבאים. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית, שמטרתה לשפר את הכוח החזוי ולהפחית את העלויות והזמן בילה עם בדיקות פרה-קלינליות. הקבוצה שלנו מתקדמת בהערכת תכונות פרמקוקינטיות וטוקסיקולוגיות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190235	No calcium, no magnesium
2-OC	TissUse GmbH		Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate	Corning	3830	Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde			Use to fix cell
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085	Use to MPS assays
Acetonitrile	Tedia		Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin	Thermo Fisher Scientific		confocal experiment
Ammonium acetate	Sigma Aldrich		Used to perform HPLC
Caco-2 cells	Sigma Aldrich	86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks	Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope	Leica	DMI6000
Cryostat	Leica	CM1950
DMEM high glucose	Thermo Fisher Scientific	12800017	Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO	Sigma Aldrich	D4540	Add 2% to HepaRG media
Ethanol	Synth
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12657029
Freezing medium OCT	Tissue-Tek		Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells	Biopredic International	HPR101	Undifferentiated cells
HHSTeC	ScienCell Research Laboratories	5300	Cells and all culture supplements
Hoechst 33342			HCA experiments
HT-29 cells	Sigma Aldrich	85061109
Human Insulin	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	12585014
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0888
Isopropanol	Merck	278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	A2916801
Luna C18 guard column SS	Phenomenex		Used to perform HPLC
Microscope	Leica	DMi4000
Microtome	Leica	RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts	Merck	PIHP01250
Millicell ERS-2 meter	Merck	MERS00002	Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red			HCA experiments
MTT	Thermo Fisher Scientific	M6494
MX3000P system	Agilent Technologies
Neubauer chamber			Counting cells
Operetta High Content Imaging System	Perkin Elmer		Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA	Promega	Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063	Cell culture
Permount	Thermo Fisher Scientific		Histology
Primers			RT-qPCR
PVDF membrane	BioRad
PVDF Syringe filter			0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column	Phenomenex		Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)	IKA Works GmbH & Co	2819000	Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)	ScienCell	5301	Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase	Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent	Thermo Fisher Scientific		Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution	Thermo Fisher Scientific	R001100
Ultra-low-attachment plates	Corning	CLS3471-24EA	6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate	PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E	Pan Biotech	P04-29510	Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin