שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Summary

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

Abstract

התפתחות מערכת העצבים הנכונה כוללת את היווצרות מכשול הדם-מוח, מכשול הדיפוזיה המסדיר את הגישה למערכת העצבים ומגן על רקמת העצבים מפני רעלים ופתוגנים. פגמים בהיווצרות מכשול זה היו מתואמים neuropathies, ואת התמוטטות של מכשול זה נצפתה במחלות ניווניות רבות. לכן, חיוני לזהות את הגנים המסדירים את היווצרות והאחזקה של מחסום הדם-מוח כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. כדי להבין את התפקידים המדויקים גנים אלה לשחק בהתפתחות העצבית, יש צורך לעבד את ההשפעות של ביטוי גנים שונה על השלמות של מכשול המוח בדם. רבים מהמולקולות הפועלות בהקמת המכשול ממוח הדם נמצאו להיות שמרו על פני מינים איקריוטית, כולל זבוב הפירות, drosophila ילה מלאנוגסטר. זבובי פירות הוכחו כמערכת מודל מצוינת לבדיקת המנגנונים המולקולריים המסדירים פיתוח ותפקוד של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר הליך צעד-אחר-צעד לצורך שלמות מכשול המוח בדם במהלך השלבים העובריים והזחל של ד. מלאנוגסטר פיתוח.

Introduction

במהלך הפיתוח, תקשורת תא תא ואינטראקציות הן קריטיות להקמת מבנה רקמות ואיברים ותפקוד. במקרים מסוימים, אינטראקציות תא תא אלה ממקכבות איברים מהסביבה הסובבת כדי להבטיח את תפקוד האיברים התקין. זהו המקרה של מערכת העצבים, אשר מבודדת על ידי מכשול הדם-מוח (BBB). תפקוד של BBB בבני אדם נקשר הפרעות נוירולוגיות כולל אפילפסיה, ואת התמוטטות של המכשול נצפתה מחלות נוירוניווניות כולל טרשת נפוצה amyotrophic לרוחב¹. ב יונקים, bbb נוצר על ידי הצמתים הדוקים בין תאים אנדותל^2,3. בעלי חיים אחרים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוסטר, יש bbb מורכב מתאי גלאל. אלה תאים גליה טופס מכשול חדיר סלקטיבי לשלוט בתנועה של חומרים מזינים, פסולת מוצרים, רעלים, ומולקולות גדולות לתוך ומתוך מערכת העצבים⁴. הדבר מאפשר שמירה על מעבר אלקטרוכימי הנחוץ לירי בפוטנציאל הפעולה המאפשר ניידות ותיאום⁴. ב D. melanogaster, the glia להגן על מערכת העצבים מן האשלגן עשיר, כמו דם המוליקמ⁵.

במערכת העצבים המרכזית (cn) ומערכת העצבים ההיקפית (היקפית) של D. melanogaster, שתי שכבות גליה החיצוני, את subperineurial glia ואת perineurial glia, כמו גם רשת חיצונית של מטריצה החילוץ, הנוירולה העצבי, הטופס המוליקמ-המוח המוליש-מחסום העצב⁶, המכונה bbb לאורך מאמר זה. במהלך פיתוח subperineurial glia להיות פוליפואיד ולהגדיל כדי להקיף את מערכת העצבים^{5,6,7,8,9,10,11} . הצמתים subperineurial glia טופס septate, אשר מספקים את מכשול הדיפוזיה העיקרי בין המוליקמ ומערכת העצבים^5,6,12. הצמתים הללו דומים מאוד לצמתים בעלי החוליות הדומות, שנמצאו בפרפודות של המייאלוציה של גליה, והוא מבצע את אותו התפקיד כצמתים הדוקים ב-bbb של יונקים^13,14, מיכל ^{בן 15 ,} מיכל ^{בן 16 , 17}. perineurial glia הפער, לגדול, ולעטוף סביב subperineurial glia כדי לווסת את הדיפוזיה של מטבוליטים ומולקולות גדולות^6,10,18,19. היווצרות bbb הושלם על ידי 18.5 h לאחר הנחת ביצה (ח) ב -25 ° c^5,8. מחקרים קודמים זיהו גנים כי הם הרגולטורים קריטיים של היווצרות bbb^20,21,22. כדי להבין טוב יותר את התפקידים המדויקים של גנים אלה, חשוב לבחון את ההשפעה של מוטציה של הרגולטורים הפוטנציאליים האלה על שלמות BBB. בעוד שמחקרים קודמים מתארים גישות למתן שלמות bbb בעוברים ובזחלים, פרוטוקול מקיף לצורך שיטת מחקר זו טרם תואר^5,7. פרוטוקול זה, שלב אחר שלב, מתאר שיטות לגבי שלמות BBB במהלך שלבי הזחל העובריים והשלישי של מלאנוגסטר .

Protocol

1. אוסף דגימות

1. אוסף עובר
   1. בכל כלוב של אוסף העובר, השתמש במינימום של 50 נקבות בתולה עם 20-25 זכרים לגבייה. מודיית אלה זבובים בבקבוק עם אוכל תירס-אגר מזון (שולחן חומרים) עבור 1 על 2 ימים לפני תחילת אוספים²³.
      הערה: ניתן להשתמש בזבובים נוספים, אך יש לשמור על היחס הנשי לזכר ב-2:1.
   2. לוחות תפוח מחמם לחות (שולחן 1) ב -25 ° c ללילה.
      הערה: זה נדרש עבור ההיערכות הנכונה של עוברים. אם הצלחות מתייבשות במהירות, הוסיפו קערה עם מים לחממה כדי להגביר את הלחות של החדר.
   3. מעבר בין שלב 1.1.1 באמצעות CO₂ והעברת זבובים לכלוב הגבייה. מניחים לפני מחמם מיץ תפוחים צלחת אגר עם מכתם קטן של שמרים להדביק על הקצה הפתוח בטוח לכלוב עם השרוול האדום (לוח חומרים). כדי לנקות עוברים מבוגרים, לאפשר זבובים להטיל העוברים/ביצים על צלחת התפוח אגר הלוח עבור 1 h ב 25 ° c.
   4. הסר את כלוב הגבייה מהאינקובטור. להפוך את הכלוב שינוי בצד למטה ולהקיש זבובים למטה לתחתית הכלוב. החלף את מיץ התפוחים אגר עם צלחת חדשה לקדם חמם תפוח לוחית עם מכתם קטן של שמרים להדביק. . להשליך את הצלחת הראשונה
   5. אפשר זבובים להטיל העוברים/ביצים על הצלחת החדש של מיץ התפוח אגר עבור 1 h ב 25 ° c. למחוק את הצלחת הבאה בעקבות אוסף 1 h ולהמשיך לשלב הבא כדי לאסוף עוברים להזרקה.
   6. כדי לאסוף את השלב המאוחר 17 עוברי (20-21 h), לאפשר זבובים של גנוטיפ הרצוי משלבים 1.1.1-1.1.5 לשכב על מחמם חדש מחומם תפוח לוחות עם מכתם קטן של שמרים להדביק ב 25 ° צ' עבור 1 h. צלחת גיל עבור 19 h ב חממה 25 ° c , כך שעוברים יהיו 20 עד 21 מגיל בזמן ההדמיה.
      הערה: ניתן לחזור על שלב זה בהתאם לצורך עבור סיבובים מרובים של איסוף, הזרקה והדמיה של דוגמה.
   7. לאסוף את העוברים מן הצלחות לתוך מסננת תא 70 עם רשת PBTx יקרומטר ניילון על ידי הוספת מלוחים מואגור פוספט (PBS) עם 0.1% nonionic חומרים (; שולחן 1) לכסות את פני הצלחת ולשחרר את העוברים מהמשטח באמצעות מברשת צבע.
   8. עוברים deכורonate שנאספו בתוך מסננת התא בתמיסה 50% אקונומיקה (טבלה 1) בצלחת פטרי 100 מ"מ עבור 5 דקות עם עצבנות מדי פעם בטמפרטורת החדר. לשטוף את העוברים 3x על ידי מתערבל תא מסננת ב PBTx בצלחת פטרי, באמצעות מאכל טרי של PBTx בכל פעם.
   9. אם כל העוברים הם מסוג גנוטיפ הנכון, המשיכו ישירות לשלב 1.1.10. אם הדור של העוברים של גנוטיפ נכון דורש צלב עם זבובים heterozygous, לבחור עוברים של גנוטיפ נכון באמצעות נוכחות או העדר של כרומוזומים מאזן המסומנים באור פלואורוסקופים. השתמש בstereomicroscope עם יכולות פלורסנט עבור בחירת גנוטיפ.
      הערה: כרומוזומים מאזן המסומנים עם חלבון פלורסנט מעוות-צהוב; קרופל-Gal4, חלבון פלורסנט ירוק (gfp); טוויסט-Gal4, uas-gfp לעבוד היטב עבור בחירת גנוטיפ ב מאוחר embryogenesis (שולחן 2)^24,25,26.
   10. באמצעות פיפטה זכוכית, העברת עוברים ב PBTx 2% agarose לוח ג'ל (שולחן 1). הסר את הנוזל העודף באמצעות נייר סינון. יישר ~ 6-8 עוברים על הלוח השני% ג'ל עם האחוריים לימין והצד האחורי כלפי מעלה (איור 1B).
       הערה: המיקרופייל, החור הקטן שדרכו נכנסים אל הביצה, ממוקם בקצה הקדמי של העובר. . הקצה האחורי מעוגל יותר קנה הנשימה נראה לבן והוא ממוקם בתוך העובר, ומאפשר את ההבחנה של הצדדים הגדודים של העובר (איור 1ב).
   11. הכן שקופית עם חתיכה אחת של קלטת דו-צידית. לחץ בחוזקה על השקופית מעל העוברים כדי להעבירם לקלטת הדו.
   12. התייבשות עוברים על ידי דגירה בטמפרטורת החדר עבור ~ 25 דקות (לא התייבשות משמש). , בעקבות התייבשות. מכסים עוברים עם שמן הלוקרבון
       הערה: תקופות התייבשות עשויות להשתנות בהתאם לטמפרטורה, ללחות ולאוורור בחדר. תקופת הדגירה צריכה לשמש כדי להגדיר את המנגנון להזרקה ואת המיקרוסקופ קונפוקלית וקד לדימות, כפי שמתואר בסעיפים 2 ו 3 של פרוטוקול זה.
2. אוסף זחל
   1. להקים צלב עם 5-10 בתולה זבובים נקבה של גנוטיפ הרצוי וחצי כמו זכרים רבים של גנוטיפ הרצוי בבקבוקון עם אוכל תירס-אגר מזון ו דגירה ב 25 ° c²³.
   2. לאחר 5 שבעה ימים, בהתאם גנוטיפ, לאסוף הזחלים הנודדים השלישי מתוך הבקבוקון בעדינות עם מלקחיים. לשטוף את הזחלים ב-1x PBS כדי להסיר את המזון נדבק הזחלים. העברת הזחלים לצלחת מיץ תפוחים אגר עבור גנוטיפים כמתואר בשלב 1.1.9 במידת הצורך.
   3. מגלגלים זחלים על רקמה באמצעות מברשת צבע כדי לייבש אותם. העבר 6-8 הזחלים לשקופית שהוכנו על ידי קלטת דו צדדית באמצעות מלקחיים.

2. הכנת מחטים והזרקת דגימה

1. משוך מחטים על פולר מיקרופיפטה לפני החניכה של פרוטוקול זה. מאובטח צינורות קפילר לתוך המחט משוך על פי הצורה המחט הסטנדרטית פרמטרים עבור D. מלאנוגסטר זריקות (שולחן 3)²⁷. לאחסן מחטים בצלחת פטרי על ידי עיגון חימר עד השימוש להזרקה.
2. טען מחט עם 5 μl של 10 kda תוספי מצומנת sulforhodamine 101 חומצה כלוריד (טבלה של חומרים) באמצעות 20 μl ג'ל טעינת הצנרת במהלך תקופת התייבשות 25 דקות לעוברים (שלב 1.1.12), או מיד לאחר העברת זחלים לשקופית (שלב 1.2.3).
3. לטעון את המחט לתוך מחזיק מחט ומיקום במיקרומניפולציה מאובטח לבסיס פלדה (טבלת חומרים).
   הערה: המחט צריכה להיות כמעט מקבילה לשלב המיקרוסקופ להזרקת העובר ובזווית מעט כלפי מטה לזריקות זחל.
4. הגדר את מנגנון ההזרקה (לוח חומרים) עד 50 psi, 5-10-ms עם מגוון של 10.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות הגדרות אלה עבור מנגנון ההזרקה המסוים הנמצא בשימוש.
5. הנח את השקופית על הבמה ועל קצה המברשת של המחט כנגד קצה הקלטת הכפולה בזווית 45 ° כדי ליצור קצה שבור ובזווית.
   הערה: עבור עוברים יש צורך רק לשבור את הטיפ מספיק כדי לאפשר זרימה של 10 kDa dextran. מחט מושלמת יש טיפ בזווית מעט ורק טיפה קטנה של צבע תצא עם כל זריקה. עבור הזחלים, יש צורך לשבור את הטיפ יותר, אבל עם קצה בזווית לחדור את קיר הזחל הגוף. . טיפה גדולה יותר של צבע תצא החוצה
6. משאבה דוושת הרגל עד הצבע הוא בקצה המחט.
7. יישר את המחט כך שהוא יהיה מקביל עם העובר או זוויתי מעט למטה לעבר הזחל.
8. להעביר את המחט לנקב את הקצה האחורי של הדגימה ולהזריק את הדגימה על ידי שאיבת דוושת הרגל. הזרק ~ 2 nL של צבע לעוברים, ו ~ 220 nL של צבע לתוך הזחלים.
   הערה: העובר או הזחל צריך להציף בצבע אם הזריקה מוצלחת.
9. שימו לב לזמן ההזרקה למטרות דגירה. העוברים הדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. . בטמפרטורת החדר
10. המשך בשקופית כדי להזריק דגימות נוספות, וציין את זמן ההזרקה עבור כל אחד מהדגימות.
    הערה: בהתאם למהירות שבה ניתן לבצע את שלבי הניתוח וההדמיה הבאים, יש להזריק 4/8 דגימות בכל פעם.

3. הכנת דגימות להדמיה

1. הדמיה של עוברים
   1. לאחר ההזרקה, הכינו עוברים להדמיה. להחיל ג'לי נפט עם המוליך כותנה משופעת על צד ימין ושמאל של דגימות על השקופית כמו מרווח כדי למנוע נזק לעוברים בעת הצבת שמיכות.
   2. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לאורך כל עומק העובר עם מטרה 20x. לחשב את אחוז הדגמים הכולל עם צבע נצפתה בחוט העצב הגחוני (VNC) באמצעות המשוואה הבאה:% של דגימות עם BBB נפרץ = מספר דגימות עם הצטברות צבע של VNC/מספר כולל של דגימות.
2. חיתוך והדמיה של הזחלים
   1. הכן שקופיות לדגימות. זחל לפני הזמן הר שני שמיכות במרווחים כ 0.5 ס מ מלבד השקופית עם לק ציפורניים.
      הערה: הכיסויים מתפקדים כרווחים עבור המוח, כך שהוא לא ניזוק במהלך תהליך ההרכבה.
   2. בעקבות הדגירה של 30 דקות, מנתחים את הזחלים ב-1x PBS ישירות על השקופית שישמשו בהדמיה. ראשית, השתמש זוג אחד של מלקחיים כדי לתפוס את הזחל במחצית הגוף זחל, ולהשתמש זוג שני של מלקחיים כדי להפריד את החצאים הקדמי והאחורי של הזחל.
   3. הבא, להשתמש בזוג אחד של מלקחיים כדי לתפוס את האזור הקדמי של ווים בפה, ולהשתמש זוג שני של מלקחיים כדי להפוך את קיר הגוף על קצה של הלקחיים מרתק את הפה ווים. המוח ו VNC יהיה חשוף.
   4. הפרד את המוח ואת VNC מן הקיר הגוף על ידי ניתוק העצבים, ולהסיר את קיר הגוף מהשקופית (איור 1ג, ד). הסרת דיסקי imaginal במידת הצורך.
   5. לכסות את המדגם עם 10 μL של 80% גליצרול ומניחים שמיכות על גבי המדגם עבור הדמיה.
   6. תמונה דרך עומק רקמת מערכת העצבים באמצעות מטרה 20x. לחשב את אחוז הדגימות הכולל עם צבע נצפתה ב VNC.

תוצאות

השיטות המתוארות כאן מאפשרות הדמיה של שלמות BBB ברחבי ה-CN ב D. מלאנוגסטר עוברים וזחלים (איור 1). עם השלמת היווצרות BBB בסוף embryogenesis, פונקציות BBB להוציא מולקולות גדולות מהמוח ו VNC⁵. פרוטוקול זה מנצל פונקציה זו כדי לאשר את היווצרות BBB. כאשר פראי סוג (אורגון R) בשלב מאוח...

Discussion

פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של השלבים הדרושים לטיפול בשלמות BBB במהלך שלבי הזחל המאוחרים והשלישי של התפתחות D. מלאנוגסטר . גישות דומות תוארו במקום אחר כדי לקיים את שלמות bbb במהלך הפיתוח, כמו גם למבוגרים בשלבים^5,7,29,30. ע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran	ThermoFisher Scientific	D1863	Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips	Eppendorf	22351656
100% Ethanol (200 proof)	Pharmco-Aaper	11000200
Active Dry Yeast	Red Star
Agar	Fisher Scientific	BP1423
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Air Compressor	DeWalt	D55140
Apple Juice	Mott's Natural Apple Juice
Bleach	Household Bleach		1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Bottle Plugs	Fisher Scientific	AS-277
Cell Strainers	BD Falcon	352350
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator	Puritan	19-062614
Double-Sided Tape 1/2"	Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip	Roboz	RS-5015
Fly Food Bottles	Fisher Scientific	AS-355
Fly Food Vials	Fisher Scientific	AS-515
Foot Pedal	Treadlite II	T-91-S
Gel Caster	Bio-Rad	1704422
Gel Tray	Bio-Rad	1704436
Glass Pipette	VWR	14673-010
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Granulated sugar			Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil	Lab Scientific, Inc.	FLY-7000
Light Source	Schott	Ace I
Manipulator Stand	World Precision Instruments	M10
Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Needle Holder	World Precision Instruments	MPH310
Nightsea Filter Sets	Electron Microscopy Science	SFA-LFS-CY	For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head	Electron Microscopy Science	SFA-RB	For visualization of GFP
Paintbrush	Simply Simmons	Chisel Blender #6
Pipetter	Fisher Scientific	13-683C
Pneumatic Pump	World Precision Instruments	PV830	This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Small Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-100
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Steel Base Plate	World Precision Instruments	5052
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000	Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source	Baytronix		Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)	Genesee Scientific	20-258
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	Nonionic surfactant
Vial Plugs	Fisher Scientific	AS-273