שלב מוצק 11ג-מתילציה, טיהור וניסוח לייצור מנותבים PET

Summary

אנו מדווחים על טכניקה יעילה פחמן-11 רדיויניום לייצר מדורים הרלוונטיים קלינית עבור פליטת פוזיטרון טומוגרפיה (PET) באמצעות מחסניות החילוץ שלב מלא. מיכל בן ¹¹ C-מתילגדירוג הסוכן הוא עבר דרך מחסנית טעונה מטעון עם המבשר והחלף רצופים עם אתנול מימית מספק כימית וכימית לחיות מעוקב טהור בתשואות רדיוכימית גבוהה.

Abstract

הפקה שגרתית של רדיומשדרים המשמשים טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) בעיקר מסתמך על כימיה רטובה שבה synthon רדיואקטיבי מגיב עם מבשר לא רדיואקטיבי בפתרון. גישה זו מחייבת טיהור של מעקב באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (בדיקות) ואחריו ניסוח מחדש בממס תואם סתיימים המינהל האנושי. פיתחנו לאחרונה רומן ¹¹C-מתילציה גישה לסינתזה יעילה מאוד של פחמן -11 התווית PET radiopharmaceuticals, ניצול מחסניות מוצק הפאזה כמו חד פעמי "3-in-1" יחידות לסינתזה, טיהור ו ניסוח מחדש של המשדרים. גישה זו מצמצמת את השימוש במאבבי הטיפול ומפחיתה את ההפסדים של מכשיר המעקב בקווי העברה ועקב ריקבון רדיואקטיבי. יתרה מזו, הטכניקה המבוססת על מחסנית משפרת את אמינות הסינתזה, מפשטת את תהליך האוטומציה ומקלה על תאימות לדרישות הייצור הטוב (GMP). כאן, אנו להדגים טכניקה זו בדוגמה של ייצור של מעקב PET מתחם פיטסבורג B ([¹¹ג] pib), תקן זהב vivo הדמיה סוכן עבור לוחיות עמילואיד במוח האנושי.

Introduction

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) היא מודאליות הדמיה מולקולרית אשר מסתמך על זיהוי הריקבון רדיואקטיבי של איזוטופ המצורפת מולקולה פעילה ביולוגית כדי לאפשר הדמיה vivo של תהליכים ביוכימיים, אותות והעתקות . פחמן -11 (t_1/2 = 20.3 דקות) הוא אחד הרדיואיזוטופים הנפוצים ביותר ב PET בגלל השפע שלה במולקולות אורגניות ומחצית חיים קצר המאפשר מנהלות מעקב מרובים באותו יום לאותו נושא אנושי או בעלי חיים ו מפחית את העומס הרדיואקטיבי על המטופלים. משתמשים רבים המסומנים איזוטופ זה משמשים במחקרים קליניים ובמחקר בריאות בסיסי עבור vivo PET הדמיה של מטרות רלוונטיות ביולוגית והמתעוררים-[¹¹ג] Raclopride D₂/d₃ קולטנים, [¹¹ג] PiB עבור לוחיות עמילואיד, [¹¹ג] PBR28 עבור חלבון הטרנסמאתר-שם רק כמה.

פחמן -11 המסומנים מסמנים PET מיוצרים בעיקר באמצעות ¹¹C-מתילציה של שאינם-רדיואקטיביים מקדים המכילים-OH (אלכוהול, פנול ו-קרבוקסילית חומצה),-NH (אמין ואמיד) או-SH (thiol) קבוצות. בקצרה, האיזוטופ נוצרת ביעד הגז של ציקלוטרון דרך ¹⁴N (p, α)¹¹C תגובה גרעינית בצורה הכימית של [¹¹ג] CO₂. האחרון הוא הוסב [¹¹ג] מתיל ([¹¹ג] ch₃אני) באמצעות כימיה רטובה (הפחתה [¹¹ג] ch₃או עם lialh₄ ואחריו קוצ'ינג עם HI)¹ או יבש כימיה (הפחתה קטליטית ל [¹¹ג] CH₄ ואחריו ביודינציה רדיקלית עם מולקולרי אני₂)². [¹¹ג] CH₃אני יכול אז להיות המרה נוספת יותר תגובתי ¹¹C-מתיל triflate ([¹¹ג] CH₃otf) על ידי העברת אותו על העמודה triflate כסף³. ה ^-11C-מתילציה מבוצע לאחר מכן על ידי בעבוע על ידי מבעבע גז רדיואקטיבי לתוך פתרון של מקודמי לא רדיואקטיבי בממס אורגני או באמצעות הממס בשבי אלגנטי יותר "לולאה" שיטה^4,5. ה ^-11C-המעקב מטוהר לאחר מכן באמצעות הניתוח, שניסח מחדש מממס תואם ביולוגי, ועבר דרך מסנן סטרילי לפני שהוא מנוהל על ידי בני אדם. כל המניפולציות הללו חייב להיות מהיר ואמין בהתחשב בחצי החיים הקצרים של פחמן -11. עם זאת, השימוש במערכת הבחינה מגביר באופן משמעותי את ההפסדים של המעקב וזמן ההפקה, לעתים קרובות מחייבת את השימוש בממיסים רעילים, מסבך אוטומציה ומוביל מדי פעם לסינתזות כושלות. יתרה מזאת, הניקוי הנדרש של הכורים והטור מאריך את העיכובים בין הסינתזות של אצוות המעקב העוקבות ומגביר את החשיפה של כוח אדם לקרינה.

רדיוכימיה של פלואור-18 (t_1/2 = 109.7 min), השני בשימוש נרחב איזוטופ PET, כבר מתקדמים לאחרונה באמצעות פיתוח ערכות מבוססות קלטת כי ברור את הצורך טיהור הנוגדנים. על ידי שימוש מוצק החילוץ שלב (SPE) מחסניות, ערכות אלה חד פעמי לחלוטין לאפשר את הייצור השגרתי אמין של ¹⁸F-מנותבים, כולל [¹⁸f] fdg, [¹⁸f] fdg יסו, [¹⁸f] fdg ואחרים, עם סינתזה קצר יותר פעמים, מופחתת כוח אדם מעורבות ותחזוקה מינימלית של הציוד. אחת הסיבות פחמן -11 נשאר איזוטופ פופולרי פחות הדמיה PET הוא חוסר ערכות דומות לייצור השגרתי של ¹¹C-מנותבים. התפתחותם משפרת באופן משמעותי את האמינות הסינתטית, מגבירים את התשואות הרדיוכימיות ומפשטות את האוטומציה והתחזוקה המונעת של מודולי הייצור.

ערכות הייצור הזמינות כיום מנצלות את היתרונות של מחסניות ה-SPE הזולות, החד והחד-פעמיות במקום שימוש בעמודות לצורך הפרדת הרדיו מאיזוטופ רדיואקטיבי שאינו מגיב, מקודמן ומוצרים רדיואקטיביים ואחרים שאינם רדיואקטיביים. באופן אידיאלי, תגובת הרדיויניום ממשיכה גם באותו מחסנית; לדוגמה, the [¹⁸f] fluoromethylation של dimethylaminoethanol עם גז [¹⁸f] CH₂brf בייצור של סרטן הערמונית הדמיה מעקב לחיות מחמד [¹⁸f] fluoromethylכולין מתרחשת על מחסנית החלפת קטיון שרף ⁶. למרות הליכים דומים עבור הרדיואולבלינג של מספר ¹¹C-מנותבים על מחסניות דווחו^7,8 והפך חזק במיוחד עבור הרדיוסינתזה של [¹¹ג] כולין⁹ ו [¹¹ג] מתיונין¹⁰, הדוגמאות הללו נותרו מוגבלים למנותבים PET אונלוגיים שבו ההפרדה מן הקודמן הוא לעתים קרובות לא נדרש. אנו דיווחו לאחרונה על התפתחות של "[¹¹ג] ערכות" לייצור של^[11ג] CH₃אני¹¹ ו הבאים ¹¹C-מתילציה, כמו גם מוצק בשלב התמיכה הנתמכת הסינתזה¹² במטרות שלנו כדי ל פשט את הייצור השגרתי של ¹¹C-מנותבים. כאן, אנו רוצים להדגים את ההתקדמות שלנו באמצעות הדוגמה של השלב המוצק תמיכה רדיוסינתזה של [¹¹ג] pib, מעקב רדיוAβ אשר מהפכה את השדה של מחלת אלצהיימר (AD) הדמיה כאשר פותחה לראשונה בשנת 2003 ( איור 1) ^13,14. בשיטה זו, נדיף [¹¹ג] CH₃otf (bp 100 ° c) מועברת מעל 6-OH-bta-0 הפקיד הופקד על שרף של מחסנית חד פעמית. מעקב PET [¹¹ג] pib הוא הפריד אז מן הקודמן והרדיואקטיבי מבחינה רדיואקטיבית ידי הימנעות מן המחסנית עם אתנול מימית ביולוגי. יתר על כן, אנו אוטומטי שיטה זו של [¹¹ג] pib הסינתזה של הרדיו באמצעות מודול הפעלה מרחוק של רדיוכימיה וערכות קלטות חד פעמיות. באופן ספציפי, אנו מיושמים זה רדיוסינתזה על מודול הרדיוכימיה 20-שסתום, מצויד כונן מזרק (מנפק) המתאים סטנדרטי 20 mL מזרק פלסטי חד פעמיות, זרימת גז בקר, משאבת ואקום מד. בשל הפשטות של שיטה זו, אנו בטוחים כי ניתן לשנות את רוב הסינתיסייזרים אוטומטי זמין מסחרית, או מבוסס קלטות או אלה מצויד עם שסתומים נייחים. הטכניקה הנתמכת שלב זה מאפשרת [¹¹ג] pib הייצור תואם לתקנות הייצור הטוב (GMP) ומשפר את אמינות הסינתזה. הטכניקה המתוארת כאן מקטינה גם את כמות הנדרש לרדיוסינתזה, תוך שימוש במיסים תואמי "ירוק" בלבד ומפחיתה את הזמן בין אצוות ייצור עוקבות.

Protocol

1. הכנת מאגרים ומשחרלי מאגר

1. לפזר 2.72 גרם של סודיום אצטט הטרימים ב 100 mL של מים כדי להכין 0.2 M אצטט תמיסת נתרן (פתרון A).
2. התמוססות 11.4 mL של חומצה אצטית קרחוני ב 1 L של מים כדי להכין 0.2 M פתרון חומצה אצטית (פתרון B).
3. לשלב 50 mL של פתרון A עם 450 mL של פתרון B כדי להכין את מאגר אצטט ב-pH 3.7 (מאגר 1) על פי מרכז התייחסות מאגר¹⁵. ודא את ה-pH של המאגר עם רצועות pH או מד pH.
4. לשלב 12.5 mL של אתנול מוחלט עם 87.5 mL של מאגר 1 כדי להפוך 12.5% מימית פתרון אטוח (לשטוף 1) בקבוק 100 mL.
5. לשלב 15 מ ל של אתנול מוחלט עם 85 mL של מאגר 1 כדי להפוך 15% פתרון אטוח מימית (לשטוף 2) ב 100 mL בקבוק.
6. לשלב 5 מ ל של אתנול מוחלט עם 5 מ ל של מאגר 1 כדי להפוך 50% מימית פתרון אטוח (הסופי האחרון) ולצייר 2.5 mL של פתרון זה לתוך מזרק 10 mL.

2. יישום המבשר למחסנית

1. העבר 10 מ ל של מים ואחריו 5 מ ל של אצטון דרך המחסנית tC18 לתנאי זה.
2. ייבש את המחסנית עם זרם של חנקן בשעה 50 mL/min עבור 1 דקות.
3. התמוססות 2 מ ג מקודמן 6-OH-BTA-0 ב 1 מ ל של אצטון.
4. מחזיק Luer-עצה 250 μL מזרק זכוכית דיוק כלפי מטה, נסיגה 100 μL של הפתרון הקודמן ו50 μL של כרית אוויר על גבי הנוזל. הסר את המחט ולהחיל את הפתרון הקודמן על מחסנית tC18 מהקצה הנשי על ידי דוחף באיטיות את הבוכנה כל הדרך למטה. אל תדחף את הפתרון יותר!

3. הגדרת היריעה לסינתזה אוטומטית

1. אבטח את התקן הסטנדרטי 5-port מודול הסינתזה ולהרכיב אותו לפי איור 2 ושלבים 3.2-3.5 להלן.
   הערה: אנו ממליצים להשתמש בקפלים עמידים בפני אצטון (ראה טבלת חומרים).
2. . לפורט 1 יש שתי עמדות לחבר את כניסת האופקי למנפק האוטומטי מצויד עם מזרק 20 מ ל. חבר את השקע האנכי לבקבוק בכביסה 1.
3. לחבר את הפלט של המודול אשר מייצרת [¹¹ג] CH₃otf ליציאה 2 של סעפת.
4. התקן את מחסנית tC18 עמוסה במספר 6-OH-BTA-0 בין יציאות 3 ו-4.
5. . לפורט 5 יש שתי עמדות חבר את השקע האופקי לבקבוק פסולת אשר חייב להכיל לפחות 200 mL. חבר את השקע האנכי לבקבוקון הסטרילי לצורך איסוף מעקב באמצעות המסנן הסטרילי.

4. רדיוסינתזה של [¹¹ג] pib

התראה: כל מניפולציות הקשורות באיזוטופים רדיואקטיביים חייבים להתבצע בתא חם ומסוכך על ידי כוח אדם עם הכשרה נאותה לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים.
הערה: פרוטוקול זה אינו מכסה את פרטי הייצור של [¹¹ג] CO₂ ב ציקלוטרון ואת ההמרה שלה [¹¹ג] CH₃otf באמצעות מודול רדיוכימיה. הליכים אלה יהיו תלויים בציוד הפרטני של מעבדת הרדיוכימיה ומחוץ לטווח פרוטוקול זה. מרכז PET שלנו מצויד ברשות השידור ציקלוטרון, אשר מייצרת פחמן -11 בצורה כימית של [¹¹ג] CO₂דרך ¹⁴N (p, α)¹¹c תגובה גרעינית עם תערובת n₂/O₂ גז (99.5:0.5) גז ומודול זמין מסחרי לייצור של [¹¹ג] ch₃אני באמצעות "שיטה יבשה" (הפחתה קטליטי ל [¹¹ג] ch₄ ואחריו בעקבות השפעות קיצוניות). [¹¹ג] CH₃otf מופק על ידי העברת [¹¹ג] CH₃אני על עמוד triflate כסף מחומם ל 175 ° c ב 20 מ"ל/min.

1. לספק [¹¹ג] CH₃otf לתוך סעפת דרך היציאה 2 ולהעביר אותו דרך מחסנית TC18 טעון ב 20 mL/מינימום זרם פלט מוסדר על ידי [¹¹ג] ch₃מודול otf, דרך יציאות 3 ו-4 לתוך בקבוק פסולת כפי שמוצג על איור 2א.
2. לאחר כל הרדיואקטיביות הועברה לכוד על מחסנית tC18 כמו פיקוח על ידי גלאי רדיואקטיביות מאחורי מחזיק מחסנית, לעצור את זרימת הגז על ידי סגירת יציאה 2. תן את המיכל לשבת 2 דקות כדי להשלים את התגובה.
3. משיכה 19 מ ל של כביסה 1 פתרון (ראה שלב 1.4) מהבקבוק 100 mL לתוך מזרק מנפק דרך יציאת 1 ב 100 mL/min כפי שמוצג על איור 2B.
4. לחלק 18.5 mL של כביסה 1 פתרון מתוך מנפק דרך מחסנית tC18 באמצעות יציאות 3 ו 4 לתוך בקבוק הפסולת ב 50 mL/min כפי שמוצג על איור 2C. הקפידו על העדר בועות אוויר ביריעה משום שהם עלולים לצמצם את יעילות ההפרדה.
5. חזור על שלבים 4.3 ו 4.4 ארבע פעמים, נסיגה וחילוק 18.5 mL של כביסה 1 פתרון בכל פעם. הנפח הכולל של כביסה 1 פתרון עבר דרך tC18 הוא 92.5 mL; עם זאת, זה יכול להשתנות בתוך 90-100 mL טווח בהתאם מודול סינתזה מסוים בשימוש.
6. החלף את קו הקלט ביציאה 1 משטיפה 1 כדי לשטוף את 2 התמיסה (ראה שלב 1.5).
7. חזור על שלבים 4.3 ו 4.4 שלוש פעמים, נסיגה וחילוק 18.5 mL של כביסה 2 פתרון בכל פעם. הנפח הכולל של כביסה 2 הפתרון עבר דרך tC18 הוא 55.5 mL. עם זאת, זה יכול להשתנות בתוך 50-60 mL טווח בהתאם מודול סינתזה מסוים בשימוש.
8. החלף שסתום 5 לעבר הבקבוקון הסופי כפי שמוצג על איור 2ד. לנתק את הקו מתוך מנפק ולחבר אותו 10 מזרק mL המכיל 2.5 mL של הפתרון הסופי להתחמק (50% מימית, ראה שלב 1.6) ו 7.5 mL של אוויר.
9. מחזיק את המזרק כלפי מטה, לדחוף ידנית את הפתרון להתחמק הסופי (2.5 mL) ואחריו אוויר (7.5 mL) דרך מחסנית tC18 דרך יציאות 3 ו 4 לתוך בקבוקון סטרילי עבור אוסף מעקב באמצעות מסנן סטרילי כפי שמוצג על הדמות 2ד.
10. נתק את המזרק הריק, חבר את מזרק 10 mL המכיל 10 מ ל של מאגר פוספט סטרילי (מתכון לא כלול כפי שהוא עשוי להשתנות) ולדחוף את הנפח כולו דרך מחסנית tC18 לתוך הבקבוקון סטרילי כפי שמתואר לעיל (איור 2ד ). לנתק את המזרק ולשטוף את קו עם 10 מ ל של אוויר באמצעות מזרק אותו.
11. נסיגה 0.7 mL של ניסוח המעקב הסופי ולאסוף דגימות עבור הליכי בקרת איכות (0.1 mL), בדיקת אנדוטוקסין חיידקי (0.1 mL) ועקרות (0.5 mL).

5. הליכי בקרת איכות

התראה: כל אצווה של מעקב הרדיוחייבת להיות נתונה להליכי בקרת האיכות המתאימים (QC) לפני שחרור לאתר הדמיה PET עבור המינהל לנושאים אנושיים או בעלי חיים. המחברים של כתב יד זה אינם אחראים לציות הרדיומעקב המיוצר במרכזים אחרים עם תקנות הבריאות המקומיות.

1. בצע טרום שחרור הליכים QC, אשר חייב לכלול בדיקות של זהות רדיוכימית (RCI), כימיה רדיוכימית (RCP), טוהר כימי ופעילות טוחנת של מעקב, כמו גם שיורית תוכן הממס ו-pH של ניסוח.
2. לקבוע את RCI, RCP, טוהר כימי ופעילות טוחנת באמצעות מערכת הניתוח האנליטי מצויד UV (ניטור ב 350 ננומטר) ו רדיואקטיביות גלאי, ו טור היפוך-שלב. לקבוע את זמני ההחזקה של 6-או-BTA-0 ו 6-OH-BTA-1 ולכייל את המכשיר כדי לכמת את התוכן של כל תרכובת.
3. לקבוע את התוכן הממס שיורית באמצעות מערכת כרומטוגרפיה של גז אנליטי מצויד בטור נימי. לקבוע את זמני ההחזקה של אצטון ואתנול ולכייל את המכשיר כדי לכמת את התוכן של כל ממיס.
4. לבצע את הבדיקה אנדוטוקסינים באמצעות קורא מחסנית מצויד מחסניות מתאים.
5. לבצע ניתוח עקרות של המדגם לפחות 14 יום לאחר סינתזה כדי להבטיח העדר צמיחה חיידקית או לשלוח את דגימת עקרות למעבדה מוכר על ידי רשות הבריאות המקומית.

תוצאות

כדי לסכם רדיוסינתזה טיפוסית של [¹¹ג] pib, גז [¹¹ג] CH₃otf הוא עבר הראשון באמצעות מחסנית tC18 מראש עם פתרון של הקודמן (איור 1). הפרדת תערובת התגובה מושגת לאחר מכן על ידי הימנעות מאספקת פתרונות אתנול מימית כדלקמן. ראשית, 12.5% אטואה הרוב של הגיב [¹¹ג] ...

Discussion

למרות הופעתה האחרונה ואת אישור ה-FDA של מספר ¹⁸F מסומן PET מסומנים, כגון florbetapir, florbetaben ו flutemetamol, [¹¹ג] pib נשאר מעקב התקן זהב הדמיה עמילואיד בשל ספיגת המוח מהיר נמוך לא ספציפי איגוד. כיום מעקב זה מסונתז באמצעות כימיה רטובה¹⁶ או באמצעות "לולאה יבשה" גישה^4,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytical HPLC system
Ethanol absolute	Commercial alcohols	432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system	Perkin Elmer	Clarus 480	Gas chromotograph
polycarbonate manifold	Scintomics	ACC-101	Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm)	Restek	70625-273	Analytical GC column
Scintomics GRP module	Scintomics	Scintomics GRP	Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold	Scintomics	ACC-201	Synthesis manifold
Spinal needle	BD	405181
Sterile extension line	B. Braun	8255059
Sterile filter	Millipore	SLLG013SL
Sterile vial (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterile water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL)	BD	309604
Syringe (1mL)	BD	309659
Syringe (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser syringe
Vent filter	Millipore	TEFG02525