JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול להדמיה תלת-ממדית של מבני רקמה מיקרוסקופיים באמצעות שיטה מכתימת רנטגן ספציפית המיועדת לטומוגרפיה ממוחשבת של X-ray מוצגת.

Abstract

אנו מדגימים שיטה מבוססת מעבדה המשלבת X-ray microCT ו nanoCT עם כתם מסוים רנטגן, אשר מטרות הציטופלסמה התא. הפרוטוקול המתואר קל ליישם, מהיר ומתאים לדגימות הרקמה הרך יותר. המתודולוגיה המוצגת מאפשרת אפיון של מבנה רקמות מכריע בשלושה מימדים והוא מוצג על כליה העכבר כולו. הגישה רב-היקף מאפשרת לדמות את כליה העכבר כולו ותומכת במבחר של כמויות נוספות של עניין, אשר נרכשו עם רזולוציות גבוהות יותר הנעים לתוך טווח ננומטר. ובכך, מורפולוגיה רקמה רכה עם רמת פרטים דומה כמו תמונות מיקרוסקופ אור היסטולוגית המקביל משוחזר. תובנות עמוקות יותר לגבי התצורה התלת-ממדית של מבני הרקמה מושגת מבלי לסכל חקירות נוספות בשיטות היסטולוגית.

Introduction

איפיון מלא של דגימות רכות מחייב מידע על המיקרו מבנה רקמות 3D. התקן הזהב הנוכחי עבור ניתוח לדוגמה רקמה רכה הוא histopathology. את הרקמה ואת המבנה הסלולארי של הדגימה הם חקרו ב 2D בתוך אזורים נבחרים של עניין (ROIs) באמצעות מיקרוסקופ אופטי1. שיטה זו, עם זאת, יש כמה החסרונות. הכנת המדגם הוא זמן רב, מסובך, הרסני ונוטה לפריטים. השקופיות המיקרוסקופיים המיוצרים מספקות רק מידע דו-ממדי במקביל למישור הניתן לזיהוי. לעתים קרובות מספר סעיפים היסטלוגיים, אשר נחקרים, מוגבל עקב אילוצי זמן2,3.

בשנים האחרונות, בשדה של 3D היסטולוגיה התפתחו. כאן, פרוסות רקמה וירטואלית מכל מטוס מרחבי הרצוי נגישים. זה מאפשר מעקב של מבנים לאורך המדגם, אשר מוביל הבנה עמוקה יותר של האדריכלות רקמה 3D ושינויים מבניים הקשורים בפתווגיות שונות. שיטות שונות פותחו כדי להשיג את הדור של נתוני נפח תלת-ממד. הם נעים בין גישות מבוססות-מחלקה טורית, המשתמשות במיקרוסקופ אור או אלקטרון4,5,6,7,8, כדי לחסום שיטות דימות, כגון הדמיה תלת-ממדית של הבישופות או סריקת הפנים האלקטרוניםמיקרוסקופ 7,8,9. עם זאת, כל השיטות שהוזכרו כרוכות במתן הוראות או השמדה מוחלטת של המדגם, שאינו מאפשר חקירות נוספות. הפתרון המתקבל תלוי מאוד בתהליך ההפרדה הנוטה לפריטים כמתואר היסטולוגיה קונבנציונאלי. שיטות אלו סובלות גם מחפצי היישור.

3D רנטגן טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה מיקרוסקופית nanoscopic ממוחשבת (microCT ו-Nanoscopic) שואפים ליצור נתונים ברזולוציה גבוהה 3D ללא הרס של דגימת רקמות. עד כה, הפגיעה החלשה בקרני רנטגן של רקמות רכות והגישה המוגבלת לרזולוציות גבוהות בסביבת מעבדה מחלישה את השימוש בהדמיה תלת ממדית של מבני רקמה מיקרוסקופיים. ההתקדמות האחרונה כלפי מעבדה, ברזולוציה גבוהה X-ray CT לאפשר החלטות היטב מתחת 1 יקרומטר10,11,12,13.

חוסר הניגודיות ברקמה הרכה בדימות מבוסס רנטגן קונבנציונאלי הוא פיצוי על ידי סוכני מכתים, אשר משפרים את הניגוד בקרני רנטגן. כתמי סוכנים הידועים מטכניקות דימות אחרות כגון אוסמיום tetroxide (OsO4), יוד אשלגן יודיד (iki) או phosphotungstic חומצה (וועד ההורים) משמשים לעתים קרובות14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. מכתים סוכנים המאפשרים (i) מיקוד ביולוגי ספציפי, (ii) כתמים הומוגנית ומלאים, (iii) טיפול קל, (iv) חדירה מהירה של הרקמה מבלי ליצור חפצים כגון טבעות דיפוזיה, (v) מכתים רקמות גדולות וצפופות, ו (vi) תאימות מלאה עם histopathology נדרשים להקים רנטגן CT ככלי להדמיה 3D של מבנים רקמות מיקרוסקופיים. בעבודה זו, אנו מראים כיצד מכינים דוגמאות רקמה רכה לדימות רנטגן CT עם כתם רנטגן ספציפי ציטופלסמה המבוסס על אאוזין המקיימת את הדרישות האמור לעיל26.

הגישה הדמיה multiscale מבטיחה את ההערכה של איכות הצביעת באמצעות מדידה microCT סקירה והבחירה של כרכים של ריבית (VOIs) עבור חקירות ברזולוציה גבוהה יותר. מכתים איכות מנותח התמקדות על פרמטרים כגון (i) השלמות, (ii) המראה של טבעות דיפוזיה, (iii) שיפור ניגודיות, (iv) המראה של ממצאים CT כגון פסים ו (v) הומוגניות. התוכנית nanoct המבוססת על מעבדה, המשתמשת בהגדלה גאומטרית כדי להגיע לרזולוציות עד 100 ננומטר, ולדמיין מורפולוגיה של רקמות רכות על (sub)-ברמה התאית10,27. ניתוח השוואתי של פרוסות nanoCT עם תמונות מיקרוסקופ אור היסטולוגית המקביל מאשרת את הרבייה של ארכיטקטורת רקמות עם פרטים דומים ברמה מיקרוסקופית ב-2D, המאפשר אפיון היפואוולוגי של הרקמה דוגמה. פרוטוקול וידאו מפורט זה נועד להעלות את המודעות וכדי להדגיש את הפוטנציאל של מתודולוגיה זו ככלי תלת-ממד הרסני לדימות רקמה רכה להיות מעניין לקהילה מדעית רחב כגון זואולוגים, ביולוגים ובריאות אנשי מקצוע.

Protocol

שים לב: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקול הם רעילים ומסרטנים בחריפות. אנא השתמש בכל שיטות הבטיחות המתאימות בעת ביצוע פרוטוקול הצביעת, לרבות השימוש בבקרת הנדסה (מכשירי כיסוי, גלווובוקס) וציוד הגנה אישי (כוסות בטיחות, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסי אורך מלא, נעלי הבוהן סגורות).

בעלי חיים בשימוש:
השיכון בעלי חיים נערך באוניברסיטת מינכן, בהתאם להנחיות ה2010/63 של האיחוד האירופי. הסרת איברים אושרה מוועדה פנימית להגנת בעלי חיים של קלייאיאום rechts דר ' איסר, מינכן, גרמניה (התייחסות פנימית מספר 4-005-09). כל ההליכים היו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל המעבדות נבדקות בהתאם לעקרונות ה-OECD של פרקטיקה מעבדתית טובה.

1. פרוטוקול אאוזין מכתים

  1. כדי לקבוע דגימות של רקמה רכה, למלא שפופרת צנטריפוגה 50-mL עם פתרון התקבע המכיל 9.5 ml של 4% (v/v) הפתרון פורמלדהיד (פא) ו 0.5 ml של חומצה אצטית קרחוני (AA).
    הערה: הכינו את פתרון הפא הטרי מ-37% חומצה ללא תשלום של ה-FA התייצב עם משוער של 10% ממתנול. דלל את פתרון ה-FA עם תמיסת המלח המאגור פוספט של דולבco (DPBS). בחר DPBS ללא סידן ומגנזיום. שמור על פתרון ה-FA המהול לא יותר מחודש אחד. במהלך החמצה ה-pH של התמיסה הקבע משתנה מניטראלי ל-3 בקירוב.
    התראה: מכיוון ש-FA היא איבר חריף, רעיל ומסרטן, השימוש במנוע הוא הכרחי והציוד האישי המגן המתאים חייב להיות בשימוש.
    1. הוסיפו את דגימת הרקמה הרכה שהוסרה טרי לצינור הצנטריפוגה 50-mL ולהכניס למקרר את שפופרת הצנטריפוגה 50-mL במשך 24-72 h.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
    2. לשטוף את דגימת רקמה רכה עם פתרון DPBS עבור 1h.
  2. כדי להכתים את המדגם מקובע רקמה רכה (למשל, כליה העכבר השלם), מניחים את הרקמה הרכה ב 2 מ ל של אאוזין Y-כתמי הפתרון ואת המדגם עבור 24 שעות. שמור את המדגם על צלחת לרעוד אופקית עבור נדנדה חלקה (ca. 60 rpm) במהלך הדגירה תהליך.
    הערה: לפתרון האאוזין Y יש ריכוז של 30% (w/v) במים מזוקקים. בחר את הנפח של פתרון הצביעת בצורה כזאת, כי המדגם מכוסה לחלוטין על ידי הפתרון הכתים ולאפשר את המדגם לנוע בחופשיות בתוך המיכל לדוגמה. זמן הדגירה עשוי להיות שונה עבור דגימות אחרות צריך להיות מותאם בהתאם.
  3. לאחר הצביעת, הסירו את דגימת הרקמה הרכה בזהירות ממיכל הדגימה.
    1. בזהירות להסיר העודפים של סוכן הצביעת עם נייר רקמה תאית.
    2. מניחים את דגימת הרקמה הרכה במיכל מדגם חרוט מעל לשלב אדי אתנול לאחסון ושימוש נוסף.
      הערה: המכל לדוגמה החרוט חייב תמיד להכיל כמה טיפות של 70% (v/v) אתנול בתחתית הצינור כדי לשמור על דגימת רקמה רכה לחות ולמנוע חפצים.

2. רנטגן מיקרוct הדמיה

הערה: מדידות מיקרוct ברנטגן בוצעו עם סורק microCT, אשר מציע סקירה מדידות CT (היכולת לדמות את המדגם כולו בתוך שדה התצוגה (FOV)) ואת הביצועים של מדידות CT ברזולוציה גבוהה (היכולת להתמקד על כרך אחד הרצוי של הריבית (VOI) של המדגם זהה מאוד) עד 1 μm.

  1. הר את דגימת רקמה רכה למחזיק מתאים המדגם. להבטיח התאמה מלאה של המדגם על מחזיק המדגם כדי למנוע את המדגם מעבר במהלך מדידות X-ray CT.
    1. במקרה של כליה העכבר ויטראז: להכין מחזיק לדוגמה עם שני צינורות צנטריפוגה, לפיו התחתון של צינור אחד נחתך. הדבק את שתי צינורות הצנטריפוגה יחד באמצעות דבק שני רכיבים. ודא יישור ישר של צינורות הצנטריפוגה סביב ציר הסיבוב. . חכו לדבק שלכם
    2. לאחר מחזיק המדגם מוכן לשימוש, להעביר את כליה העכבר לתוך צינור הצנטריפוגה שלמים, אשר מחזיקה כמה טיפות של 70% (v/v) אתנול בתחתית הצינור.
      הערה: יציבות המדגם היא קריטית. לקחת את הזמן כדי להכין את המדגם למדידות רנטגן CT. מדגם הרקמה הרך נשמר על ידי שלב אדי אתנול כדי לשמור על לחות המדגם במהלך מדידות רנטגן CT ולמנוע את דגימת רקמה רכה הצטמקות וחפצים אחרים. מדגם הרקמה הרכה לא צריך להיות במגע עם ממיס כדי הצטברות ברור של הממס סביב המדגם במהלך מדידת רנטגן CT, אשר עשוי להוביל התנועה לדוגמה במהלך המדידה או עלול לגרום לבעיות במהלך השיקום. אם מחזיק המדגם אינו מאפשר להחזיק את הממס בתחתית, נייר תאית שהיה לחלח עם 70% (v/v) האתנול ניתן להציב במחזיק לדוגמה. יצוין כי הצטמקות חפצים בשל אתנול ממס לא נצפו.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  2. לאחר יישור זהיר של המדגם, בחר פרמטרי רכישה עבור איכות התמונה הטובה ביותר. במקרה של הנתונים microCT הציג, לרכוש את הסריקה במתח השיא של 50 kV, זרם של 3.5 W שימוש בתחזיות 1601 באופן שווה על 360 °.
    הערה: פרמטרי הרכישה של סריקת CT הסקירה נבחרו לאיכות התמונה הטובה ביותר. כמו מטרת המצלמה 0.39 x נבחרה לכסות את המדגם כולו בתוך שדה התצוגה (FOV). זה הביא לגודל פיקסל אפקטיבי של 12 μm. זמן החשיפה של 2 s לכל הקרנה סיפק אות טוב ליחס הרעש. ההחזר עבור סריקת CT ברזולוציה גבוהה זוהה באמצעות נתוני microCT מסריקת סקירה. סורקים MicroCT לעתים קרובות לשלב כלי תוכנה משולבת, אשר מאפשר מבחר מדויק של ROI נחוש. עבור נתוני CT ברזולוציה גבוהה, מטרת המצלמה 4x נבחרה וכתוצאה מכך גודל פיקסל אפקטיבי של 3.3 μm. כאן, נדרש זמן חשיפה של 15 מנות להקרנה.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  3. לאחר הרכישה של נתוני X-ray, לעבד את התחזיות בהתאם לשחזור של נפח תלת-ממד. במקרה של נתוני microCT שהוצגו: בנייה מראש של נתוני X-ray עם התוכנה המשולבת.
    הערה: העיבודים לאמצעי האחסון של נתוני microCT המוצגים באיור 1 ובאיור 2 נוצרו באמצעות תוכנת ויזואליזציה.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. רנטגן הדמיה nanoCT

הערה: סורק X-ray nanoCT פותחה. מכשיר חינם העדשה מצויד nanofocus מקור רנטגן וגלאי ספירה בודד פוטון. 3D נתונים עם החלטות למטה כדי 100 ננומטר יכול להיווצר10. באופן כללי, מערכות nanoCT כולל אלה עם אופטיקה רנטגן זמינים מסחרית ולא מוגבל לסורק nanoCT המתואר.

  1. הכנה לדוגמא נאנאוק
    1. . הכינו את ווארה לדגימת הרקמה הרכה חותכים את הרקמה הרך לחתיכות קטנות מאוד של כ 0.5 מ"מ אורך קצה באמצעות אזמל ו stereomicroscope. במקרה של כליה העכבר: לחתוך את כליה העכבר לשני חצאים לאורך הציר הארוך ביותר. קח חצי אחד של כליה העכבר ולהכין אזורים אנטומיים שונים כגון קליפת הכליה וליבת הכליה.
      הערה: החצי השני של כלייה של העכבר הועברה להיסטומטולוגיה, שם המדגם היה מוטבע פרפין ועיבד בהתאם כדי להניב את הסעיפים היסטולוגית אופייני לראות באיור 3c ואיור 3ד .
    2. להעביר את החלקים הקטנים לפני התייבשות הראשון צעד לצלחת פטרי חדשה, שם הם נשארים עבור כל הצעדים הבאים.
    3. מייבשים את הדגימות באמצעות ריכוזי (כל v/v) ב%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 ו-100 אתנול מאוזנת עם מים מזוקקים. בצע כל צעד התייבשות עבור 1 h כל.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. שמור את חתיכות הרקמה הקטנה ב-100% אתנול בן לילה.
    4. הנקודה הקריטית יבש (CPD) את חתיכות הרקמה הקטנה.
      הערה: היישום של CPD מאפשר התייבשות מלאה של דגימת הרקמה על ידי החלפת הממס (כאן אתנול) עם סוכן ייבוש (כאן CO2). זה היה הכרחי כדי לוודא את המדגם ניתן לרכוב על מחזיקי המדגם של nanoCT, לא נע במהלך המדידה והוא יכול להיות ממוקם קרוב מאוד למקור רנטגן כדי לאפשר את ההגדלה הטובה ביותר גיאומטרי. ההתקנה של nanoCT מבוססת על הגדלה גאומטרית בלבד, כאשר גורם ההגדלה מוגדר כמרחק ממקור לגלאי במרחק ממקור למדגם. טכניקת הייבוש הוצגה לראשונה על ידי אנדרסון על מנת לשמר את המבנה התלת-ממדי של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופ אלקטרוני משנת28. מבט כולל על הטכניקה מסופק על ידי בריי29.
      1. למלא את חדר ואקום עם 100% אתנול. להעביר את חתיכות הרקמה הקטנה לתוך הקפסולה מיקרו נקבובי ולמקם אותו בתא ואקום של CPD.. תסגור את המערכת
        הערה: כיוון שהלחץ הגבוה מעורב בתהליך ה-CPD, יש לוודא שכל חלקי ה-CPD, בפרט האביזרים, אינם תקינים והמערכת סגורה כראוי.
      2. מצננים את החדר עד 6-8 ° c ומתמלאים בתוספת נוזלית2.
      3. תוך כדי ערבוב, לחכות 3 דקות כדי לאפשר ערבוב הנכון של שני הרכיבים. . רוקן בזהירות את החדר ודא שמחזיק הדגימה עדיין מכוסה בממס. חזור על שלב זה 10 פעמים כדי לאפשר החלפת מלאה של אתנול עם CO2 בתוך המדגם.
      4. לאחר המילוי הסופי של החדר עם CO2, לחמם את המכונה בנקודה קריטית של co2 (31 ° c ו 73.8 bar) ואחריו שחרור מאוד איטי של שיתוף גזי2 במשך זמן של 30 דקות.
        הערה: השחרור של הגז צריך להתבצע באיטיות רבה ככל שניתן לדחוס מים על המדגם. ודא כי הטמפרטורה אינה ירידה מתחת לנקודה קריטית של CO2. רק לפתוח את מכונת CPD כאשר כל הלחץ שוחרר מהמערכת.
      5. הסר את הרקמה CPD במהירות מן המכונה ולשמור אותם בצלחת פטרי חדשה המאוחסן desiccator לפני שימוש נוסף.
        הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  2. הר את חתיכות הרקמה CPD למחזיק לדוגמה המתאימה. ודא התאמה מלאה של המדגם על מחזיק הדגימה כדי למנוע מהדוגמה לנוע במהלך מדידות ה-CT. במקרה של העכבר CPD כליה חתיכות רקמה: להדביק את חתיכות הרקמה עם דבק על מחזיק מדגם.
    הערה: כל תנועה בלתי רצויה של המדגם במהלך מדידות CT עלולה לגרום לבעיות במהלך שחזור נפח-במיוחד בעת רכישת ערכת נתונים עם גודל nanxel.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  3. לאחר יישור זהיר של המדגם, בחר פרמטרי רכישה עבור איכות התמונה הטובה ביותר. במקרה של הציג את הנתונים nanoCT: לרכוש תחזיות במתח שיא של 60 kV עם 1599 תחזיות באופן שווה הופץ על 360 ° ובגודל voxel של כ 400 ננומטר.
    הערה: מדידת CT אחת שנרכשה ב 400 ננומטר voxel גודל יש fov של 75 יקרומטר לכיוון ציר הסיבוב (אנכי) ו כ 560 יקרומטר בכיוון בניצב לציר הסיבוב (אופקי). כדי לחקור אמצעי אחסון גדולים יותר, ניתן להשיג הארכה של FOV לאורך ציר הסיבוב על-ידי שילוב סריקות מרובות במיקומים אנכיים שונים. בנוסף, סריקות טומוגרפיה מקומית ניתן לבצע כדי למדוד דגימות עם קוטר מדגם גדול בניצב לציר הסיבוב מאשר ניתנה על ידי FOV של סריקת CT גלובלית. נתוני nanoCT נרכשו עם זמן חשיפה של 4 s לכל הטלה. ככזה זמן הרכישה הכולל לכל ערכת נתונים היה כ 3.5 h.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  4. לאחר הרכישה של נתוני ה-CT, עבד את התחזיות בהתאם לשיחזור הנפח התלת-ממדי.
    1. במקרה של נתוני nanoCT שהוצגו, לנרמל את התחזיות הנרכשים עם תמונות flatfield. לשפר את החדות של התחזיות על ידי שימוש באלגוריתם של ריצ'רדסון לוסי דבולטור30,31. השתמש בפונקציית גאוסיאנית סימטרית מבחינה חישובית עם סטיית תקן של פיקסל אחד כליבת פירוק.
    2. להחיל אלגוריתם הפאזה של Paganin לתמונות מחודדים כדי להגדיל את הניגודיות רקמה רכה. הגדר את הפרמטרים של האלגוריתם כדי למטב את איכות התמונה32. בנייה מחודש של התחזיות שעובדו מראש עם אלגוריתם הקרנת רקע מסונן משוכלל.
      הערה: איור 3 מעריך את נתוני nanoct שהתקבלו עם סעיפים היסטלוגיים המתאימים, אשר היו כ -7 יקרומטר עבה. לכן, מינימלי ההקרנה פרוסות של 18 פרוסות nanoct סמוכים עם עובי וירטואלי של כ 7 יקרומטר נוצרו באמצעות חישוב הערך המינימלי עבור כל פיקסל בפרוסות הרלוונטיות. תוכנת הדמיה שימש לעיבוד העוצמה של נתוני nanoCT, אשר מוצג באיור 4.

תוצאות

איור 1 מציג פרוסות CT ורינדור נפח של נתוני microct ברזולוציה נמוכה המדגיש שיפור ניגודיות לאחר כתמים. איור 2 מראה פרוסות CT ועיבוד אמצעי אחסון של נתוני microct ברזולוציה גבוהה, הנגזרים מטומוגרפיה מקומית של כליה כולה. איור 3 מראה פרוסות CT של נתוני nanoct בהשוואה לסעיפים היסטלוגיים המתאימים. איור 4 מראה פרוסת CT ועיבוד נפח של הנתונים nanoct הדגשת פרטים מבניים ברמה התאית. מדידת ה-microCT ברזולוציה נמוכה מאפשרת סקירה של האיבר כולו ומסייעת לזהות אמצעי אחסון של ריבית (VOIs) עבור מדידת מיקרו-Ct ברזולוציה גבוהה. באמצעות גישה זו רב מידה, VOI עבור nanoCT נקבע. NanoCT מאפשר תצוגה מפורטת מאוד של דגימת רקמה רכה ברמה התאית. המחקר השוואתי עם הסעיף היסטולוגית המקביל מדגיש תאימות מלאה עם histopathology. כאן, גישת ההדמיה הרב-מודאלית מאמתת את התוצאות המתקבלות בשתי האופנים.

figure-results-971
איור 1. פרוסות CT ועיבוד אמצעי אחסון של נתוני microCT ברזולוציה נמוכה. (א, ב) תמונות סקירה של כליה העכבר אותו לפני ואחרי כתמים, בהתאמה, הדגשת שיפור הניגודיות שהושג לאחר היישום של פרוטוקול האאוזין מבוססי הצביעת. שתי ערכות הנתונים של microCT נרכשו באמצעות פרמטרי רכישה זהים. גודל voxel בשתי ערכות הנתונים הוא 12 μm. שיפור הניגודיות שהושג (ב) מאפשר זיהוי של האזורים המבניים הבאים: קליפת (I), הלשד החיצוני (II) עם הבחנה נוספת הפסים החיצוניים של לשד החיצוני (iia) ופסים פנימיים של לשד החיצונית (iib), לשד פנימי (III), פאדילה (IV) ואגן הכליה (V). (ג) נפח הרינדור של נתוני microct המציגים מקטע משונן וירטואלי דרך כליה העכבר כולו. דמות זו שונתה מ בוסה ומולר ואח '26אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2011
איור 2. CT פרוסה ועיבוד נפח של נתונים ברזולוציה גבוהה microCT נגזר מכליה העכבר זהה לאחר היישום של הפרוטוקול המפותח אאוזין מבוססי כתמים. (א) הפינה השמאלית מציגה את תמונת המיקרו-ct של הסקירה המציגה את ההחזר (התיבה הכחולה) עבור התמונה המוצגת ברזולוציה גבוהה. האזורים המבניים הבאים: קליפת המוח (I), הלשד החיצוני (II) עם הבחנה נוספת בפסים החיצוניים של לשד החיצוני (iia) ופסים פנימיים של לשד החיצוני (iib), הלשד הפנימי (III), גביע מינורי (IV) וכלים (V ו-VI). (ב) נפח של עיבוד הריבית של נתוני microct ברזולוציה גבוהה שנרכשו עם גודל voxel של 3.3 μm. אזור לשד ומקטע וירטואלי דרך כלי שנגזר טומוגרפיה מקומית של הכליה כולה מוצג. דמות זו שונתה מ בוסה ומולר ואח '26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3030
איור 3. פרוסות CT של נתוני nanoCT (a, b) בהשוואה לסעיפים היסטלוגיים (c, d) נגזר מאותה כליה העכבר לאחר היישום של הפרוטוקול המפותח אאוזין מבוססי כתמים. (א) התמונה nanoct של מדגם כליה העכבר זהה לאחר כתמים, מבתר ו cpd מראה מבנים מפורטים של אזור (iib) נראה באיור 1 ואיור 2. אלה ידועים כגפיים עבות העולה על הלולאה של Henle. (ב) הקרנה בעוצמה מינימלית הנגזרת מערכת נתוני nanoct המוצגת ב (א) עם עובי פרוסה וירטואלי של כ -7 μm, המאפשרת הדמיה ברורה של גרעיני התא. (ג) בסעיף היסטולוגית המייצגת את הגפיים העבות של לולאה של henle עם הדמיה ברורה של גרעיני התא וגבול מברשת. בסעיף היסטולוגית יש עובי משוער של 7 יקרומטר והתקבל ממדגם כליה העכבר זהה לאחר האאוזין מוחל מבוססי כתמים והטבעה בבלוק פרפין. (ד) מחלקת היסטולוגית עם יישום המטאוקסילין של כתם הנגד המדגיש את גרעין התא בסגול. הכנת מקטע היסטולוגית קרוב למקטע המוצג (c) עם עובי של 7 μm. דמות זו שונתה מ בוסה ומולר ואח '26אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4379
איור 4. CT ועיבוד נפח של נתוני nanoCT. (א) התמונה nanoct של מדגם כליה העכבר זהה מראה את המבנים הידועים כגפיים העולה עבה של הלולאה של henle. זוהי תצוגה מפורטת של אזור (IIb) לראות באיור 1 ואיור 2 רכשה מתוך חלק קטן של הכליה עם גודל voxel של כ 400 ננומטר. הכנת המדגם מעורב כתמים, מבתר ו-CPD. (ב) נפח הרינדור של הנתונים nanoct להמחיש את המבנה 3d של הגפיים בעלייה עבה של לולאות של henle. דמות זו שונתה מ בוסה ומולר ואח '26אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כיום, אאוזין משמש כפרוטוקול היסטולוגית סטנדרטי כדי לתייג את הציטופלסמה התא. הסוכן מכתים מוחל כמו 0.1% (w/v) פתרון מימית לפרוסות מיקרוסקופיים של רקמה רכה (בדרך כלל לחתוך עם עובי של 2-10 μm)33. היישום של פרוטוקול זה היסטולוגית סטנדרטית לדגימות 3D רקמה כגון כליה עכבר שלם לא התוצאה בניגוד החליש התמונה משופרת CT. מצד אחד, זה יכול להיות מיוחס מאפייני החלשה פנימית נמוכה של רקמה רכה עבור בדרך כלל משמש אנרגיות רנטגן של מערכות מעבדה microCT מבוססי. בדרך כלל, רקמה רכה מורכב בעיקר פחמן, מימן, חמצן ו חנקן34, ולכן, לא גורם לשיפור בניגוד. מצד שני, הריכוז הנמוך של אאוזין המשמש לצביעת היה הגורם המגביל. למרות שמולקולה אאוזין אחת מחזיקה ארבעה אטומים ברומיד (המרכיב האטומי הגבוה ברום עם Z = 3534), רמות הרגישות הדרושות עבור הדמיה X-ray CT לא נפגשו.

כדי להתגבר על האתגר הזה של ניגודיות נמוכה החלשה, כמה ריכוזים של אאוזין נחקרו. מגבלה היא כאן את המסיסות המקסימלית של אאוזין במים, אשר 30% (w/v) בתמיסה מימית. השיפור הטוב ביותר שיפור ניגודיות בתוך הרקמה הרך נצפתה עם הריכוז האאוזין הגבוה ביותר, אשר צפוי על פי חוק למברט-באר. לכן, פרוטוקול הצביעת הסופי בוצע בריכוז הגבוה ביותר.

השאלה כיצד להכין את הרקמה הרך בצורה אופטימלית ברמה מולקולרית עבור הליך כתמים כדי לשפר עוד יותר שיפור הניגודיות נענתה על ידי כוונון ה-pH. כאן, חמצה של דגימת רקמה רכה במהלך קיבעון או לפני כתמים נמצא קריטי. זה הוצג גם על ידי הונג et al.35. הצטברות גבוהה יותר של סוכן מכתים בתוך התא הציטופלסמה באמצעות חומצה הושגה באמצעות אינטראקציות יונית משופרת, אשר היו תוצאה של פרוטונציה של שרשראות צד חומצות אמינו של חלבונים פפטידים הנמצאים בתוך הציטופלסמה התא. תוצאה של נציג המדגיש את שיפור הניגודיות בהשוואה לדגימת רקמה רכה בלתי מוכתמת מוצגת באיור 1א, ב. כאן, סקירה מבנית של כליה עכבר שלם ומדמיין אזורים אנטומיים קריטיים כגון קליפת, לשד, ותלות ואגן הכליה הושגה.

פרוטוקול הצביעת המוצג הוא פשוט להחיל ומכיל רק שלושה צעדים. הריאגנטים הנדרש נגיש בקלות. זמן הצביעת הכולל של 24 שעות הוא מהיר לצביעת איברים שלמים, המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של דגימות ברקמה רכה (איור 1ג, איור 2ב' ואיור 4ב) בסביבת מעבדה ב ריבוי מאזניים עד לרמה התאית. יצוין כי הזמן הכולל מכתים ונפח של הפתרון הכתמים הדרוש עשוי לבקש כמה עיבודים בהתאם לאופי של המדגם. אף על פי כן, הפרוטוקול האאוזין מבוסס הצביעת מתאים לצביעת האיברים השלם, אשר לאחר מכן מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה microCT של איברים שלמים. הצטמקות חפצים בשל אתנול ממס, אשר שימש כדי לשמור על המדגם לחות במהלך מדידות microCT, לא נצפו. צעדי הכנה נוספים נדרשים עבור הדמיה nanoCT, אשר מאפשר את החקירה של חתיכות רקמות קטנות שאוחזרו מן המדגם המקורי. ביחס ליישומים histopathological עתידיים, סריקות סקירה לספק תובנות יקרות לאזורים אנטומיים שונה ומבנים, אשר מאפשרים את הקביעה של ROIs כפי שמתואר באיור 2א. אלה ניתן ללמוד 3D על ידי microCT (איור 1ג ' ו איור 2b) או nanoct (איור 4ב) ו העריך 2d עם היסטולוגיה (איור 3).

חוזק נוסף של הפרוטוקול הוא ראה את התאימות המלאה עם histopathology ביחס הליך כתמים H & E. היישום של הליך מאאוזין מבוסס כתמים לדגימות בצובר לא לעכב את החקירה היסטולוגית נוספת (איור 3), למרות הריכוז האאוזין שהוחלו הוא גבוה הרבה יותר לעומת הפתרון היסטולוגית כתמים. הפרוסה nanoct עם עובי וירטואלי של כ 400 ננומטר (איור 3a) משווה כבר היטב עם הסעיף היסטולוגית (איור 3ג), אשר נגזר מן המדגם המקביל רקמה רכה. בהתחשב בעובי המשוער של סעיף היסטולוגית עם 7-10 μm, הדור של מינימום פרוסות ההקרנה של הנתונים nanoct (איור 3b), אשר מתאים עובי וירטואלי של כ 7 μm, מאפשר ל השוואה טובה יותר עם הסעיף היסטולוגית (איור 3ג). כאן, גרעיני התא מתגלים בבירור כמו אזור לא החליש כמו אאוזין כתמים במיוחד חלבונים פפטידים בתא ציטופלסמה33.

היישום של כתמים נוספים מונה עם שיטות היסטולוגית סטנדרטי אפשרי, אף על פי סדר ההכתמים לעומת ההליך הסטנדרטי כתמים היסטלוגיים היה הפוך. החל ראשון עם הפיתוח המבוסס על אאוזין הפרוטוקול של CT, ואחריו כתמים מונה של אלה אאוזין מבוססי סעיפים היסטלוגיים עם המטאוקסילין, מאפשר תאימות מלאה ותוצאות באיכות גבוהה מכתים הצגת הטופס הצפוי המראה. כתמים של תא גרעין עם המטאוקסילין החמוץ של מאייר הוחל על הסעיף היסטלוגי המדגיש את גרעיני התא בסגול (איור 3ד). היישום של כתמי מונה היסטולוגית מוגבל כעת לכתם H. מונה היסטולוגית סטנדרטיים אחרים כגון חומצה תקופתית בסיס של שיף, Elastica ואן Gieson או הגומורי כסף יש להעריך כמו גם את התאימות עם טכניקות אימונוהיסטולוגיים צריך להיבדק.

הפרוטוקול אאוזין-מבוססי כתמים מאפשר (i) תא המיקוד הספציפי, (ii) הומוגנית והשלם כתמים, (iii) יישום קל, (iv) חדירה מהירה של הרקמה מבלי ליצור חפצים כגון טבעות דיפוזיה, (v) את הצביעת של דוגמאות גדולות וצפופות של רקמה רכה, ו (vi) התאמה מלאה עם histopathology לגבי הכתם H & E. דרישות אלה חשובות כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה רנטגן CT של רקמה רכה למטה לרמה התאית. בשילוב עם התקנים nanoct שפותחו לאחרונה12,36,37, דור גמישה של פרוסות היסטולוגית וירטואליות הדומות בניגוד וברזולוציה לנתונים היסטלוגיים קונבנציונליים ניתן לעיבוד. גישה זו משולבת תאפשר הקמת רנטגן CT ככלי רב ערך עבור הדמיה 3D של מבנים רקמות מיקרוסקופיים.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לד ר אנקן דאניל לדיונים היסטלוגיים ולצוות המועיל ביותר בחפירה בשבדיה, שבדיה. אנו מכירים בתמיכה כספית באמצעות מרכז מצוינות מינכן לפוטוניקס מתקדם (MAP) והתוכנית של גוטפריד וילהלם לייבניץ. יתר על כן, פרויקט מחקר זה קיבל מימון של האיחוד האירופי אופק 2020 תוכנית המחקר והחדשנות תחת מארי Skłodowska-קירי גרנט הסכם לא. H2020-מסקה-אם-2015-703745-קונסולט.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50-ml centrifuge tube by FalconVWR734-0453
Formaldehyde solution, 37%Carl RothCP10.2acid-free, stabilized with ~10% MeOH
Glacial acetic acidAlfa Aesar36289.AP
Eosin Y disodium saltSigma-AldrichE4382certified by Biological Stain Commission
Phosphate Buffered Saline (PBS)MerckL1825Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium
Sample Tubes by NalgeneCarl RothATK5.1
Rocking Shaker ST5CAT60281-0000
Cellulose tissue paperVWR115-0600
Forceps, by USBECK LaborgeräteVWR232-0096
Microcentrifuge tubes by EppendorfVWR211-2120safe-lock, 2.0 ml
Ethanol absolute by Baker AnalyzedVWR80252500
Disposable safety scalpel by AesculapVWR AESCBA210
Petri dish by SterilinVWR391-2019
Plastic pasteur pipetteCarl RothEA68.1graduated, 1 ml
Desiccator by DuranVWRSCOT247826954
Silicone grease by BayerSigma-Aldrich85404high-vacuum
Carbon dioxide cylinder with standpipeLinde370011310 kg, short
micro-porous treatment capsulePLANO GmbH4614pore size 78 µm (B)
Bal-Tec CPD 030Bal-Tec AGCO2 as drying agent
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCDZeissthis stereomicroscope has been updated(1)
Zeiss Xradia Versa 500Zeissthis microCT scanner has been updated(2)
Avizo Fire 8.1Thermo Fisher Scientific
PILATUS detector as part of the nanoCT scannerDectrissingle-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7)
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scannerExcillumhigh-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7)
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019).
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019).
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015).
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009).
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009).
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019).
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019).

References

  1. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , (2013).
  2. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
  3. McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
  4. Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
  5. Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
  6. Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  7. Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
  8. Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
  9. Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
  10. Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
  11. Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
  12. Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
  13. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
  14. Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
  15. Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
  17. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  18. Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
  19. Pauwels, E., Loo, D. v., Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
  20. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  21. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
  22. Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
  23. Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
  24. Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
  25. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
  26. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  27. Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
  28. . ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
  29. Nachtrab, F., et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation. 10 (11), 11009 (2015).
  30. Kraft, P., et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (3), 368-375 (2009).
  31. Kraft, P., et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science. 56 (3), 758-764 (2009).
  32. . ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
  33. Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), 130-134 (1951).
  34. Bray, D., Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. 13, 235-243 (2000).
  35. Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
  36. Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
  37. Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
  38. Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S., Mulisch, M., Welsch, U. . Mikroskopische Technik. , 193-194 (2015).
  39. Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
  40. Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
  41. . GE product information: Phoenix nanotom m Available from: https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf (2019)
  42. Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
  43. Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bio152X raymultiscale3Dmicrostructure

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved