ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

Abstract

עשרות שנים של מחקר אורגניזמים רבים במודל הובילו את המושג הנוכחי של הפלסטיות הסינפטית הבסיסית למידה והיווצרות זיכרון. שינויים המושרה למידה בשידורי סינפטית מופצים לעתים קרובות על פני הרבה נוירונים ורמות של עיבוד במוח. לכן, יש צורך להמחיש את הפלסטיות הסינפטית התלויות בלמידה ברחבי הנוירונים. זבוב הפירות מלאנוגסטר מייצג אורגניזם מודל נוח במיוחד לחקר המעגלים העצביים שבבסיס הלמידה. הפרוטוקול המוצג כאן מדגים דרך שבה התהליכים המשמשים את היווצרות זיכרונות הריח האסוציאטיבית, כלומר, פעילות סינפטית והשינויים שלהם, ניתן לפקח בvivo. באמצעות מגוון רחב של כלים גנטיים הזמינים ב Drosophila ילה, ניתן לבטא במפורש מחווני סידן מקודדים גנטית באוכלוסיות תאים ואפילו תאים בודדים. על ידי תיקון זבוב במקום, ופתיחת קפסולת הראש, ניתן להמחיש את דינמיקת הסידן בתאים אלה תוך מתן גירוי ריח. בנוסף, אנו מדגימים הערכה שבה הזבוב יכול להיות נתון, במקביל, לזעזועים חשמליים לגוף. זה מספק מערכת שבה זבובים יכולים לעבור מיזוג הריח הקלאסי-לפיו ריח נאיבי בעבר הוא למד להיות קשור לעונש הלם חשמלי-באותו זמן כמו ייצוג של ריח זה (וריחות לא מאומן אחרים) הוא שנצפתה במוח באמצעות שתי פוטון מיקרוסקופ. המעבדה שלנו דיווחה בעבר על הדור של חיישני סידן synaptically מקומי, אשר מאפשר לאחד להגביל את אותות הסידן פלורסנט לתאי טרום או פוסט סינפטית. מיקרוסקופ 2-פוטון מספק דרך. לפתור מבנים משובחים אנו מדגימה זאת על ידי התמקדות בנוירונים המשלבים מידע מהגוף הפטרייה, מרכז מסדר גבוה יותר של מוח החרק. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה לבחון את הקשרים סינפטית בין הנוירונים אשר הפעילות מאופנן כתוצאה של לימוד ריח.

Introduction

פענוח היכן וכיצד המידע נרכש במוח באמצעות למידה ומאוחסן לאחר מכן כזיכרון מהווה את אחת המשימות המאתגרים ביותר במדעי המוח¹. מחקרים נוירומדעיים הובילו למושג שינוי בשידור הסינפטית כמצע עצבי הנמצא ביסוד הלמידה והיווצרות הזיכרון^2,3. זה שיערו כי, במהלך הלמידה, קשרים סינפטית בין ההרכבים עצבי כי הם פעילים במהלך התפיסה של גירוי להיות שונה כך דפוס הפעילות המשולבת שלהם ניתן לאחזר במהלך הזיכרון להיזכר, ובכך להדריך פעולה התנהגותית עתידית⁴. אלה "התאים engram" ואת הסינפסות שלהם מופצים לעתים קרובות על פני אזורי המוח רמות של עיבוד, מה שמקשה על הקצאת שינויים נצפו בשידורי סינפטית ללמידה של משימה או גירוי. כדי להתאים ולהמחיש את השינויים הסינפטית האלה כי הם מקושרים למשימה למידה ספציפית אחד צריך מערכת המודל המתאים המאפשר בדיוק מגבילה את הסינפסות.

עבור מאמץ כזה, דרוזופילה מלאנוסטר מתאים במיוחד משום שהוא משלב פשטות מוחית יחסית, עושר התנהגותי ונגישות ניסויית. בין האורגניזמים המבוססים היטב, דרוסופילה ממוקם בין ה-נמטודות C. אלגיה ויונקים מבחינה גנטית כמו עכברים במונחים של מורכבות עצבית. מספר סטריוטיפית של נוירונים (~ 300) ורפרטואר התנהגותי מוגבל נצפה בג. יונקים, לעומת זאת, יש מיליוני נוירונים. ומורכבות התנהגותית אדירה המוח של זבוב הפירות הוא, עם שלה ~ 100,000, הנוירונים קטנים באופן משמעותי מהמוח של רוב בעלי החוליות, ורבים הנוירונים הם לזיהוי באופן אינדיבידואלי⁵. ובכל זאת, דרוזופילה מפגין ספקטרום רחב של התנהגויות מורכבות, כולל יכולת להציג למידה איתנה של ריח והיווצרות זיכרון, המתואר לראשונה לפני 40 שנים לפני⁶. במהלך הליך התניה קלאסי, קבוצות של זבובים חשופים לריח כגירוי ממוזג (CS⁺) בעוד הם מקבלים הלם חשמלי מעניש כמו גירוי ממוזג (ארה ב). הריח השני (CS^-) מוצג לאחר מכן ללא כל עונש. כך, בעלי החיים לומדים להימנע מהריח הקשור לעונש, שניתן לבחון במצב הבחירה הבא בין שתי הריחות, CS⁺ ו^-cs-. העבודה על ניתוח המצע העצבי שבבסיס התנהגות זו בדרוזופילה זיהתה את גופי הפטריות (MB) כאתר הראשי של "engram"^7,8,9,10 ולכן, המעגלים של אזור המוח הזה היה והוא הנושא של מחקר אינטנסיבי כדי לחשוף את ההיגיון שבו אנגרמה זיכרון נרכש ומאוחסן (שנבדקו לאחרונה בשנת^11,12).

The drosophila ילה MB מורכב ~ 2,000 נוירונים פנימיים (תאים קניון) לכל חצי הכדור, מאורגן התחזיות סיבי מקבילי¹³. Axons של הקרנת הריח הנוירונים מורחבים החזייה לרוחב לאורך ו calyces MB, אתר הקלט הדנדריטי הראשי של MB ולקבל קלט החוש מן האונות האנטנה. צרור האקטונים הארוכים והמקבילים של תאי קניון מהווים את מדווש ואת האונות. רוב התאים קניון bifurcate להרכיב אופקי β/β'-האונות על ידי הארכת עירבון אחד כלפי קו האמצע של המוח, ו-α האנכי/α'-האונות על ידי הארכת העירבון השני מקרין בכיוון הקדמי הקדמית. הקבוצה השנייה של תאים קניון צורות γ אופקי-האונות¹³ של המגה בייט שבו תהליך הלמידה והיווצרות הזיכרון לטווח הקצר הבאים יכול להיות מקומי¹⁰. האונות MB לקבל קלט כלי לימפה ולספק פלט efferent, שניהם מוגבלים בדרך כלל compartmental sub-אזורים נפרדים לאורך אקסונים תא קניון^14,15,16. בפרט, הקלט של הנוירונים במגה-בתים של כלי לימפה בנפח MB הוכחו לתווך ערך מבוסס, למשל, ענישה, חיזוק השפעות הריח למידה אסוציאטיבית^15,17. Stereotypic ובאופן אינדיבידואלי efferent MB פלט הנוירונים מתוך האונות בגוף פטריות לשלב מידע על פני מספר גדול של תאים קניון, יעד אזורי המוח מגוונות התנהגות דוב-מידע מספק מאוד או מאוד מספק¹⁵ . הארכיטקטורה העצבית הזאת הובילה. למושג של ארגון האנגרמה האסוציאטיבית ריחות מקודדים במדויק על ידי הרכבים המופעל בדלילות של תאים קניון. האירוע מגזר המקרה של אלה הרכבים תא הקניון ושחרורו של דופמין-עורר על ידי הענשת גירויים-העברת מודולים מתא קניון מראש לתוך הנוירונים הפלט מגה בייט כגון בעלי החיים לאחר מכן למנוע את הריח הזה מסוים^{10 ,12}. אנו משתמשים זו אנגרמה מוגדר למדי בדיוק מקומי כמו במקרה פרדיגמטי כדי להמחיש כיצד אלה תלויי למידה שינויים בפעילות סינפטית ניתן לקבוע ופיקוח.

הערך של דרוזוהילה כמערכת מודל מסתמך בחוזקה על ארגז הכלים הגנטי ללא תחרות המאפשר לאחד לבטא טרנסגנים לזיהוי, ניטור ושליטה על נוירונים בודדים בתוך מעגלים מורכבים¹⁸. הופעתו של טכניקות לניטור הפעילות העצבית-כגון הדמיה סידן, דנו כאן-הרשו לקביעת דפוסי הפעילות העצבית בתגובה לגירוי מסוים. על-ידי שילוב ביטוי מGal4 ספציפי של מחווני סידן מקודדים גנטית (סמארה) עם גירוי ריח, אפשר לדמיין את הדינמיקה המועוררה של הסידן של נוירונים בריבית¹⁹. בפרוטוקול זה מראים כי על ידי צימוד טכניקה זו עם פרדיגמה מיזוג קלאסית, ניתן לבחון את תגובות הריח הזה בהקשר של למידה. פלסטיות המושרה למידה ניתן לגזור עוד באמצעות הסמזה כי הם לא רק מקומי לעצב מסוים אחד, אלא גם לתאי משנה ספציפיים של תא העצב. Pech ואח '²⁰ הקים מבחר כלים המאפשרים בדיוק את זה. על-ידי התמקדות GCaMP3²¹ אל מקדם או פוסטסינפסה באמצעות הצמדה בעלי החוליות Synaptophysin או dהומר, בהתאמה²⁰-האפנון הדיפרנציאלי של אתרים אלה ניתן להבחין. לוקליזציה זו מהווה, בהקשר זה, יתרון על רוב הגנוטים היא כי הם במצב אוביקווילי לאורך הציטוסול-למשל, GCaMP²², GCaMP3²¹, או GCaMP6²³ -כי זה אומר הארעיות טרום ופוסט סינפטית יכול להיות נבדל מזרם הסידן המשולב הכולל המתרחש כתוצאה של הפעלת תא העצב. הדבר יכול לספק רמזים לגבי המיקום והסוגים של הפלסטיות המתרחשים כתוצאה או הגורם ללמידה וליצירת זיכרון. כדוגמה, הפרוטוקול המסופק כאן מציג את הערך של כלי זה בפענוח האפנון של הנוירונים פלט MB במהלך הלמידה אסוציאטיבית הריח על ידי מיקוד הביטוי של חיישן הסידן רק postסינפסה. על-ידי ניטור, בתוך לטוס בודד, מעורר ריח פעילות לפני ואחרי המיזוג ריח השוואה ישירה ניתן להסיק בין תגובת ריח נאיבי ותגובת ריח למדה. בעוד קבוע באותו חדר הדמיה, זבובים חשופים מבחר של ריחות. לאחר מכן, הם מקבלים פרוטוקול התניה אסוציאטיבית, שבו אחת מריחות אלה מזווג עם הלם חשמלי (להיות CS⁺) ועוד ריח מוצג ללא חיזוק (להיות cs^-). לבסוף, הזבובים נחשפים שוב לריחות כמו בשלב הראשון. השתמשו בסידן מיקרוסקופית. שתי פוטון

Protocol

1. זבובי פירות טרנסגניים, דרוזופילה מלאנוסטר

1. צלב נקבה בתולה וזבובים גברים (הרים 25 ° צ' ב 60% לחות יחסית על מחזור 12 h אור/כהה) נשיאת Gal4 ובונה UAS הרצוי²⁵, בהתאמה, כדי לייצר זבובים שבו נוירונים ספציפיים הריבית לבטא מקודד גנטית סידן אינדיקטור.
2. גיל הצאצא הנשי של הצלב הנ ל עד שהם בטווח של 3-6 ימים פוסט eclosion. מעדיפים זבובים לנשים בגלל גודלם הגדול במקצת.

2. הכנת זבוב הפרי להדמיית סידן vivo

1. בחר זבוב נקבה אחת והורדם על הקרח במשך לא יותר מ 5 דקות.
2. באמצעות מלקחיים עדינים, מניחים את הזבוב בתא ההדמיה (הפגינו באיור 1ג). הקפידו לשמור על החזה והרגליים במגע עם חוטי החשמל בתחתית החדר ושהראש מניח. תקן את מיקום הזבוב באמצעות נייר דבק ברור.
   הערה: פרוטוקול זה מחייב חדר בנוי בהתאמה אישית, שבו הזבובים קבועים, כאשר כמוסת הראש נגישים לפתיחה, והזבובים יכולים לקבל שני משבי ריח לאנטנה ולזעזועים חשמליים לבית החזה ולרגליים (איור 1).
3. באמצעות להב אזמל כירורגי קבוע ידית האזמל (ראה טבלת חומרים), לחתוך חלון בקלטת סביב הראש של הזבוב, עוזב את האנטנה מכוסה ורק את החלק הקדמי ביותר של בית החזה נחשף.
4. הקף את הצדדים ואת החלק האחורי של הראש עם דבק באור כחול בהיר, מניפולציות בקפידה באמצעות סיכת חרק שנערך על ידי מלתעות קמור. הגדר את הדבק באמצעות מנורת LED כחולה מפליטת אור.
5. בדוק כי הדבק מוגדר לחלוטין וברור כל דבק שיורית לא מוקשח מהמשטח של הראש לעוף.
6. החל טיפה של הפתרון של הצלצול²⁴ (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הקוטיקולה החשופה של הראש.
7. , בעזרת סכין דקירה מאוד יפה. לחתוך דרך הקוטיקולה להסרה היעילה ביותר של הקוטיקולה, לחתוך הראשון על פני האחורי של הראש באמצעות ocelli כנקודת התחלה. ואז, לחתוך כל צד, המדיאלי לעיניים, כדי ליצור כנף של הקוטיקולה שניתן לקרוע בקלות באמצעות מלקחיים.
8. להסיר את הקוטיקולה העודפת שעלולה לחסום את המוח באזור העניין.
9. נקה בזהירות את פני השטח של כל קנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים, הימנעות שיבוש רקמת המוח עצמו. להסיר ולרענן את הפתרון של הצלצול²⁴ (ראה טבלת חומרים) כנדרש כדי לנקות את האזור של פסולת רקמות.
10. מניחים את המחט משלוח תת-עורית בעמדה, כ 1 ס מ מראש הזבוב. ודא שאין דבר שיכול לשבש את מסירת הריח לאנטנות.
11. במיקרוסקופ, לחבר את חדר ההדמיה למערכת ריח-משלוח דרך המחט מסירה תת-עורית.
12. כדי לאפשר לזבוב להתאושש באופן מלא מהרדמה וניתוח, ולהסתגל לזרימת האוויר, מיישמים תקופת מנוחה של 10 דקות בשלב זה.

3. בvivo סידן הדמיה

1. השתמש במיקרוסקופ מרובה פוטון המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים (ראה טבלת חומרים), המותקנת על שולחן מבודד רטט. עבור ויזואליזציה של מחווני סידן מבוססי GFP, לכוונן את הלייזר כדי אורך הגל של 920 ננומטר ולהתקין GFP הלהקה לעבור מסנן.
2. באמצעות כפתור הכוונון של Z גס, לסרוק דרך ציר Z של המוח ולאתר את אזור המוח של עניין. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה רק באזור זה כדי למזער את זמן הסריקה, וכיצד לסובב את תצוגת הסריקה כך שהראש הקדמי של הראש פונה כלפי מטה.
3. התאם את גודל המסגרת ל-512 x 512 px, מהירות הסריקה ל> 4 הרץ ולאזור הסריקה (בממד Y) כך שנוירונים מעניינים מכוסים.

4. ויזואליזציה של מעבר סידן מעורר ריח באמצעות מיזוג ריח

1. השתמש במערכת שילוח ריחות^19,26 שיכול לספק מספר גירויים ריח באופן זמני מדויק.
   1. השתמש במחשב נוסף כדי לשלוט בהתקן, וכדי לתקשר עם תוכנת מיקרוסקופ ההדמיה כדי לתאם את הגירוי בתמונה במהלך הניסויים.
   2. ליזום חבילת מאקרו מתוכנתים מראש מסוגל לקשר את תוכנת רכישת התמונה ותוכנית מסירת ריח (g., חבילת מאקרו של VBA המותקנת בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, ראה טבלת חומרים) כי הוא מגיב לקלט חיצוני הדק המסופק על-ידי החניכה של פרוטוקול מסירת ריח בתוכנית נפרדת).
2. הפעל את המדידה על ידי ניטור "pre-הדרכה"/ריח נאיבי של סידן ארעיות ברזולוציה של 512 x 512 px וקצב מסגרת של 4 Hz. לספק הגירוי ריח של 2.5 מוקף על ידי רכישת תמונה נוספת עבור התפרצות ריח לפני 6.25 (כדי להקים F ₀ ערך בסיסי) ו-12.5 s לאחר היסט ריח. , חזור על זה עם הדואואנט השני. ואחר כך עם אודואנט שלישי
3. המשך 3 דקות לאחר מדידה זו עם מיזוג קלאסי ("אימון") זבוב.
   1. בחר את אחת הריחות המוצגים בשלב "טרום אימון" כדי להפוך את ה-CS⁺ ריח והשני כדי להפוך את הcs^- ריח. הציגו את CS⁺ ריח באמצעות המחשב מבוקר ריח-מערכת הספק עבור 60 s לצד 12 90 V זעזועים חשמלי.
   2. לאחר הפסקה של 60 s, להציג את הריח CS לבד עבור 60 s. השימוש כאודונמלים 4-methylcyclohexanol^ו-3 -octanol. אין להציג את האודואנט השלישי (למשל, 1-octen-3-ol) במהלך אימון זה כפי שהוא משמש כשליטה רק לפני (שלב 4.2.) ואחרי (שלב 4.4) שלב האימון.
4. למדוד את "לאחר האימון" מחזורי הסידן מעורר הריח שוב על ידי חזרה על "טרום הכשרה" פרוטוקול גירוי הריח (שלב 4.2.) 3 דקות לאחר סיום שלב ההכשרה (שלב 4.3).
   הערה: העיתוי של שלב זה אמור לשקף את זמן ההתעניינות לאחר היווצרות הזיכרון (למשל, לבצע שלב זה 3-4 דקות לאחר שלב המיזוג כדי לחקור זיכרון לטווח קצר). בדרך כלל, זבובים יכולים לשרוד כמה שעות בהכנה זו.
5. שמור קבצי הדמיה בתבנית מתאימה (לדוגמה, Tiff) לניתוח תמונה מאוחר יותר.

5. ניתוח תמונה

1. כדי לנתח תמונות, פתח קבצים מסוג Tiff (או דומה) בתוכנת ניתוח התמונה כגון פיג'י²⁷.
2. יישר את המחסניות באמצעות אלגוריתם תיקון תנועה כדי להבטיח תנועה מינימלית בכיוונים X ו-Y. התעלם מהקלטות שיראו תנועה חזקה בציר Z.
3. בחר את הכלי של התוכנה המשמשת לסימון אזור מעניין (ROI) סביב האזור שיש לבחון. זה צריך להיות מדויק ככל האפשר כדי להגביל את ההשפעה של זריחה ברקע.
4. השתמש בכלי המתאים של התוכנה כדי לחלץ נתונים בעוצמה הזמני של הקרינה כקבצי נתונים מתוך ההחזר הנבחר, כך ערך נוצר עבור כל מסגרת של ההקלטה.
5. פתח את הנתונים באמצעות תוכנית לניתוח נתונים כדי לחשב את ערכי ΔF/F₀ עבור כל מעקב אחר ריחות. F₀ = זריחה ממוצעת של 2 לפני התפרצות הריח. ΔF = ההפרש בין הזריחה הגולמית במסגרת נתונה ו-F₀. מערכים אלה, חשב ערך ΔF/F₀ עבור כל מסגרת שניתן להתוות נגד הזמן כדי לשקף את הזריחה היחסית במשך תקופת גירוי הריח.

תוצאות

באיור 2ניתן לראות דוגמה לתמונות שנרכשו באמצעות הפרוטוקול הנ ל. ד הומר-GCaMP3 מתבטא בעצב הפלט במגה בייט, אשר הדנדטים innervate תא 1 של האונה הγ-mb (תא העצב הוא כינה MVP2^28,29) והוא ממוקד גנטית באמצעות קו מפוצל-Gal4 MB112C¹⁶. כמו ?...

Discussion

הניתוח של המעגלים העצביים שבבסיס הלמידה והזיכרון הוא מטרה בולטת בתחום מדעי המוח. הנגישות הגנטית של דרוזופילה והרוחב והקלות של בדיקות ההתנהגות הופכת את זה לכלי אידיאלי לחקור תופעות כאלה. כאן מוצגת שיטה שבה ניתן לדמיין, בתוך זבובים בודדים, האפנון המתרחשת ברמה תת-תאית כתוצאה ממיזוג הרי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.