Method Article
כאן אנו מציגים בדיקת הכלאה במקום של הדור הבא לזיהוי רצפי RNA או DNA נגיפיים ספציפיים ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). גישה זו מאפשרת הדמיה של עותקים נמוכים של RNA ו-DNA בפחות מ-24 שעות עם רגישות וסגוליות גבוהות מאוד.
הכלאה באתרה היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי רצפי RNA או DNA ספציפיים בתוך תאים בודדים בקטעי רקמה, ומספקת תובנות חשובות לגבי תהליכים פיזיולוגיים ופתוגנזה של מחלות. הכלאה באתרה (ISH) משמשת במשך שנים רבות להערכת מיקומם של תאים נגועים בנגיפים, אך לאחרונה פותחה גישת ISH מהדור הבא עם אסטרטגיית תכנון בדיקה ייחודית המאפשרת הגברת אותות ודיכוי רקע בו זמנית כדי להשיג הדמיה של מולקולה בודדת תוך שמירה על מורפולוגיה של רקמות. הדור הבא של ISH מבוסס על גישה כמו PCR מסועף, אך מבוצע באתרו והוא קל, רגיש וניתן לשחזור יותר משיטות ISH קלאסיות או גישות PCR באתרן בזיהוי שגרתי של RNA או DNA ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין (FFPE). בשנים האחרונות המעבדה שלנו מיישמת פלטפורמת ISH זו לאיתור תאים חיוביים של כשל חיסוני אנושי (HIV) וכשל חיסוני סימיאני (SIV), RNA נגיפי (vRNA) ו/או DNA נגיפי (vDNA) בתוך מספר רב של רקמות FFPE. עם כתב היד הטכני המפורט הזה, ברצוננו לחלוק את הידע והעצות שלנו עם כל האנשים המעוניינים להשתמש בדור הבא של ISH במחקר שלהם.
ISH היא הגישה הניסיונית המשמשת למיקוד והדמיה של DNA, RNA או גדילי חומצות גרעין משלימים (כלומר, בדיקות) לרצפי DNA או RNA ספציפיים בתוך תא או קטע של רקמה. ISH מאפשר לוקליזציה והדמיה ספציפית של רצפי גרעין ספציפיים ברקמות, חשוב להבנת רמת הביטוי, הארגון, ההפצה והאינטראקציות בין המטרה לסביבה התאית שלה, שהיא מידע רב ערך שלא ניתן להשיג באמצעות טכניקות פופולריות אחרות, כגון qPCR. עד לאחרונה, ISH בוצע בדרך כלל עם DNA משלים מסומן או RNA משלים (ריבופרוב). בדיקות אלה היו מצומדות ישירות עם בסיסים מסומנים ברדיו, פלואורסצנט או אנטיגן (למשל, 35S, FITC ו-digoxigenin) ולאחר מכן אותרו וכימתו ברקמה באמצעות אוטורדיוגרפיה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או גישות זיהוי אימונוהיסטוכימיה, בהתאמה. בעוד שטכנולוגיות אלה באתרן ממשיכות להיות גישות בעלות ערך, יש מקום רב לשיפור כדי לפתח גישות פחות עתירות עבודה, פשוטות יותר, מהירות יותר, רגישות וספציפיות.
גישת ISH מסחרית חלופית מהדור הבא (למשל, בדיקת RNAscope), שתוארה לראשונה ב-2012, לזיהוי RNA שליח מארח (mRNA) מבוססת על PCR מסועף. זיהוי ה-mRNA מבוצע בתאי FFPE וברקמות, עם רגישות המתקרבת להדמיה של מולקולת RNA בודדת בתאים בודדים1. הספציפיות של גישה זו מושגת בתנאי הייחודי ששני בדיקות מטרה כפולות Z נקשרות ברציפות לרצפי ה-RNA (או ה-DNA) המשלימים שלהן בהתאמה עבור מגבר אות לקשור1 ברצף. זה מאפשר התחלה של מפל הגברת אותות באמצעות שלבי הכלאה עוקבים הדומים ל-DNA מסועף (bDNA)1,2. בנוסף, גישה זו מהירה וקלה להפליא, עם תוצאות המתקבלות תוך יום אחד בלבד (<8 שעות), יתרון משמעותי בהשוואה לעד 4 שבועות בטכניקות חלופיות, כולל Radio-ISH 1,2. הדור הבא של ISH פתח נקודות מבט והזדמנויות חדשות לחקר HIV/SIV. המכשולים העיקריים לריפוי HIV הם מאגרי התאים והרקמות הנוצרים בשלבים המוקדמים של המחלה 3,4. המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לזהות, למקם ובסופו של דבר להבין את תאי הרקמה העיקריים הפועלים כמאגר ויראלי ומתמידים בתוך מארח נגוע. זה בתורו יעזור בפיתוח אסטרטגיות ריפוי יעילות נגד HIV.
בכתב יד זה, אנו מסבירים בפירוט את פרוטוקול ה-RNA/DNA multiplex ISH הדופלקס שלנו מהדור הבא (למשל, RNAscope/DNAscope) ומסבירים כיצד שינינו את פרוטוקול ה-RNA ISH הקיים כדי לייעל את ה-ISH של הדור הבא לדגימות ולמטרות הספציפיות שלנו. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה, לוקליזציה וכימות של RNA נגיפי HIV/SIV ו-DNA ויראלי בתוך מקטעי רקמה של 5 מיקרומטר. הדמיה סימולטנית של vRNA ו-vDNA מתבצעת על ידי שילוב של שתי ערכות בדיקה מותאמות אישית: חוש אחד, המכוון לגדיל המקודד vDNA (C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense בדיקה [416141-C1]), ואנטי-חוש אחד, המכוון לתעתיקי vRNA (בדיקה C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense [416131-C2]) המכסה אזורים שונים בגנום הנגיפי (טבלה 1), תוך שימוש בשני ערוצי הדמיה שונים, C1 ו-C2. בפרוטוקול זה, ערוצים C1 ו-C2 מאפשרים לנו לדמיין אותות בצבעים שונים (כלומר, AP באדום ו-HRP בחום) ולזהות את הבדיקות בגישות שונות. למעט עיבוד וחיתוך קיבוע הרקמות, בדיקה זו אורכת יומיים. מוצג כאן פרוטוקול ההכלאה הדופלקס vRNA ו-vDNA באתרו שניתן לבצע על כדורי תאים או קטעי רקמה.
1. הכנת חתכים ושקופיות
2. הכנת תנור
3. אחזור אפיטופים המושרה על ידי חום
4. טיפול מקדים בפרוטאז
5. הכלאת בדיקה והגברת אותות
הערה: כדי למנוע אידוי, ודא שהמגש מבוקר הלחות אטום כהלכה כדי שהרקמות לא יתייבשו במהלך שלבי הדגירה. החזירו את תא הלחות לתנור במהלך שלב הכביסה כדי להבטיח שהוא יישאר בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
6. זיהוי אות יעד של ערוץ 1 (C1)
הערה: זה מבוצע באמצעות פוספטאז אלקליין אדום וכרומוגן אדום מהיר Amplification 6 מערכות זיהוי 2-plex (ראה טבלת חומרים) המכילות תוויות פוספטאז אלקליין, וזיהוי כרומוגני. הוא משתמש באדום מהיר כמצע ליצירת אות אדום.
7. זיהוי אותות יעד של ערוץ 2 (C2)
הערה: פעולה זו מתבצעת באמצעות ערכות כרומוג'ן Brown HRP ו-DAB הזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים). ההגברה 10 מזיהוי 2-plex מכילה תוויות פרוקסידאז חזרת, וזיהוי כרומוגני מתבצע באמצעות DAB ליצירת אות חום.
8. מכתים והרכבה
9. פרוטוקול ניתוח תמונה כמותי ל-RNAscope באמצעות CellProfiler5
בכתב יד קודם 2,6,7,8,9,10,11, דיווחנו כי ניתן לשלב את פלטפורמות ה-ISH של הדור הבא המזהות vRNA או vDNA, באמצעות בדיקות חישה (vDNA) המכוונות לחלק ה-5' gag-pol של הגנום SIV/HIV ובדיקות אנטי-סנס (vRNA) המכוונות לגנים במחצית ה-3' של הגנום (vif, vpx, vpr, tat, env ו-nef) כמו גם אלמנט ה-TAR בגנום 5' (טבלה 1). גישה זו מבדילה בין תאים פעילים מבחינה שעתוק (vRNA+, vDNA+) לבין תאים נגועים לא פעילים מבחינה שעתוק (כביכול סמויים) או תאים המכילים פרו-וירוסים לא כשירים מבחינה שעתוק (vRNA-, vDNA+) באותו קטע רקמה2 (איור 1).
איור 1: זיהוי RNA ויראלי ו-vDNA באותו קטע רקמה. שילוב של בדיקת היברידיזציה של RNA (אדום) והכלאת DNA (חום) בבלוטת לימפה RM נגועה ב-SIV באופן חריף, המדגים את היכולת לזהות vRNA ו-vDNA באותו קטע רקמה ומספק גישה רבת עוצמה לזיהוי תאי vDNA+ vRNA שקטים מבחינה שעתוק באתרם. נתון זה שונה מ-Deleage C. et al.2. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
ערכות בדיקה של Plex RNA/DNAscope יחיד | |||
שם | קטלוג ACD # | מספר ZZ | תיאור |
SIVmac239 (אנטי-סנס) | 312811 | 83 | מיקוד בדיקה אנטי-חושי בתוך 1251-9420bp של D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env ו-nef) |
SIVmac239 (חוש) | 314071 | 83 | בדיקת חישה המכוונת לגדיל הפוך בתוך 1251-9420bp של D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env ו-nef) |
V-HIV1-Clade A (אנטי-סנס) | 416101 | 80 | בדיקה אנטי-חושית מכוונת בתוך 879-7629bp של קונצנזוס HIV-1 Clade A (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ו-nef) |
V-HIV1-Clade A (סנס) | 426341 | 80 | בדיקה חושית המכוונת לגדיל הפוך בתוך 879-7629bp של HIV-1 Clade A קונצנזוס (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ו-nef) |
V-HIV1-Clade B (אנטי-סנס) | 416111 | 78 | בדיקה אנטי-חושית מכוונת בתוך 854-8291bp של AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ו-nef) |
V-HIV1-Clade B (סנס) | 425531 | 78 | בדיקה חושית המכוונת לגדיל הפוך בתוך 854-8291bp של AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ו-nef) |
V-HIV1-Clade D (אנטי-סנס) | 416121 | 76 | בדיקה אנטי-חושית מכוונת בתוך 894-7697bp של קונצנזוס HIV-1 Clade D (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef) |
V-HIV1-Clade D (סנס) | 426351 | 76 | בדיקה חושית המכוונת לגדיל הפוך בתוך 894-7697bp של קונצנזוס HIV-1 Clade D (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef) |
ערכות בדיקה של Multi-Plex RNA/DNAscope | |||
שם | קטלוג ACD # | מספר ZZ | תיאור |
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1 | ברקוד 416141-C1 | 40 | בדיקת חישה המכוונת לגדיל הפוך בתוך 1251-4093bp של D01065.1 (gag ו-pol) |
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (אנטי-סנס) | ברקוד 416131-ג2 | 47 | מיקוד בדיקה אנטי-חושי בתוך 5381-10257bp של D01065.1 (vif, vpx, vpr, tat, env, nef ואלמנט TAR) |
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1 | ברקוד 444051-ג1 | 40 | בדיקה חושית המכוונת לגדיל הפוך בתוך 854-3940bp של AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag ו-pol) |
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (אנטי-סנס) | ברקוד 444061-ג2 | 40 | בדיקה אנטי-חושית מכוונת בתוך 5042-9673bp של AF324493.2,, HIV-1 Clade B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef ואלמנט TAR) |
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1 | ברקוד 444021-ג1 | 48 | בדיקת חישה המכוונת לגדיל הפוך בתוך 888-5032bp של רצף קונצנזוס HIV-1 Clade C (gag ו-pol) |
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (אנטי-סנס) | ברקוד 444041-ג2 | 49 | בדיקה אנטי-חושית מכוונת בתוך 5078-9698bp של רצף קונצנזוס HIV-1 Clade C (vif, vpr, tat, env, nef ואלמנט TAR) |
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1 | ברקוד 444011-ג1 | 55 | בדיקה חושית המכוונת לגדיל הפוך בתוך 890-4812bp של AF259954.1, HIV-1 Clade AE (gag ו-pol) |
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (אנטי-סנס) | ברקוד 444031-ג2 | 57 | בדיקה אנטי-חושית מכוונת בתוך 5052-9694bp של AF259954.1, HIV-1 Clade AE (vif, vpr, tat, env, nef ואלמנט TAR) |
טבלה 1: רשימת בדיקות להתמקדות ב-vRNA ו-vDNA של HIV-1 ו-SIV.
הכלאה באתרה היא בדיקה קפדנית הדורשת קפדנות וידע בסיסי בכימיה של חומצות גרעין, ביולוגיה של התא והיסטולוגיה כדי להיות מסוגל להתאים כל שלב קריטי למיקום מטרה בסביבה שמורה היטב. בדיון זה ברצוננו להדגיש את השלבים הקריטיים שבהם פתרון בעיות הוא חיוני להשגת תוצאות מדויקות וניתנות לפרשנות.
הקיבוע והעיבוד של הרקמות הם קריטיים ויש לטפל בהם מראש כדי לוודא שהבדיקה יכולה להניב את התוצאות הטובות ביותר. קיבוע PFA ניטרלי (4% מוכן טרי) הוא אופטימלי לבדיקת הדופלקס. עם זאת, ניתן לבצע את הבדיקה גם על רקמות קפואות (OCT) עם תנאי הקיבוע המתאימים לאחר ההקפאה.
טיפול מקדים בקטעי הרקמה הוא שלב מכריע. ישנם שני שלבי טיפול מקדים בבדיקה זו: הראשון הוא אחזור אפיטופ המושרה על ידי חום (HIER). שלב זה חשוב להיפוך קישורי גשר מתילן ושיקום מבני חלבון, הדרוש ברקמות קבועות. היעילות של טיפול זה תלויה בזמן, בטמפרטורה, בסוג מאגר האחזור וב-pH. הטיפול המקדים השני הוא אחזור אפיטופ המושרה על ידי פרוטאז (PIER). שלב זה מבקע פפטידים, חושף את האנטיגן או הנוקלאוטידים, ומשתמש באנזימים כולל פרוטאינאז K, טריפסין ופפסין. זהו צעד רגיש ביותר שעלול לפגוע הן במורפולוגיה של הרקמות והן ביעד העניין. ריכוז האנזים, כמו גם זמן וטמפרטורת הדגירה הם קריטיים בתהליך זה. עיכול יתר מוביל לתיחום גרעינים לקוי ולקושי בשלבי כמות. זה קריטי למצוא איזון בין גישה אופטימלית למטרת ה-RNA/DNA לבין תנאי טיפול מקדימים שאינם פוגעים ברקמה או ביעד המבוקש. לכל סוג רקמה יש רמת רגישות שונה לכל אחד מהטיפולים המקדימים הללו ויש לבדוק אמפירית כל פרמטר (ריכוז אנזים, זמן, טמפרטורה).
המחמירה של מאגר הכביסה מבוססת על שלושה פרמטרים עיקריים: טמפרטורה, ריכוז מלחים וחומר ניקוי וזמן. מאגר הכביסה הוא מאגר נתרן ציטראט מלוח (SSC), וריכוז המלח בתוך המאגר שולט בחומרה במהלך שלבי הכביסה. בפרוטוקול שלהם, ACD ממליץ להשתמש במאגר הכביסה בריכוז סופי של 0.1x SSC, 0.03% ליתיום דודציל סולפט. תוך כדי עבודה על אופטימיזציה של DNAscope ומולטיפלקס, קבענו ששימוש במאגר הכביסה בריכוז סופי של 0.05x SSC נתן לנו תוצאות טובות יותר להמחשת אות ה-DNA ועזר במידה ניכרת להפחית הכלאה לא ספציפית מחוץ למטרה הנובעת מהדגירה הלילית של בדיקת החישה.
יש לחשוב על הבחירה בגישת הזיהוי, כרוגן (אדום או חום) לעומת פלואורסצנטי על סמך סוג הרקמה והמטרה לפני תחילת הבדיקה. הגישה הכרומוגנית האדומה תיתן ניגודיות נחמדה, מכיוון שאדום אינו נמצא באופן טבעי ברקמות. כרומוג'ן חום ייתן תוצאות דומות לכרומוגן אדום. עם זאת, חשוב לזכור שלחלק מתוצרי פירוק הדם הקיימים ברקמה יש צבע דומה, ויהיה קשה להפריד דיו קעקוע מהאות החום בזמן הכימות. גישת זיהוי פלואורסצנטי תאפשר הבחנה ברורה בין סמנים תאיים שונים והריבוב יציע בדיקה מושלמת לפנוטיפ של התאים המכילים vRNA ו/או vDNA.
יש צורך בבקרות מרובות כדי להבטיח את הספציפיות של הבדיקות ואת איכות הבדיקה. כל בדיקה חדשה שתוכננה חייבת להיבדק על רקמות בקרה או כדורי תאים חיוביים ושליליים ידועים. לעתים קרובות אנו מייצרים פלסמידים המכילים את הרצף הממוקד שלנו ומבצעים טרנספקציה לקווי תאים כדי ליצור בקרות חיוביות. לכל ריצה אנו מוסיפים רקמה שלילית ידועה (HIV או SIV שלילית), בקרה ללא בדיקה המכילה רק את מדלל הבדיקה, ובקרה מטופלת RNase כדי להבטיח את האיכות והספציפיות של הבדיקה.
הכימות הוא שלב חשוב ביותר ויש לבצע אותו באמצעות הכלים והאלגוריתם המתאימים המבוססים על השאלה שנשאלה. בכתב יד זה הצגנו תוכנה לניתוח תמונות (למשל, Cellprofiler), שבחרנו לאחר הערכה של מספר אפשרויות. הערכנו שתוכנה זו היא התוכנה הטובה ביותר לצרכים שלנו, אך ישנן תוכנות רבות לניתוח תמונות שניתן להשתמש בהן.
למחברים אין מה לחשוף.
פרויקט זה מומן במלואו במימון פדרלי מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה מס. HHSN261200800001E ועל ידי המרכז הלאומי לחקר פרימטים של אורגון P51OD011092 מענק NIH (JDE). התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, ואזכור של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים אינו מרמז על תמיכה של ממשלת ארה"ב. הדופלקס פותח בעזרת Advanced Cell Diagnostics.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ACD HybEZII Hybridization system (110V) with ACD EZ-Batch Slides system | ACD | 321710 | Hybridization oven |
CAT Hematoxylin | Biocare medical | CATHE-GAL | colorstain |
Clear-Mount | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 17985-15 | mounting reagent for red chromogen |
Immpact DAB Peroxidase Kit | Vector | SK-4105 | Used to reveal HRP - DAB (Brown) to replace the DAB coming in the ACD kit |
lithium carbonate | Fisher chemical | L119-500 | bluing solution |
paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15714-S | for tissue fixation (4%) |
PBS | life technology | 14190-136 | |
Permount Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | SP15-100 | mounting regaent for brown chromogen |
Prolong Gold | ThermoFisher Scientific | P36930 | mounting regaent for fluorescence |
ribonucleases A | ThermoFisher Scientific | 12091039 | for RNAse treatment in DNAscope protocol |
ribonucleases T1 | Roche | R1003 | for RNAse treatment in DNAscope protocol |
RNAscope 2.5, 2-plex detection reagent | ACD | 322430 | Brown and red kit chromogen detection |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD | 322000 | retrieval buffer |
SuperFrost Plus Glass Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-17 | |
TBS | BOSTON BIOPRODUCTS | BM-301-4L | for washes |
TSA Plus Fluorescence palette kit (Cy3, Cy5, TMR, Fluorescein) | Perkin elmer | NEL760001KT | HRP Fluorescence detection |
Tween 20 | SIGMA | P1379-1L | for washes |
XYLENE 20LT | ThermoFisher Scientific | AC422680200 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved