JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

Abstract

נמו היא חלבון פיגומים אשר ממלא תפקיד חיוני במסלול NF-κB על ידי הרכבת IKK-מתחם עם IKKα ו IKKβ. עם ההפעלה, מתחם IKK זרחתים מולקולות IκB המובילות הטרנסלוקציה הגרעינית NF-κB והפעלה של גנים היעד. עיכוב של האינטראקציה של נמו/IKK היא פרדיגמה טיפולית אטרקטיבי עבור אפנון של פעילות מסלול NF-κB, מה שהופך את נמו יעד מעכבי עיצוב וגילוי. כדי להקל על תהליך של גילוי ואופטימיזציה של מעכבי נמו, אנו מהונדסים בניין משופר של התחום איגוד IKK של נמו אשר יאפשר קביעת מבנה של החלבון בצורה של apo ובעוד כרוך מעכבי מולקולרית משקל קטן. כאן, אנו מציגים את האסטרטגיה המשמשת לעיצוב, ביטוי ואפיון מבניים של התחום המחייב של ה-IKK של נמו. החלבון מתבטא ב -E. coli תאים, מסיסות תחת תנאים denaturing רפתקאות ומטוהרים דרך שלושה שלבים כרומטוגרפי. אנו דנים בפרוטוקולים להשגת קריסטלים לקביעת מבנה ולתיאור אסטרטגיות לרכישת נתונים וניתוח. הפרוטוקולים ימצאו ישימות רחבה לקביעת מבנה של מתחמי מעכבי של נמו ומולקולה קטנה.

Introduction

מסלול NF-κB מופעל בתגובה מגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מוצרים מיקרוביאלית ומתח, כדי לווסת את הביטוי של גנים היעד האחראי תגובה דלקתית וחיסונית, מוות תאים או הישרדות והתפשטות1. פתווגיות כולל מחלות דלקתיות ואוטואימוניות סרטן2,3,4,5 היו מתואמים היפרהפעלה של השביל, אשר עשה אפנון של הפעילות NF-κB היעד העיקרי לפיתוח טיפולים חדשים6,7.

הנתיב הקנוני-κB בפרט הוא נבדל מהשביל הלא קאנוני, האחראי על הפעלת lymphorganogenesis ו-cell, על ידי התלות של לשעבר על הפיגומים החלבון נמו (NF-κB essential מודולים8) עבור ההרכבה של הקומפלקס ikk עם IKKα ו IKKβ. מתחם ikk אחראי על זרחון של IκBα (מעכב של κB) כי מטרות זה עבור השפלה, שחרור NF-κB דימרים כדי לאתר את הגרעין עבור שעתוק גנים1 ולכן הוא יעד אטרקטיבי לפיתוח מעכבי לווסת את NF-κB פעילות.

המחקר שלנו מתמקד באפיון של האינטראקציה חלבון-חלבון בין נמו ו IKKβ, מיקוד נמו לפיתוח מעכבי מולקולות קטנות של היווצרות מורכבות IKK. תחום מחייב מינימלי של נמו, נדרש לאגד IKKβ, כולל שאריות 44-111, והמבנה שלו נקבע מורכב עם פפטיד המתאים IKKβ רצף 701-7459. נמו ו IKKβ ליצור צרור ארבעה סליל שבו נמו דיימר להכיל שני הליקס של IKKβ (701-745) בחריץ פתוח מוארך עם ממשק אינטראקציה מורחבת. IKKβ (734-742), הידוע גם בשם התחום המחייב את נמו (NBD), מגדיר את המקום החם החשוב ביותר עבור הכריכה, שם שני טריפטוהנס החיוניים (739,741) לקבור עמוק בתוך הכיס נמו. הפרטים של המבנה המורכב יכול לסייע בעיצוב מבוסס מבנה ואופטימיזציה של מעכבי מולקולות קטנות מיקוד נמו. במקביל, קשה כי הקשירה של מולקולה קטנה או פפטיד יהיה ליצור מחדש ב-נמו השינוי המלא של הקונפורמציה (כלומר, פתיחה נרחבת של נמו מתפתל-סליל dimer) נגרמת על ידי איגוד של IKKβ ארוך (701-745), כפי שנצפה בגביש, ואת המבנה של נמו לא מאוגד או נמו מאוגד מולקולה קטנה מדכא עשוי לייצג יעד טוב יותר עבור מבנה מבוסס עיצוב הסמים ואופטימיזציה מעכב.

אורך מלא נמו ומבנים לחיתוך קטן המקיף את התחום כריכת IKK הוכיחו את הנחישות לקביעת מבנה בצורה לא מאוגד באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן ו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) שיטות10, אשר מתבקש לנו לעצב גרסה משופרת של התחום המחייב IKK של נמו. אכן, נימו (44-111) בטופס הלא מאוגד הוא רק חלקית מקופל ועובר החליפין באופן חלקי, ולכן אנו מוגדר לייצב את המבנה הdimeric שלה, מתפתל סליל קיפול ויציבות, תוך שמירה על זיקה מחייבת IKKβ. על-ידי הוספת שלושה הפטנים של אידיאלי dimeric מתפתל-סליל רצפים11 ב N-ו-C-termini של החלבון, וסדרה של ארבעה מוטציות הנקודה, יצרנו את נמו-EEAA, בונה באופן מלא dimeric מקופל בסליל מפותל, אשר הצילה את הזיקה ikk-bindingלטווח nanomolar כפי שנצפתה כיתרון נוסף, קיווינו מתאמים מפותל סליל (מבוסס על רצף GCN4) יהיה להקל על התגבשות ובסופו של דבר לסייע בקביעת רנטגן מבנה באמצעות החלפת מולקולרית. מתאמים המתפתל-סליל מנוצל באופן דומה הן להגביר את היציבות, לשפר את התנהגות הפתרון ולהקל על התגבשות trimeric סלילי ושברי נוגדנים13,14. נמו-EEAA מתבטאת בקלות ומטוהרים מ es, האבנצ'ה. התאים הcoli עם תגית Histidine ביקדין, הוא מסיסים, מקופל בסליל יציבה dimeric מתפתל והוא מגובש בקלות, עם עקיפה כדי 1.9 Å. הנוכחות של אזורים מתפתל מפותל סליל של GCN4 יכול בנוסף לסייע דיממו את הנתונים מקריסטלים של נמו-eeaa על ידי החלפת מולקולרית באמצעות המבנה הידוע של GCN415.

בהינתן התוצאות שהתקבלו עם apo-נמו-EEAA, אנו מאמינים את הפרוטוקולים המתוארים כאן יכול גם להיות מיושם על התגבשות של נמו-EEAA בנוכחות של פפטידים קטנים (כמו פפטיד d המולקולה) או מעכבי מולקולה קטנה, עם המטרה של הבנת הדרישות של נמו עיכוב מבנה מבוסס אופטימיזציה של מעכבי עופרת הראשונית בהינתן הפלסטיות והאופי הדינמי של מספר רבשל מבני מתחםהסליל המתפתל, השימוש במתאמים המתפתל מתפתל יכול למצוא ישימות כללית יותר בסיוע להגדרה מבנית.

Protocol

1. עיצוב בניית הקריסטלוגרפיה

  1. שיבוט את הרצף של נמו-EEAA כמו בפרסום הקודם12 בווקטור עבור ביטוי ב -E. coli באמצעות היזם T7, כולל תג N-טרמינל היסטידין ואתר מחשוף פרוטאז.
    הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו וקטור שונה כדי לכלול תג N-terminal-histidine תגית וירוס איכול טבק (TEV) מחשוף באתר10. וקטור זה מקל על המחשוף של התג שלו עבור התגבשות חלבונים ומשאיר רק את השלוחה הקצרה של שאריות פציעת-פצע לפני תחילת רצף החלבון הרצוי. הווקטור שממנו נגזר הדבר הזה, וקטורים חלופיים מפורטים בטבלת החומרים. בפרוטוקול זה, השינויים הבאים ברצף המקורי של נמו (44-111) הוצגו בהתאם, כפי שמתואר קודם לכן10, תוך שימוש במוטזיס מונחה צד. בתחילה ניסינו לייצב את נמו מתפתל הסליל דיימר הוספת מתאמים מפותל הסליל האידיאלי (באורך של לפחות שלושה הפטניות) אל מסוף N או C-terminal סוף או לשניהם. הסליל מתפתל כפול היה המבטיח ביותר מן התגבשות מוקדם יותר משפטי והוא שונה לאחר מכן הצגת מוטציות כדי לשפר את התגבשות כמתואר בעבר12.

2. ביטוי בקנה מידה גדול של שלו6 מתויג נמו-EEAA

  1. הפוך את המבנה לתאים BL21 (DE3) מוכשרים. חנות at-80 ° צ' כמו מלאי הגליצרול של התא.
  2. יום 1 – הכינו תרבות התחלתית של התאים. ב 125 mL Erlenmeyer בקבוקון, להוסיף 20 מ ל של פתרון ציר נהדר 20 μL של 100 mg/mL של מלאי של אמפיצילין. להוסיף כמה מיקרוליטרים של מלאי הגליצרול של התא (מ-80 ° c אחסון של BL21 (DE3) תאים המוסמכים שהפכו עם וקטור).
  3. לנער את 10 mL התרבות המתנע לילה ב 37 ° c, 220 rpm (כ 15 h).
  4. יום 2 – מן המתנע, לדלל עד OD600 = 0.1 ב 250 מ ל של ציר נהדר. הוסף אמפיצילין לריכוז הסופי של 100 μg/mL. לגדול עד OD600 = 0.8-1.0.
    1. הוספת איזופרופילי β-D-1-התאיוגלתויד (IPTG) עד 500 μM, ולגדול עבור 4 h ב 37 ° c.
    2. למדוד OD600 של תרבות המושרה לאחר 4 h. תרבות צריך להגיע OD600 = 6-10.

3. טיהור שלו6 מתויג נמו-EEAA

  1. התרבות תא ספין למטה ב 3,800 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c.
  2. שמור את הגלולה התא ולמחוק את המדיום.
    הערה: ניתן לשמור ולאחסן את הגלולה הסלולרית ב-20 ° c בשלב זה, לטיהור במועד מאוחר יותר.
  3. השהה מחדש את התאים ב 40 mL של מאגר הליזה המכיל 20 מ"מ Tris, 150 מ"מ הנרול, 10 מ"מ הסרפידול, 2 מ"מ MgCl2, 0.5 mm פנילמתיל פלוורקסיל, 2 מ"מ מילימטר (dtt) ו-3 μl של בנזיל Nuclease.
    הערה: ניקל מקיבוע מתכת הזיקה ליון כרומטוגרפיה (IMAC) העמודה מנוצל תואם 2mm DTT. לחילופין, 0.2 mM טריס (2-carboxyethyl) פוספאפין (TCEP) יכול להיות מנוצל.
  4. פצל תאים שהושעו מחדש לשני 20-25 mL.
  5. Lyse את התאים באמצעות עיתונות צרפתית (לחץ משוער 25,000 psi), חוזר 2-3 פעמים עבור כל סדרת מחלקים (בחדר הקר).
    הערה: לחלופין, התאים יכולים להיות מsonication (לא נבדק בפרוטוקול זה).
  6. הוסף אוריאה לתוך התא לריכוז הסופי של 8 מ ', לאפשר דגירה על פלטפורמת נדנדה עבור מינימום של 2 h או עד לילה. זה וכל צעדי הטיהור הבאים, למעט הדיאליזה, יכולים להתבצע בטמפרטורת החדר.
  7. יום 3 – העברת הultracentrifuge למטה לצינורות ומשקל איזון, הבטחת ליפוסט מילוי צינורות לפחות 3/4 מלא. ספין the ליפוסט ב 125,000 x g עבור 45 דקות ב 25 ° c. מעלה את הסופרנטנט לגביע 100 מ ל. בשביל לטעון לטור
    הערה: תפרידו ב -4 ° צ' יגרום לאוריאה לקרוס.
  8. על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה, להסיר אתנול מעמודת IMAC 5 mL עם 25 מ ל של H באלקטרופורזה2O ב 5 מ ל/דקה, ואחריו 25 מ ל של מאגר הימנעות המכיל 20 mm טריס, 150 מ"מ היאl, 500 מ"מ הסרביאזול, 2 מ"מ dtt, pH 8.0, ולאחר מכן 25 מ מ של מאגר מחייב המכיל 20 מ"מ טריס, 150 mm הנאזול, 10 מ"מ הסרפיזציה, 2 מ"מ dtt, 8 M אוריאה, pH 8.0
  9. טעינת אוריאה מודלת supernatant ב 3 מ ל/מינימום על עמודת IMAC, איסוף הזרימה דרך. שטוף את העמודה עבור 10 אמצעי אחסון של עמודות עם מאגר כריכה ב-3 mL/min.
  10. מקפלים את נמו-EEAA לבנות על העמודה על ידי שטיפת טור עם מאגר קיפול עבור 20 כרכים העמודה ב 3 מ מ/דקה, המכיל 20 מ"מ טריס, 150 mM הנאקל, 10 מ"מ הסרמדול, 2 מ"מ DTT, pH 8.0.
  11. ביצוע מעברי הדרגתי של נמו-EEAA, מ 10 כדי 500 מ ' הסרמדול על פני מעבר הדרגתי של 12 עמודות, איסוף כל משחרלי בצלחת איסוף שבר (1 mL שברים).
  12. המשיכו להתחמק ב-500 מילימטר לשני כרכים של טורים, והמשיכו לאסוף.
  13. הפעל נתרן dodecyl סולפט (SDS)-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) של שברים כדי לקבוע את הנוכחות של נמו-EEAA בשברים משחרלי.
    הערה: השתמשנו ב-10% אקרילאמיד, מאגר MES.
  14. שברים בבריכה המכילים חלבון מטרה טהור.
  15. מדידת ריכוז החלבון. של ברדפורד בשנת17
    הערה: יש להעריך את כמות הפרוטאז עבור מחשוף תגים.

4. שלו6 תג מחשוף וטיהור

  1. הוסף TEV ביחס משקל 1:10 של TEV: נמו-EEAA חלבון לקליב שלו6 תג. פרוטאז ה-TEV היה מטוהר בבית.
    הערה: מיטוב כמות ה-TEV, הזמן והטמפרטורה הדרושים למחשוף מלא בנפרד.
    1. מבטא TEV פרוטאז, S219V מוטציה18 ב BL21 (DE3)-התאים RIL ולטהר כמתואר מוקדם יותר19. להגדיל בקצרה את התאים כמתואר בשלב 2, למשל על ידי העיתונות הצרפתית לטהר באמצעות עמודת IMAC. לאחסן את החלבון הסופי ב 25 mM נתרן פוספט מאגר, pH 7.8, 150 mM הנאקל, 1 מ"מ EDTA, 2 מ"מ DTT, 20% v/v גליצרול.
  2. Dialyze המדגם לילה (כ 15 שעות) ב 4 L של 20 מ"מ Tris, 150 mM היאl, 2 מ"מ DTT, pH 8.0, כדי לאפשר מחשוף וכלה להסיר את הסרפיזציה עודפים ממדגם לטיהור הבאים.
  3. יום 4 – הסר את המדגם מדיאליזה. הפעל את הדגם SDS-PAGE של המדגם מתוך מחשוף TEV כדי להבטיח המחשוף הושלם.
  4. על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה, להסיר אתנול מעמודת IMAC 5 ml עם 25 מ ל של H באלקטרופורזה2O ב 5 מ ל/דקה, ואחריו 25 מ ל של מאגר הימנעות המכיל 20 mM טריס, 150 מ"מ היאl, 500 מ"מ הסרביאזול, 2 מ"מ dtt, pH 8.0, ולאחר מכן מאגר מחייב המכיל 20 מ"מ טריס, 150 מ"מ, 10 מ"מ הסרמדול, 2 מ"מ dtt, pH 8.0.
  5. טען את העמודה ב-1 מ ל/דקה עם נמו-ביקבה נימו-EEAA. ביקעת נמו-EEAA יהיה לעבור את הזרימה-דרך: לאסוף בלוח 96 שבר היטב האוסף (1 mL שברים). שטוף את הטור עבור חמישה כרכים של העמודה 20 מ"מ טריס, 150 מ"מ היאל, 10 מ"מ הסרמאזול ב 1 mL/min, המשך לאסוף בצלחת איסוף שבר.
  6. וביטול העסקה שלו6-נמו-EEAA עם שלושה כרכים טור של 20 מ"מ טריס, 150 מ"מ האנקול, 500 מ"מ הסרביאזול, 2 מ"מ Dtt, pH 8.0, איסוף הימנעות בקבוקון mL 50.
  7. הפעל SDS-דף ג ' ל זרימה-דרך שברים כדי לקבוע נוכחות של ביקבד נמו-EEAA.
  8. בריכת זרימה-דרך שברים המכילים ביקמה נימו-EEAA לבנות, ולהתרכז באמצעות הרכז תא מעורבב ל 5 מ ל. משקל מולקולרי ממברנת לגזור (MWCO) = 3 kDa.
  9. באמצעות ממברנה של 3 kDa MWCO, dialyze מרוכז לדוגמה 2 L של Tris 20 מ"מ, 100 mM היאl, 2 מ"מ DTT, pH 8.0 עבור 2 h. לשנות את מאגר דיאליזה ל 2 ליטר של מאגר דיאליזה טרי ללילה דיאליזה (כ 15 h), ב 4 ° c.
  10. יום 5 – טען 5 מ ל של המדגם דיאליזה על גודל הדרה כרומטוגרפיה (SEC) 16 מ"מ x 60 ס"מ עמודה (34 יקרומטר גודל הממוצע) ב 1 mL/min ב 2 מ"מ טריס, 100 מ"מ הנאל, 2 מ"מ dtt, pH 8.0. חזור על הפעולה עם עמודות נוספות בהתאם לעוצמת הדגימה.
  11. בריכת השברים המתאימים dimeric נמו-EEAA.
    הערה: נמו-EEAA משחררים בין 60-65 mL, המתאים חלבון משקל מולקולרי גדול יותר, בשל טבעו מוארך של סליל dimeric מתפתל.
  12. להתרכז באמצעות מרכז התא מעורבב ו MWCO = 3 ממברנה kDa לריכוז הסופי של 113 μM (1.65 mg/mL).
  13. מחלקים את החלבון ואת החנות ב 4 ° צ' (יציב מעל 1 לחודש).

5. הקרנת מטריצה דלילה

הערה: הפרוטוקול מבצע ניסויים התגבשות באמצעות מסכי מסחרית זמינים והגדרת ניסויים בירידה באמצעות רובוט התגבשות. תמונות קריסטל נאספים באופן אוטומטי על ידי האימגר.

  1. באמצעות מסכי מטריצה דלילה זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים), פיפטה 60 μl של פתרון מטריצה דלילה לתוך כל אחד 96 בארות של 2 לוחית התגבשות של תא שחרור לשבת שחרור אדי דיפוזיה (פתרון אגירה).
  2. באמצעות הירידה רובוטי לסטר, לוותר 100 nL של תמיסת חלבון ב 1.65 mg/mL ביחס 1:1 עם פתרון למאגר בירידה 1 עבור הכרך הסופי של 200 nL; אז 66 nL של פתרון חלבון עם 134 nL של פתרון אגירה עבור נפח סופי של 200 nL בירידה 2 (1:2 יחס).
  3. לאטום את הצלחת באמצעות נייר איטום 3 אינץ ' ברחבי העולם מיד לאחר החילוק.
    הערה: טיפות יהיה יבש אם הושאר חשוף לאטמוספירה יותר מ 2-3 דקות.
  4. אחסן את המגשים באחסון התגבשות באמצעות מספר 20 ° c, בדיקת התמונות שנאספו באופן אוטומטי לנוכחות גביש, החל מיומיים.
    הערה: הקרנת התגבשות המשיכה במקביל למיטוב הבנייה. גבישים ראשוניים שנוצרו בתנאים הבאים (מסכים מסחריים המפורטים בטבלה של חומרים): a) 0.1 M טריס, pH 8.0, 30% v/v פוליאתילן גליקול (יתד) גברת 550, 5% פולי-γ-גלוטמית חומצה, 200-400 משקל מולקולרי נמוך kda פולימר (PGA-LM); b) 0.1 M טריס, pH 7.8, 20% w/v פג הגברת 2k, 5% PGA-LM; ג) 0.1 M טריס, pH 7.8, 20% w/v יתד 3350, 5% PGA-LM. גבישים מטריצה דלילה יהיה אחידות הסריג המסכן; לפיכך, הם ייראו עניים באמצעות הדמיה חוצת-מקוטב. השתמש בדימות UV כדי להבטיח כי הקריסטלים מכילים חלבונים. השלב הבא של דור מלאי הזרעים הוא הכרחי להשגת קריסטלים באיכות עקיפה סופית.

6. הדור במלאי זרעים

הערה: אנו מקבלים באצילות להשיג קריסטלים עבור הדור הזרע ב 0.1 M Tris pH 8.0, 5% PGA-LM, 3.6% w/v פג 20k. עם זאת, הקריסטלים יראו את הפסיפס גבוה ואינם מתאימים לאיסוף נתונים בשלב זה.

  1. באמצעות ערכה עבור הזרע הדור, להכין מלאי זרעים על ידי ללטף את כל טיפה עם גביש הנוכחי, ומקום לתוך 50 μL של פתרון מצב התגבשות במבחנה שסופקו.
  2. מערבולת את מלאי הזרעים עבור 3 דקות, פעימות 20 s על ו 10 s off.
  3. מדלל את מלאי הזרעים ב1:10. בהפרשים של 1:10000 אחסן את כל הדילול ב-4 ° c, לשימוש נוסף.

7. מסכים עדינים

  1. עיצוב מסכים עדינים שונים את התנאים עבור טריס, PGA-LM, ו-פג. לשנות אורך יתד עבור מגשים בודדים.
    הערה: המסך המשובח שהפיק את הגביש מנוצל לקביעת מבנה של נמו-EEAA המועסקים בתנאים הבאים: 0.1 M טריס pH 8; PGA-LM מגוון בין 8 ל -0% בטורים 1-12. שורות A-H הוקרן יתדות שונות, עם ריכוזים שונים בעמודות 1-12 כדלקמן. A: יתד 200 (0-40% v/v); B: יתד 400 (0-40% v/v); ג: יתד גברת 500 (0-40% v/v); D: יתד 1000 (0-30% w/v); E: יתד 3350 (0-30% w/v); F: יתד 6k (0-30% w/v); G: יתד 10k (0-20% w/v); H: יתד 20k (0-20% w/v). הגביש הופיע גם H4 (5.45% w/v פג 20k, 5.8% w/v PGA-LM). בפרוטוקול זה, בונה המסך של קריסטלוגרפיה באמצעות חלבון מטפל נוזלי שימש כדי לבנות את המסכים.
  2. הזרע מלאי חלבון ביחס נפח 1:25 של 1:1000 הזרע דילול.
    הערה: הריכוז של נמו-EEAA יהיה טיפה, אבל גבישים עדיין ליצור.
  3. חזור על שלב 2 באמצעות 1:10000 זרע דילול, אותו 1:25 יחס נפח.
  4. באמצעות הירידה סטר, לוותר 100 nL של תמיסת חלבון ב 1.65 mg/mL, עם 1:1000 דילול של מלאי הזרעים ליחס 1:1 עם פתרון אגירה בירידה 1 עבור נפח סופי של 200 nL. חזור על ירידה 2, אבל עם 1:10000 דילול של מלאי זרעים מתנה.
  5. לאטום את הצלחת באמצעות נייר איטום 3 אינץ ' ברחבי העולם מיד לאחר החילוק.
    הערה: טיפות יהיה יבש אם הושאר חשוף לאטמוספירה יותר מ 2-3 דקות.
  6. אחסן את המגשים באחסון הצמידה, ב-20 ° c, בדיקת תמונות שנאספו לאחר יומיים לנוכחות גביש.
  7. בדקו את הקריסטלים עם האגגר הפוזל לאחידות הסריג, כדי לבחור בתנאים בודדים להגדרת המגשים הבאים.

8. הדור של קריסטלים לאיסוף מידע

  1. עיצוב מסכי תנאי יחיד סביב טריס, PGA-LM, ו-פג מצב אשר הפיק גבישים אחידים כפי שנותחו על ידי מקוטב תמונות, ואת הקריסטלים הגדולים ביותר האפשריים.
    הערה: קריסטלים מתנאים אלה אינם סדירים בצורתם, ובעיקר יריעות דקות מלבניות. זהו המפתח לבחור מצב שבו הקצוות של הגביש מוגדרים היטב ויש להם את העובי הגדול ביותר האפשרי.
  2. להפוך 20 מ ל של מצב התגבשות ביד.
  3. באמצעות הצינורות מרובת הערוצים, לוותר 60 μL לכל טוב ב 2 שחרור תא, 96 התגבשות היטב לוחית שחרור של אדי מתיישב.
  4. הכן את מלאי הזרעים כמתואר בשלב 6.2.
  5. מוותר על החלבון כמתואר בשלב 6.3.
  6. לאטום את הצלחת באמצעות נייר איטום 3 אינץ ' ברחבי העולם מיד לאחר החילוק.
    הערה: טיפות יהיה יבש אם הושאר חשוף לאטמוספירה יותר מ 2-3 דקות.
  7. אחסן את המגשים בתוך האימגר ב -20 ° c ובדוק את התמונות לנוכחות הקריסטל בכל יום.
  8. בדוק תמונות מקוטבות של הקריסטלים לאחידות הסריג, כדי לבחור גבישים לאיסוף נתונים.

9. קביעת הגנה על ההקפאה

  1. כדי לבדוק את האזור הגנה, ליצור פתרונות מניות המתאימים לתנאים התגבשות, אבל המכיל 30%, 20%, 10%, ו 5% ריכוז גבוה יותר של כל רכיב. התוספת של נפח הגנה מפני ההקפאה תגרום לריכוז סופי של רכיבים הדומים לתנאי התגבשות.
    הערה: לבדיקת הגנה על ההקפאה בריכוז של 30% על ידי נפח למצב התגבשות 0.1 M טריס, להתחיל עם פתרון מניות של 0.143 M טריס, לפני הוספת הגנה ההקפאה.
  2. מתוך ערכת חומרים הקפאה, ליצור 10 μL של מדגם לבדיקת ההקפאה-הגנה על ידי ערבוב 30% על ידי נפח של מצב ההקפאה ב 70% של פתרון מלאי התגבשות מצב, עבור ריכוז סופי של 30% ההקפאה הגנה בתנאים התגבשות המקורי. מערבבים ביסודיות.
    1. באמצעות הפיפטה 10 μL, לקחת 5 μL של מבחן הגנה על פתרון מוגן לצלול את הקצה pipet לתוך חנקן נוזלי. אם הקרח נצפה, להשליך.
    2. . בדקו את כל ההגנה על 30% לקבלת פתרונות מוצלחים, חזרו על התהליך ב -20%, ואז 10% ו -5% מהמגן המקפיא.
    3. ניצול הפתרון המוצלח של הגנה מפני ההקפאה עם האחוז הקטן ביותר של הגנה מפני השטח, להוסיף 0.5 μL של הפתרון לתוך מבחן ירידה עם הקריסטלים הנוכחי. להתבונן תחת מיקרוסקופ, העיתוי כמה ארוך הגביש נמשך במצב, אם לא בלתי מוגבל.
      הערה: קריסטלים אלה נועדו לבדיקה בלבד ויישלכו. עבור נמו-EEAA, 12% 1, 2-propanediol הוא הפתרון האופטימלי להגנה על החומרים. 12% מהחשבונות לדילול הפתרון לתמיסת ההקפאה יחוו כאשר יתווסף לירידה הגבישית של כ-100 nL, לריכוז סופי של 1, 2-propanediol של 10%.

10. לולאה בגביש

  1. גבישי לולאה 1-2 ימים לפני המשלוח סינכרוטרון.
    הערה: קריסטלים יהיו בערך 60-100 יקרומטר בקוטר: 0.05 – 0.10 mm לולאות הם אידיאליים עבור לולאה.
  2. . תחתוך את הקלטת מראש הבאר
  3. להוסיף 0.5 μL של פתרון התגבשות המכיל 12% 1, 2-propanediol-הגנה ההקפאה ישירות לבאר.
    הערה: הריכוז הסופי של 1, 2-propanediol הוא כעת בערך 10%, עקב דילול על ידי 100 nL של שחרור פתרון (ירידה משוער נפח הפחתה מן הראשונית 200 nL, עקב האדים הדיפוזיה).
  4. . לולאה את הגביש מבאר
    הערה: קריסטלים גדלים לעתים קרובות על קרקעית הבאר, אך הם יתעבו בדחיפה עדינה מהלולאה. . פעם יצאה לסיבוב, לולאה
  5. לאחסן את הגביש המכיל לולאות ההקפאה ב pucks שקוע נוזל N2.
  6. אחסן את הגרביים האלה ב-N הנוזלי ב-dewar בקבוקון עד שהם מוכנים למשלוח לעקיפה של קרני רנטגן בסינכרוטרון.

11. איסוף נתונים

  1. איסוף נתונים לעקיפה של קרני רנטגן. בפרוטוקול זה, השתמש AMX beamline (מזהה: 17-ID-1), לאומי סינכרוטרון מקור אור II.
    הערה: הנתונים נאספו באתר אך ניתן לאסוף מרחוק. איסוף נתונים באזור הגביש שהראה אחידות הסריג בתמונות מקוטבות. הצב את הקריסטלים בלולאה כך שאיסוף הנתונים לא יכלול אזורים "עניים" של הגביש, בעוד הגביש מסתובב בתוך הגלומטר. נתונים שסיפקו את הפתרון הטוב ביותר הגיעו מהאוסף בשולי הארכה של גביש על 5 x 5 יקרומטר בגודל. השתמש בעזרת שימוש כדי לזהות את האזורים הטובים ביותר בגביש כדי לאסוף20.

12. עיבוד נתונים ברנטגן

  1. ערכת נתונים של תהליך לרזולוציה הגבוהה ביותר שנאספה (1.8 Å) עם התוכנית XDS IDXREF כדי לקבוע את קבוצת החלל, תא היחידה ותוכן הממס.
  2. שילוב נתונים באמצעות תוכנית של שילוב XDS.
  3. כוונת התהליך משתנה מתוכנית XDS XDS באמצעות שרת STARANISO, באמצעות σI I/מ1.2 מוצע עבור משטח הגבלת עקיפה עבור הנתונים.
    הערה: הנתונים לא יוחתכו באליפסואיד אמיתי. שמור את כל הנתונים מעל I/σI של 1.2 הקיצוץ. הסטטיסטיקות על הנתונים המחושבים עבור שלמות כדורית יהיו עניות, עקב חיתוך לא-כדורי. השלמות אליפטית הייתה 88% עם הרזולוציות הגבוהות ביותר של: 1.88 Å, 2.10 Å 2.55 ו-it לאורך הציר *, b * ו-c, בהתאמה.

13. פתרון מבנה

  1. לנצל את מבנה רנטגן של GCN4 (PDB: 4DMD)15 כמודל חיפוש עבור החלפת מולקולרית באמצעות מזעם21 phenix22. מבנה 4DMD הוגדר ב-MRage כמו "הרכב", ואת הפתרון MRage בהצלחה בנתה את החלק מבנה המתאים למסוף N-טרמינל מתפתל-סליל של נמו-EEAA, הומוולוגי למודל החיפוש, עבור שתי השרשראות dimer.
    הערה: בטל תיקון אנאיזוטרופיה ב-PHASER, או שהנתונים יהיו מדורגים שוב.
  2. לנצל סיבובים רצופים של לבנות באופן אוטומטי23 ב phenix ובניין ידני (באמצעות 2fo-Fc ו-f-fc מפות, ב קוט24) כדי לבנות את שאר המבנה.
  3. לבנות באופן ידני שאריות עדיין חסר לתוך המודלמבוסס על 2f o-fc ו-f-fc מפות, באמצעות קוט24.
    הערה: השלב האחרון מעורב בבניית 4 שאריות N-טרמינל ו -4 C-שאריות מסוף לכל מונומר. מיקום שרשרת צדדית הותאם באופן ידני גם בהתאם לצורך.
  4. חישוב מפת השמטת משולב באמצעות PHENIX ו 10% השמטה של המבנה.

14. מבנה העידון

  1. למקד את המבנים עם PHENIX עידון. הפעל את היטושים הראשוניים מול משקולות ממיסים בצובר וסטריאוכימיה, האילוצים מרגיעים של RMSbond ו-Rmsbond ל-0.01 ו-1.0, בהתאמה. המשך עידון על גורמי B מסוימים, פרמטרים של TLS וOccupancies.

תוצאות

שיבוט, ביטוי וטיהור של התחום המחייב של ה-IKK של נמו.
הפרוטוקול שלאחר מחקר זה כדי להשיג את הרצף הסופי של נמו-EEAA (איור 1א), אשר הפיק גבישים באיכות עקיפה, היה מעורב בביטוי ואפיון של כל המבנים ביניים, כולל תוספת של מתאמי סליל מפותל ב N-ו-C-טרמינוס, המוטציות C76A, C95S וא...

Discussion

נסיונות התגבשות של נמו בצורה לא מאוגדת לא הצליחו, כולל ניסיונות שימוש בחלבון באורך מלא וכמה בונים חיתוך המקיף את התחום כריכת IKK. האפיון הביופיזיקלי שלנו של התחום המחייב את האיגוד של נמו (שאריות 44-111) קיווטות מעגלית, ספקטרוסקופיית nmr ואנאיזוטרופיה מצביעים על כך שבניית המבנה, אם כי מסוגל לאגד I...

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לפרופסור ד. מדן, עבור דיונים רבים ומועילים במהלך פרויקט זה. אנו מודים לפרופסור ד. בולסון על מתנת הפלסמיד המכילה את הסליל הGCN4 ממוטב. אנו מודים לד ר ב. גואו. אנו מודים לכריסטינה ר. ארנולדי, תמר בסילישווילי ואיימי א. קנדי על הפגנת הנוהל. אנו מודים למכון הליבה של קריסטלוגרפיה באמצעות ביורט ולמחלקות הכימיה ולביוכימיה & ביולוגיה של התא בדרמות לשימוש בציוד הקריסטלוגרפיה ובצוות הביו-ביוטיים לתמיכתם. מחקר זה בשימוש AMX beamline של הלאומי סינכרוטרון Light מקור השני, ארה ב. משרד האנרגיה (DOE) משרד המדע המשתמש מתקן מופעל עבור המשרד DOE של המדע על ידי המעבדה הלאומית ברוקהייבן תחת חוזה לא. דה-SC0012704. אנו מודים לצוות במלון NSLS II על תמיכתם. עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 ו P20GM113132, ורומן מוניק-פפרקורן ומענק אינטראקטיבי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM)Molecular DimensionsMD2-100-150For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis MembraneSpectra/Por132724For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred CellMillipose SigmaUFSC 05001For protein concentration
Ammonium ChlorideMillipore SigmaG8270For minimal media labeling
Benzonase NucleaseMillipore Sigma9025-65-4For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent CellsAgilent TechnologiesModel: 230245TEV expression
CryoProHampton ResearchHR2-073Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose)Millipore SigmaA9434For minimal media labeling
Difco Terrific BrothThermoFisherDF043817For culture growth
Dithiothreitol > 99%GoldbioDTT25For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixLiquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M SolutionHampton ResearchHR2-581For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL columnGE Healthcare17524802For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDASMolecular DimensionsMD1-59For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 MorpheousMolecular DimensionsMD1-46For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
ImidazoleThermoFisher288-32-4For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactosideGoldbioI2481C5For induction of cultures
MRC2 crystallization plateHampton ResearchHR3-083Crystallization plate
NT8 - Drop SetterFormulatrixCrystallization
pET-16bMillipore Sigma69662For cloning of NEMO-EEAA
pET-45bMillipore Sigma71327For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluorideThermoFisher36978For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 TiBeckmann Coulter339160Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000Hampton ResearchHR2-609For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827For TEV production
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly:Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGERFormulatrixCrystallization Imager
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99%Millipore SigmaS9888For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)GoldbioTCEP1Reducing agent
The Berkeley ScreenRigakuMD15-BerekelyFor sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA ScreenMolecular DimensionsMD1-50For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M SolutionHampton ResearchHR2-589For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format)Thermofisher15504020For buffering of purification solutions
UreaThermoFisher29700For denaturation of NEMO-EEAA

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154NF BI B IKKNBD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved