פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

Summary

אנחנו מציגים מכשיר מיקרופלואידיסי צנטריפוגלי מנוע שיכול לטפח את התאים הניידים. באמצעות התקן זה, הספרואידים של סוגי תא יחיד או מרובים יכול להיות בקלות מתורבת בתנאי כבידה גבוהה.

Abstract

תרבות תא ספרואיד תלת מימדי יכולה להשיג תוצאות שימושיות יותר בניסויים בתאים, משום שהוא יכול לדמות טוב יותר מיקרוסביבות תאים של הגוף החי מאשר תרבות תא דו-ממדית. במחקר זה, אנו מפוברק מנוע חשמלי מונחה מעבדה-on-a-CD (קומפקט דיסק) פלטפורמה, המכונה מערכת מבוססי מיקרופלואידיג צנטריפוגלי (CMS) התרבות, כדי ליצור תלת מימדי (3D) מספרי טלפון של תאים המיישמים כוח צנטריפוגלי גבוה. התקן זה יכול לשנות את מהירויות הסיבוב כדי ליצור תנאי הכבידה מ 1 x g כדי 521 x g. מערכת CMS היא 6 ס מ קוטר, יש 500 יקרומטר המיקרוגל, והוא נעשה על ידי דפוס עם polydiמתיל siloxane בתבנית פוליקרבונט מראש על ידי מחשב בקרה מספרית. חומת מחסום בכניסה לערוץ של מערכת CMS משתמשת בכוח צנטריפוגלי כדי לפזר תאים באופן שווה בתוך השבב. בסוף הערוץ, יש אזור שקופית המאפשר לתאים להיכנס למיקרוגל. כהדגמה, נוצרו הספרואידים על ידי תרבות חד-תרבותית ומקודת של תאי גזע האדם הנגזר של אדיפוז והריאות האנושית בתנאי כבידה גבוהה באמצעות המערכת. מערכת ה-CMS השתמשה בתוכנית פעולה פשוטה כדי לייצר מספרי התרבות של מבנים שונים של קונצנטריים, יאנוס וכריכים. מערכת CMS יהיה שימושי בביולוגיה התא ולימודי הנדסת רקמות הדורשות spheroids ותרבות אורגאידית של סוגי תא יחיד או מרובים.

Introduction

קל יותר לדמות ביולוגי בvivo מיקרו-סביבות עם תלת מימדי (3D) תרבות תא ספרואיד מאשר עם 2-מימדי (2D) תרבות התא (g., המקובלת בצלחת פטרי התרבות תאים) כדי לייצר ניסוי מציאותי יותר מבחינה פיזיולוגית תוצאות¹. שיטות היווצרות הספרואיד הזמינות כוללות את טכניקת השחרור התלויה², טכניקת כיסוי נוזלי³, טכניקה תאית מגנטית⁴, טכניקת microfluidic מגנטי מבוסס כוח⁵, והשימוש ב שחקני המשך⁶. למרות שלכל שיטה יש יתרונות משלה, שיפור נוסף באופן הנקרא, פרודוקטיביות ויצירת הספרואידים מניבים הכרחי. לדוגמה, בעוד טכניקת microflu, מבוססי כוח מגנטית⁵ היא זולה יחסית, ההשפעות של שדות מגנטיים חזקים על תאי החיים חייבים להיחשב בזהירות. היתרונות של תרבות ספרואיד, במיוחד בחקר תא גזע mesenchymal והתפשטות, דווחו במספר מחקרים^7,8,9.

מערכת מיקרופלואידיג צנטריפוגלי, הידוע גם בשם lab-על-a-CD (קומפקט דיסק), הוא שימושי עבור בקלות שליטה על הנוזל הפנימי וניצול הסיבוב של המצע, ובכך מנוצל יישומים ביו כגון חיסוני¹⁰, מטרי הצביעה בחני לזיהוי סמנים ביוכימיים¹¹, הגברה חומצות גרעין (PCR) בחני, מערכות ניתוח דם אוטומטי¹², ו-all-in-one צנטריפוגלי מיקרופלואידיc מכשירים¹³. הכוח המניע השולט בנוזל הוא כוח הצנטריות שנוצר בסיבוב. בנוסף, פונקציות מרובות של ערבוב, ולינג, פיצול לדוגמה ניתן לעשות פשוט בפלטפורמה זו תקליטור יחיד. עם זאת, בהשוואה לשיטות הניתוח הנ ל, היו פחות ניסיונות להחיל פלטפורמות תקליטור לתאי תרבות, במיוחד spheroids¹⁴.

במחקר זה, אנו מראים את הביצועים של מערכת ספרואיד מבוססי מיקרופלוטואידים (CMS) על ידי המערכת המבוססת על בסיס חד-תרבותי או התרבות של תאי הגזע האנושי הנגזר של אדיפוז (hASC) ופיברוהכדורים לריאות האדם (MRC-5). המאמר מתאר בפרוטרוט את מתודולוגיית המחקר של הקבוצה שלנו¹⁵. כך ניתן לשכפל בקלות את התרבות הספרואידית המעבדת על-גבי התקליטור. מערכת להפקת CMS הכוללת שבב תרבות CMS, מחזיק שבב, מנוע DC, הר מוטורי, ופלטפורמה מסתובבת, מוצג. הר המנוע הוא 3D מודפס עם יריעות אקריניטריל בוטטירן (ABS). מחזיק שבב ופלטפורמה מסתובבת הם CNC (שליטה מספרית המחשב) מחובר עם המחשב (פוליקרבונט). המהירות המסתובבת של המנוע נשלטת מ 200 כדי 4,500 סל ד על ידי קידוד (PID-אינטגרלי-נגזרים) אלגוריתם מבוסס על אפנון רוחב הדופק. הממדים שלה הם 100 mm x 100 mm x 150 mm וזה שוקל 860 g, מה שהופך אותו קל לטפל. באמצעות מערכת CMS, spheroids ניתן לייצר בתנאי כבידה שונים מ 1 x g כדי 521 x g, כך המחקר של בידול התא קידום תחת כבידה גבוהה ניתן להאריך מ 2d תאים^16,17 כדי 3d ספרואיד. Coculture של סוגים שונים של תאים היא גם טכנולוגיה מרכזית לחיקוי יעיל של הסביבה vivo¹⁸. מערכת ה-CMS יכולה בקלות לייצר מונורואידים, כמו גם הספרואידים של מבנים מסוגים שונים (למשל, קונצנטריים, יאנוס וכריכים). מערכת CMS יכול להיות מנוצל לא רק במחקרים ספרואיד פשוט אלא גם במחקרים אורגאיד 3D, כדי לשקול מבנים איברים אנושיים.

Protocol

1. הייצור המבוסס על שבב התרבות של מיקרופלוטואידים (CMS)

1. הפוך את תבניות המחשב לשכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות של CMS על ידי עיבוד שבבי CNC. מידות מפורטות של השבב ניתנות באיור 1.
2. מערבבים בסיס PDMS ו PDMS לריפוי הסוכן ביחס של 10:1 (w/w) עבור 5 דקות ומקום desiccator עבור 1 h כדי להסיר בועות אוויר.
3. לאחר שיוצקים את התערובת PDMS לתוך תבניות של שבב התרבות של CMS, להסיר בועות אוויר עבור 1 h יותר ולרפא בחדר חום ב 80 ° c עבור 2 h.
4. מניחים אותם במנקה פלזמה שואב אבק עם המשטחים להיות מאוחדים כלפי מעלה ולחשוף אותם לפלזמה בסיוע אווירי בכוח של 18 ואט עבור 30.
5. בונד את שתי השכבות של שבב התרבות של CMS ולמקם אותו בתא החום ב 80 ° c עבור 30 דקות כדי להגביר את חוזק ההדבקה.
6. לחטא את שבב התרבות של CMS בעיקור בחיטוי ב 121 ° c ו 15 psi.

2. הכנת תא

1. הפשרת 1 mL של הבקבוקון המכיל 5 × 10⁵– 1 × 10⁶ hASCs or mrc-5 תאים באמבט מים ב 36.5 ° c עבור 2 דקות.
2. הוסף 1 מ ל של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) למבחנה ולערבב בעדינות עם הפיפטה 1,000 μL.
3. שים 15 מ ל של DMEM קדם מראש עד 36.5 ° צ' לתוך מיכל פטרי בקוטר 150 מ"מ באמצעות פיפטה ולהוסיף את התאים מתוך הבקבוקון.
4. לאחר יום אחד, לאכול את dmem ולהחליף עם 15 מ ל של DMEM טרי. לאחר מכן, שנה את המדיה כל יומיים או שלושה.
5. כדי לנתק את התאים מצלחת פטרי, להוסיף 4 מ ל טריפסין לצלחות פטרי ולמקם אותם בחממה ב 36.5 ° c ו-5% CO₂ עבור 4 דקות.

3. מערך חד-תרבותי מסוג ספרואיד

1. לשים 2.5 mL של 4% (w/v) הריבוי של F-127 פתרון לתוך החור של התרבות של CMS (איור 2A) תוך כדי סיבוב השבב ב 500 – 1000 סל ד ולאחר מכן לסובב את השבב ב 4,000 rpm עבור 3 דקות באמצעות מערכת CMS (איור 2a).
   הערה: הציפוי הפלורליסטית מונע הצמדה לתא ליציאת האוויר בזמן שהשבב מסתובב. תוודא שהאוויר לא לכוד. במיקרוגל
2. מודנית את שבב התרבות CMS מלא בפתרון הריבוי לילה ב 36.5 ° c ב 5% CO₂.
3. הסר את התמיסה הפלורליסטית, שטוף את פתרון הריבוי הצורות הנותר עם DMEM, ויבש את השבב עבור 12 שעות על ספסל נקי.
4. הוסף 2.5 mL של DMEM לשבב התרבות של CMS ולסובב את השבב בתוך ~ 4,000 rpm עבור 3 דקות להרטיב את החלק הפנימי של השבב.
5. לעצור את הסיבוב ולשלוף את 100 μL של DMEM כדי להפוך מקום להזרקת השעיית התא.
6. הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים 5 × 10⁵ hASCs או 8 × 10⁵ mrc-5s על ידי ליטוף באופן אחיד להפיץ את התאים על ידי ליטוף 3 – 5s עבור השעיה.
7. לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות למלכודת תאים בכל המיקרוגל על ידי כוח צנטריפוגלי.
   הערה: מהירות סיבוב מוגזמת עלולה לגרום לבריחה תא דרך חורים הפליטה פתרון.
8. תרבות התאים 3 ימים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO₂, סיבוב ב 1000-2000 rpm. לשנות את התרבות בינונית כל יום.

4. מבנה ספרואיד

1. מבנה קונצנטריים
   1. להוסיף את התאים הראשונים, 2.5 × 10⁵ hASCs, ולסובב את השבב ב 3,000 סל ד. לאחר 3 דקות, להוסיף את התאים השני, 4 × 10⁵ mrc-5s, ולסובב את השבב ב 3,000 rpm עבור 3 דקות. הכנס סכום כולל של 100 μl של השעיות בתאים באמצעות ליטוף. כאשר התאים מוזרקים, הזזת המהירות המסתובבת ל-500-1000 סל ד.
   2. תרבות התאים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות%, ו 5% CO₂ על ידי סיבוב ב 1000-2000 rpm. ההרורואידים הקונצנטריים. נוצרים בתוך 24 שעות עבור תרבות ארוכת טווח, שנה את מדיום התרבות כל יום.
2. מבנה ספרואיד
   1. הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים הראשונים, 2.5 × 10⁵ hASCs, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
   2. מודאת השבב ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO₂ על ידי סיבוב ב 1000 – 2000 rpm עבור 3 h.
   3. הוסף 100 μL של השעיות התא המכילות את הסט השני של תאים, 4 × 10⁵ mrc-5s, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
   4. תרבות התאים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO₂ על ידי סיבוב ב 1000-2000 rpm. הספרואידים של יאנוס נוצרים בתוך 24 שעות. עבור תרבות ארוכת טווח, שנה את מדיום התרבות כל יום.
3. היווצרות כריך ספרואיד
   1. הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים הראשונים, 1.5 × 10⁵ hASCs, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
   2. מודאת השבב ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO₂ על ידי סיבוב ב 1000 – 2000 rpm עבור 3 h.
   3. הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים השני, 3 × 10⁵ mrc-5s, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
   4. מודיית את השבב ב 36.5 ° c, > 95% לחות%, ו 5% CO₂ על ידי סיבוב ב 1000 – 2000 rpm עבור 3 h.
   5. הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים השלישי, 1.5 × 10⁵ hASCs, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
   6. תרבות התאים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות%, ו 5% CO₂ על ידי סיבוב ב 1000-2000 rpm. ההרואידים של הסנדוויץ ' נוצרו. בתוך 12 שעות עבור תרבות ארוכת טווח, שנה את מדיום התרבות כל יום.

5. צביעת תאים

1. חמם את צבע הזריחה של התא לטמפרטורת החדר (20 ° c).
2. הוסף 20 μL של dimethylsulfoxide (DMSO) לכל בקבוקון כדי לבצע פתרון 1 מ"מ.
3. דלל את הזריחה לריכוז העבודה הסופי של 1 μM באמצעות DMEM.
4. הוסיפו את הקרינה הפלואורסצנטית לתא ההשעיה והשהה בעדינות מחדש באמצעות פיפטה.
5. דגירה 20 דקות ב 36.5 ° צ', לחות של > 95%, ו 5% CO₂.

תוצאות

שבב התרבות CMS בקוטר 6 ס מ (איור 2) נעשה בהצלחה בעקבות הפרוטוקול הנ ל. ראשית, השבב נעשה בנפרד משכבה עליונה ושכבה תחתונה ולאחר מכן התחברה יחד על ידי התחברות פלזמה. ניתן לאסוף בקלות spheroids על-ידי ניתוק השבב. הערוץ של שבב התרבות של CMS כולל יציאת מפרץ ואזורי מרכז, שקופית ולמיקרוגל (

Discussion

CMS הוא מערכת סגורה שבה כל התאים המוזרקים להיכנס למיקרוגל ללא בזבוז, מה שהופך אותו יעיל יותר וחסכוני יותר מאשר שיטות הדור המבוסס על מבוססי המיקרוגל. במערכת CMS, התקשורת מוחלפת מדי 12-24 שעות דרך חור יניקה שנועד להסיר את המדיה בשבב (איור 3A). במהלך השאיבה מדיה, בקושי כל אמצעי התקשור?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021