יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Summary

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

Abstract

אוביקוויב (רוב) והשינויים התלויים שלאחר ההעברה של חלבונים לשחק תפקידים ביולוגיים בסיסיים בתוך התא על ידי שליטה ביציבות החלבון, פעילות, אינטראקציות, ולוקליזציה תאיים. הם מאפשרים לתאים להגיב לאותות ולהסתגל לשינויים בסביבתו. שינויים במנגנונים אלה עלולים לגרום למצבים פתולוגיים חמורים כגון מחלות ניווניות וסרטן. מטרת הטכניקה המתוארת כאן היא להקים פרופילים התלויים בפרופילי מדים והכל, במהירות ובדייקנות, מקווי תאים מתורבתים. השוואת פרופילים שונים המתקבלים מתנאים שונים מאפשרת זיהוי של שינויים ספציפיים, כגון אלה הנגרמת על ידי טיפול למשל. התמרה ויראלית מתווכת תא מבוצעת כדי ליצור קווי תאים יציבים המבטא שני תגים (6His ודגל) גירסה של משנה (אוביקוויב או ubl כגון SUMO1 או Nedd8). תגים אלה מאפשרים טיהור של אוביקוויב ולכן של חלבונים אוביקווילביים מן התאים. הדבר נעשה באמצעות תהליך טיהור דו-שלבים: הראשון מבוצע בתנאים מסוימים תוך שימוש בתגית השישית, והשני בתנאים מקוריים המשתמשים בתג ' דגל '. זה מוביל לבידוד מאוד ספציפי וטהור של חלבונים שהשתנו אשר מזוהים לאחר מכן למחצה כימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ואחריו באמצעות ספקטרומטריה מאסיבית המסה (LC-MS/MS) טכנולוגיה. ניתוח לאינפורמטיקה קלה של נתוני MS באמצעות תוכנת Excel מאפשר הקמת פרופילי PTM על ידי ביטול אותות רקע. פרופילים אלה מושווים בין כל תנאי כדי לזהות שינויים ספציפיים אשר לאחר מכן ילמדו באופן ספציפי יותר, החל באימות שלהם על ידי טכניקות ביוכימיה סטנדרטית.

Introduction

השיטה המוצעת כאן מוקדש לחקר הגברת המתווכת על ידי בני משפחה אוביקוויב מתאי יונקים מתורבתים כדי לזהות שינויים פוטנציאליים הקשורים בתנאי ספציפי (טיפול, בידול, וכו '). פטין מייצג את השלב האחרון של רגולציה של החלבונים ' פונקציות¹. אכן, לאחר שיוצרו על ידי מכונות הטרנסלטיות, רוב אם לא כל החלבונים עוברים סוגים שונים של פטין כי לווסת את פעילותם, אינטראקציות מולקולריות, ו תאיים מיקום¹. בין שפע של לפטין הם אלה בתיווך על ידי משפחת אוביקוויב של חלבונים, אוביקוויב עצמו ואת כל אוביקוויב-אוהב, יש את הפוטנציאל לווסת את כל החלבונים תאיים או חלקי cytoplasmic². בגלל שהם עצמם חלבונים, הם יכולים להיות מצויידים אחד לשני, יצירת רשתות הומוגנית והטרוגנית של טופולוגיות שונות, כל אחד משויך פונקציות רגולטוריות ספציפיות². כלים נחוצים כדי לנסות לפענח ולהבין זה מכונות מורכבות. גישות רבות פותחו ברחבי העולם, בעלי יתרונות וחסרונות משלהם, וכאן אנו מציעים אחד עם ביצועים גבוהים המתאימים לתאים מתורבתים.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הדיוק שלה. אכן, הטוהר של חלבונים מבודדים שונה הוא משופר מאוד על ידי שימוש קומבינטורית של שני התגים (6his ודגל) ואת שני הליך ההליך ולכן זה הרבה יותר סלקטיבי מאשר תג אחד פיוז ' ן ו/ubl^3,4. הנוכחות של התגית 6His מאפשר צעד ראשון של טיהור במצב מלאה לחלוטין ובכך הימנעות כל שיתוף טיהור של חלבונים המכילים אוביקוויב כריכה האיגוד או מחייב חלבונים אחרים של הכריכה. זוהי בעיה טכנית נתקל מספר גישות אחרות המבוססות על טיהור אהדה של פרוטמס אובימבחנות באמצעות נוגדנים ספציפיים⁵ או מרכיבים כריכה אוביקוויב (צינוריות)⁶. חשוב מכך, טכניקה זו אינה מוטה לטובת טיהור של סוג מסוים של אוביקווינציה, כפי שהוא יכול להיות במקרה של גישות אחרות, שכן הן מונו והן סוגים שונים של polyubiquitinations זוהו⁷. כתוצאה מכך, לאחר שנמצא, שינוי של אוביקווינציה יהיה צריך ללמוד בפרטים נוספים על ידי גישות ביוכימיות סטנדרטיות כדי לזהות את הסוג המדויק של אוביקווינציה המעורבים.

לבסוף, יתרון טכני נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של וירוסים, כי בקלות ובמהירות יוצר ביטוי יציב קווי התא עם רמה סבירה של ביטויים של משנה מתויג מבלי להפריע התנהגות סלולרית נורמלית.

ואילו תפקיד חשוב אחד של אוביקווינציה היא למקד חלבונים עבור השפלה פרוטאספאל, ידוע כיום כי יש לו תכונות רגולטוריות רבות אחרות עבור חלבונים ביותר תאיים או באופן חלקי תאיים¹. מספר הפונקציות הללו מוגבר עוד יותר על-ידי קיומם של אוביקווינים רבים כמו חלבונים, ויוצרים משפחה של חלבונים המסדירים כמעט כל מנגנוני תא¹. שינויים שלהם יכול להיות השפעה דרסטית על ביולוגיה התא יכול להוביל או להשתתף במצבים פתולוגיים⁸, כגון סרטן⁹. מכאן, כלים נחוצים כדי לחקור את הנוף העצום הזה ולזהות את השינויים הקשורים במצב פתולוגי שיכול לשמש כמטרות טיפוליות מספר.

פרוטוקול זה מוקדש תאים בתרבות מאז הם צריכים להיות מתותמרים כדי לבטא אקסוגני מתויג ועוד/Ubl. לאחר שנוצר, אלה קווי תא יציבה ניתן להשתמש כדי ליצור פרופילים Ubl מהתרבות ב 2D או 3D או שתלי xenografts ובכך להאריך את האופק של מודלים ניסיוניים שונים, כי ניתן להחיל על לימוד לימודי פרופילים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הדור של קווי תאים יציבים המבטא 6His-דגל-Ubl

הערה: שיתוף משותף של תאים HEK-293T עם pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ו דלתא עוזר.

1. יום 0: התאים 293T הזרע בצלחת 6-הבאר כדי להשיג 50-70% המפגש היום אחרי.
2. יום 1: שיתוף 50-70% תאים confluent עם שילוב של 1 μg של pCCL-6HF-Ubl או pCCL-GFP, 1 μg של pVSVG ו-1 μg של דלתא-עוזר וקטורים, באמצעות מגיב העברה ופרוטוקול עבור ייצור וירוס. לאחר 6 שעות של העברה, לשנות את המדיום לאחד טרי המתאים לתאים להיות התמרה. הזרע את התאים להיות מותמרים ב 6 צלחת הבאר כדי לקבל 10-20% המפגש היום לאחר (היום של התחלת התמרה).
3. יום 2:24 h לאחר החצייה, לשחזר את המדיום המכיל חלקיקים לסנן ומסננים באמצעות 0.45 יקרומטר מסננים. במקרה הצורך, הוסיפו מדיום טרי בנקודה זו כדי ליצור קבוצה נוספת של הווירוסים. החלף את מדיום התאים שיש לסנן (10-20% זרימה) על-ידי האחד המכיל את הווירוסים.
   הערה: המדיום האנטי-ויראלי ניתן לשמור ב-+ 4 ° c למשך מספר ימים לפני התמרה או מאוחסנת ב-80 ° c במשך חודשים.
4. דגירה את התאים עם הווירוסים בין 24 h כדי 72 h באינקובטור רגיל (37 ° צ', 5% CO₂), ולאחר מכן לשנות את המדיום עבור תקן טרי אחד. במידת האפשר, בדוק את הביטוי GFP בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט הפוך כדי להעריך את יעילות התמרה: אחוז הביטוי של תאים ורמת ביטוי יחסית לכל תא. אם לא מזוהה זריחה, המתן ל2-3 ימים נוספים כביטוי עשוי להימשך זמן רב יותר בהתאם לסוג התאים שיש להתמרה.
5. אם שליטה GFP הוא חיובי, לגדל את כל התאים עד שיהיה מספיק כדי לבצע שליטה ביטוי של 6HF-Ubl על ידי מimmunofluorescence כתמי המערבי באמצעות נוגדן נגד הדגל.

2. טיהור כפול של חלבונים ששונו

הערה: מאגר 1:6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂hpo₄/נה₂PO₄, pH 8.0, 0.5% טריטון X-100.
מאגר 2:50 mM נה₂הפו₄, 150 מ"מ הנאל, 1% Tween20, 5% גליצרול, pH 8.0.
מאגר 3:100 mM NH₄hco₃, pH 8.0.

1. פירוק התא: לאחר מוכן, לשטוף מנות התרבות לפחות פעם אחת עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר (RT) ולהמשיך לפירוק תאים או, לחילופין, הקפאת פלאש בנוזל N₂ ולאחסן ב-80 ° c. לפירוק, להוסיף 2 מ ל של מאגר 1 לכל 15 ס מ צלחת ב RT. השתמש במגרד התא כדי לשחזר את כל lysates ב 50 mL צנטריפוגה צינורות (הכרך הסופי על 20 מ ל).
2. Sonicate lysates שלוש פעמים עבור 30 s מופרדים על ידי 1 דקות הפסקה.
3. צנטריפוגה את sonicated lysates ב 15,000 x g עבור 15 דקות.
4. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש באמצעות מסננת תאים (40 μm).
5. קביעת הריכוז של דגימות והתאמה, במידת הצורך, כדי להשיג את אותה כמות של חלבונים וכלי אותו נפח. השתמש כמות כוללת של חלבון בין 50 ו 100 mg (10 מנות עם קוטר 15 ס מ עבור מיאפאקה -2 תאים).
6. הוסף Ni^{2 +}-נ. ת. ע חרוזים, באמצעות 2 μl של חרוזים ל 1 מ"ג של חלבון.
7. לסובב ב 30 סל ד במהלך 2.5 h ב RT.
8. גלולה את החרוזים ב 500 x g עבור 5 דקות.
9. לשטוף את החרוזים עם 1 מ ל של מאגר 1, העברת דגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, ואז להעביר את הצינורות על הקרח. בצע את כל השלבים הבאים בקרח או ב -4 ° c.
10. שטוף פעמיים עם 1 מ ל של מאגר קר קרח 2 המכיל 10 מילימטר.
11. כדי להוסיף חלבונים כבולים, הוסף 600 μL של מאגר 2 המכיל 250 מילימטר ומסתובב עבור 2 h ב 4 ° c.
12. גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 1 דקות. להעביר את supernatants לחדש, טרום מקורר, 1.5 מנורות mL ולהוסיף 50 μl של אנטי דגל M2 הנוגדן חרוזים מצוקדים.
13. לסובב ב 30 סל ד עבור 2.5 h ב 4 ° c, ולאחר מכן לשטוף 2 פעמים עם 500 μL של מאגר 2, אז 2 פעמים עם 500 μL של מאגר 3.
14. עבור האחרון להתחמק, להוסיף 100 μL של מאגר 3 המכיל פפטיד דגל ב 0.1 μg/μL ולסובב ב 4 ° צ' עבור 1.5 h.
15. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 1 דקות ולהעביר את סופרנטנים כדי צינורות חדשים מקורר מראש.
16. קח 10% (10 μL) כדי לטעון על SDS-PAGE ולבצע כתמים כסף של ג'ל כדי לשלוט על איכות הטיהור. אם טיהור נראה טוב, לנתח את 90% משמאל LC-MS/MS.

3. עיבוד נתונים בספקטרומטר מסה כדי ליצור פרופילים של מערכות מידע וכד לזיהוי הבדלים משמעותיים ביניהם

הערה: תוצאות מניתוח MS מכילות מידע רב כולל את המספר הכולל של פפטידים, כמו גם את ערכי אזור השיא (ממוצע של ראש 3 פפטיד אזור¹⁰) עבור כל חלבון מזוהה בכל דגימות. ניתן לעבד נתונים אלה באמצעות מספרי ספירת הפפטיד או ערכי אזור השיא, או שניהם. עבור חישוב עם אזורי שיא, מכיוון שערכים אלה נמצאים בדרך כלל בטווח של 10⁶, יש צורך לחלק אותם לפי סדר זה לפני החלת נוסחאות זהות להלן. התוצאות שהתקבלו עם שתי מתודולוגיות של ספירה צריך להראות מתאם חזק כפי שהוא בדרך כלל. עבור כל חלבון מזוהה, השתמש בנוסחאות הבאות כאשר:
בדיקת פפטידים v1 במדגם שאינו מטופל (g., ועוד-סם)
v2 ערכי פפטידים ב Gemcitabine התייחסו למדגם אוביקוויב (למשל, ועוד תרופה)
k1 מערכי פפטידים בבקרה שאינה מטופלת gfp (למשל, gfp-תרופה)
k2 ערכי פפטידים ב Gemcitabine שליטה במדגם gfp (g., gfp + תרופה).

1. נורמליזציה: נרמול ערכים בין תאים המתייחסים לתרופות לתאים שאינם מטופלים עבור אוביקוויב ו-GFP באמצעות הנוסחאות הבאות. V = V מנורמל ומנורמל k = K.
   V1 = v1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1); V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = K1. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k1); K2 = k2. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k2)
2. הסרת רקע: שימוש בנוסחאות הבאות, להחסיר ערכים במדגם שליטה (GFP) מהערכים במדגם אוביקוויב להשיג ערכים ספציפיים (V ' 1 ו-V ' 2) עבור כל חלבון מזוהה בשני התנאים.
   V ' 1 = V1-K1 אם V1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 אם V1-K1 < 0
   V ' 2 = V2-K2 אם V2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 אם V2-K2 < 0
3. וריאציה (Var) של אוביקווינציה. כדי לקבל ציון (בין-100 + 100) עבור וריאציות חיוביות ושליליות של פטין הנגרמת על ידי תרופה, השתמש בנוסחה הבאה שבה ההפרש בין ערכים ספציפיים של דגימות מטופלים ולא מטופלים מחולקים לפי הסכום של כל הערכים, כולל אלה ב שליטה (כדי להפוך חלבונים מזוהים גם בקרת GFP), ולהתרבות על ידי 100.
   Var = (ו-2-V ' 1)/(V1 + K1 + V2 + K2) * 100; -100 < Var < 100;
   וריאציות להלן-50 (דיכוי PTM) או מעל 50 (אינדוקציה PTM) נחשבים בדרך כלל משמעותיים.
4. ביטחון (Conf). השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבל ערך ביטחון בין 0 ל-100%,:
   Conf = (V1 + V2)²/(1 + V1 + V2 + K1 + K2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 אם < 0
   ערכים מעל 50 נחשבים בדרך כלל להיות בטוחים.
5. כדי לקבל התפלגות נחמדה יותר של ערכי אינדוקציה/דיכוי ולשקול הן וריאציה ופרמטרים ביטחון, להכפיל את ערכי Var ו- Conf באמצעות הנוסחה הבאה שבה V Var ו-C Conf
   = SI (V2 > 0;((V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   הערה: ככל שערכי אזור השיא בדרך כלל מדויקים יותר מספירת פפטיד, ניתן להשתמש בתוכנה ספציפית המוקדשת לפרשנות של נתונים מסוג זה, כגון פרסאוס (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), בעקבות המלצות לשימוש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התמרה של תאי היונקים התרבותיים ליצירת תאים מבוססי GFP ו-6HF.
כדי לייצר וירוסים שישמשו מאוחר יותר כדי לשנות את MiaPaCa-2 תאים, 70% confluent HEK-293T תאים הם שיתוף עם כמות שווה של שלושה וקטורים, pCCL-6HF-אוביקוויב או GFP/דלתא-עוזר/pvSvG. לאחר 24 שעות של ייצור, המדיום המכיל חלקיקי הנגיף הוא ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פיתחנו מתודולוגיה חזקה ואמינה כדי ליצור פרופילים של חלבונים ששונו על ידי בני המשפחה אוביקוויב הראשי. אכן, יש לנו הוחל בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור פרופילים של לפטין על ידי אוביקוויב, וגם על ידי סומו ו Nedd8, כדי לזהות שינויים הקשורים לטיפול⁷, בתגובה על הביטוי או הסתרה של גן מסוים (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag