רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

Summary

Decellularized מטריקס מסחטות (dECM) יכול לספק רמזים מיקרו סביבתי מתאים כדי ללכוד את הפונקציות הטמונות של רקמות היעד במבנה מהונדס. מאמר זה מהבהיר את הפרוטוקולים עבור decellularization של רקמת הלבלב, הערכה של רקמת הלבלב הנגזרת dECM ביודיו, והדור של בנייה רקמת הלבלב 3D באמצעות טכניקת ביוריטינג.

Abstract

השתלת איונים הלבלב הוא טיפול מבטיח עבור חולים הסובלים מסוכרת סוג 1 מלווה על ידי היפוגליקמיה וסיבוכים משניים. עם זאת, השתלת איון עדיין יש מספר מגבלות כגון הכדאיות הנמוכה של איונים מושתלים בשל מעבר איון העניים בסביבות עוינות. בנוסף, את האינסולין לייצר תאים הבדיל מתאי גזע האדם בעלי עוצמה גבוהה יש יכולת מוגבלת להפריש הורמונים מספיקים שיכולים לווסת את רמת הגלוקוז בדם; לכן, לשפר את ההבשלה על ידי תאים culturing עם רמזים מיקרוסביבתיים הנכון נדרש מאוד. במאמר זה, אנו להבהיר פרוטוקולים התאריך להכנת רקמת הלבלב נגזר decellularized מטריקס מטריצה (pdECM) bioink לספק מיקרוסביבה מועילה כי יכול להגביר את רגישות הגלוקוז של איולי הלבלב, ואחריו תיאור את התהליכים ליצירת בונה רקמת הלבלב תלת-ממד באמצעות טכניקת ביוטריטינג מיקרוסטרומה.

Introduction

לאחרונה, השתלת איון הלבלב נחשב טיפול מבטיח עבור חולים עם סוכרת מסוג 1. הבטיחות היחסית והפלישה המינימלית של ההליך הם היתרונות הגדולים של טיפול זה¹. עם זאת, יש לו מספר מגבלות כגון שיעור ההצלחה הנמוכה של בידוד איונים ותופעות לוואי של תרופות מדכאים חיסוני. יתר על כן, מספר האיים מנופה מקטין בהתמדה לאחר ההשתלה בשל הסביבה העוינת². חומרים ביולוגיים שונים כגון alginate, קולגן, פולי (לקטית-co-חומצה גליקולית) (PLGA) או פוליאתילן גליקול (יתד) הוחלו על השתלת איון הלבלב כדי להתגבר על הקשיים האלה.

3D טכנולוגיית הדפסה של התא מתגלה הנדסת רקמות בשל הפוטנציאל הגדול שלה ביצועים גבוהים. למותר לציין, ביודיו ידועים כרכיבים חשובים למתן סביבת מיקרו מתאימה ולאפשר שיפור של תהליכים סלולאריים במבנה רקמות מודפסות. מספר משמעותי של הידרולים דליל, כגון פיברומין, alginate, ו קולגן נמצאים בשימוש נרחב כמו ביודיו. עם זאת, חומרים אלה מראים חוסר של מבנה, כימי, ביולוגי, ומורכבות מכנית לעומת מטריצה החילוץ (ECM) ברקמות יליד³. רמזים מיקרוסביבתיים כגון האינטראקציות בין איונים ו-ECM הם אותות חשובים לשיפור הפונקציה של איונים. Decellularized ECM (dECM) יכולה ליצור מחדש את ההרכב הספציפי לרקמה של רכיבי ECM שונים, כולל קולגן, גליקוזנוגליקנים (מבוים) וגליקורופנס. לדוגמה, איונים ראשוניים ששומרים על ECMs ההיקפית שלהם (למשל, סוג I, III, IV, V, ו-VI השישי, למינציה, ו fibronectin) מוצג ואפופטוזיס נמוך ורגישות אינסולין טובה יותר, ובכך לציין כי^הרקמותהספציפיות מטריקס האינטראקציה הם חשובים לשיפור היכולת שלהם לתפקד באופן

במאמר זה, אנו להבהיר פרוטוקולים תאריך להכנת רקמת הלבלב נגזר decellularized מטריקס מטריצה (pdECM) bioink כדי לספק רמזים מיקרוסביבתיים מועילים עבור האצת הפעילות ופונקציות של איונים הלבלב, ואחריו את התהליכים ליצירת בונה רקמת הלבלב 3D באמצעות טכניקה מיקרוהבלטה מבוססי ביופסיה (איור 1).

Protocol

רקמות הלבלב של פורצין נאספו מבית מטבחיים מקומי. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מרכז רפואי, סאול, קוריאה.

1. decellularization רקמה

1. הכינו את הפתרונות לdecellularization.
   הערה: 1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) המשמש בכל ההכנות הפתרון הוא מדולל על ידי הוספת מים מזוקקים כדי 10x PBS.
   1. עבור 1% טריטון-X 100 פתרון, לפזר 100 mL של 100% טריטון-X 100 הפתרון ב 900 mL של 1x PBS באמצעות מגנטי מעורר בר עם ערבוב ב-150 סל ד עבור 6 h. לעשות 400 mL של 1% טריטון-X 100 פתרון עם 40 mL של 10% טריטון-X 100 פתרון ו 360 mL של 1x PBS הכינה ממש לפני השימוש.
      הערה: הפתרון של 10% טריטון-X 100 יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר עד לצורך.
   2. עבור 0.1% החומצה מפרכאצטט הפתרון, לדלל 8.5 mL של 4.7% הפרג חומצה לתוך 22.8 mL של 70% אתנול עם 368.7 mL של מים מזוקקים ממש לפני השימוש.
2. להסיר את הרקמות ההיקפית של הלבלב ולחתוך את הרקמה לפני decellularization.
   1. לשטוף את הלבלב חזירי מחדש עם הפעלת מי ברז ולהסיר את הרקמות ההיקפית באמצעות מספריים מעוקר.
   2. להעביר את הלבלב לתוך שקית ניילון עם מלקחיים להקפיא ב-80 ° צ' עבור 1 h כדי לעזור לחתוך את הלבלב ביעילות לשלב הבא.
   3. פורסים את הלבלב הקפוא לחתיכות בעובי 1 מ"מ באמצעות פומפייה.
   4. העברת 50 גרם של הרקמה הפרוסה לתוך מכולה פלסטיק 500 mL.
      הערה: מיכל פלסטיק עם מכסה מומלץ כאן כדי להגן על רקמות מפני זיהום ולמנוע אידוי פתרון.
3. טיפול עם ריאגנטים.
   הערה: התהליך הdecellularization כולו צריך להתבצע ב -4 ° c על שייקר מסלולית דיגיטלי ב 150 סל ד. בכל השלבים decellularization, ניתוק פיזי באמצעות מלקחיים נדרש כדי למנוע את פרוסות של הלבלב מדבק יחד. לשטוף את המיכל עם מים מזוקקים הוא הכרחי כדי להסיר את שרידי ריאגנטים לחלוטין במיכל.
   1. לפני כל טיפול מגיב, לשטוף 50 g של לבלב פרוס עם 300 mL של מים מזוקקים באמצעות שייקר.
   2. מערבבים את הרקמה ברציפות ב-150 סל ד עד שהמים העכורים נעלמים (לאחר כ -12 שעות). להחליף את המים מזוקקים כל 2 שעות.
      הערה: שינוי המים המזוקקת מדי שעה מומלץ ליעילות להסרת המים העכורים מהר יותר.
   3. להיפטר המים ולטפל 50 g של רקמות עם 400 mL של 1% טריטון-X 100 בפתרון PBS 1x עבור 84 h. רענן את הפתרון כל 12 h.
      הערה: בשלב זה, כמות הרקמה תפחית משום שהרכיבים הסלולריים מתחילים להיות מוסרים.
   4. לטפל עם 400 mL של איזופנול (IPA) עבור 2 h כדי להסיר את השומן שנותר מן הלבלב.
      הערה: זה נורמלי הרקמה להיות קשה עקב הסרת שומן בתהליך זה.
   5. לאחר 2 h, להסיר את IPA ולשטוף את הרקמה עם 400 mL של 1x PBS עבור 24 שעות. לרענן את ה-PBS 1x כל 12 h.
   6. כדי לחטא את רקמת decellularized, למחוק את הפתרון הקודם ולטפל עם 400 mL של 0.1% חומצה peracetic ב 4% אתנול עבור 2 h.
   7. כדי להסיר כביסה שיורית, לשטוף את הרקמה עם 400 mL של 1x PBS עבור 6 h. רענן את הפתרון כל 2 h.
   8. לאסוף את רקמות decellularized ב שפופרת חרוט 50 mL עם מלקחיים.
   9. הקפא את המדגם ב-80 ° c עבור 1 h. כסו את צינורית החרוט בעזרת מחיקה נטולת-מוך במקום מכסה המכסה והתקן עם גומייה לליאופליזציה היעילה.
   10. ליאופליז הרקמה הdecellularized ב-50 ° c עבור 4 ד.
       הערה: עבור שלב 1.3, 1 גרם של רקמות שאינן decellularized צריך גם להקפיא מיובשים תחת אותם תנאים.

2. הערכת רקמות decellularized

הערה: כדי להעריך את כמות השאריות של dsDNA, גליקוזאמינוגליקנים (בדיחות), ו קולגן ברקמת decellularized לעומת רקמת יליד, לפחות 1 g של כל אחת הרקמה הלא decellularized (רקמות יליד) ו decellularized רקמות נדרשות עבור אחד הערכה. הכמות של dsDNA, בדיחות, ו קולגן ניתן לחשב בהתבסס על המשקל היבש של הרקמה.

1. הכינו את הפתרונות לספר הביוכימי.
   1. להכין פתרון פפאין לעיכול לדוגמה.
      הערה: ניתן לכוונן את כמות המאגר להתאמה בהתאם למספר הדגימות.
      1. התמוססות 119 מ"ג של 0.1 M נתרן פוספט (חד-בסיסי), 18.6 mg של 0.5 mM Na2-EDTA, ו 8.8 mg של 5 מ"מ cysteine-HCl ב 10 מ ל של מים אוטוקלבים.
      2. להתאים את ה-pH של הפתרון כדי 6.5 על ידי הוספת 10 מ NaOH פתרון.
      3. הוסף 125 μl של 10 מ"ג/mL פפאין פתרון מניות לפתרון לעיל מערבולת, המאפשר לכל אלמנט לערבב באופן שווה.
   2. הכינו פתרונות למתילן כחול דימתיל (DMMB).
      1. כדי להפוך את הצבע DMMB, לפזר 8 מ"ג של 1, 9-diמתיל-מתילן כחול אבץ כלוריד מלח כפול, 1.52 g של גליצין, ו 1.185 g של הנאל ב 500 mL של מים אוטוקלבים. להתאים את ה-pH כדי 3 על ידי הוספת 0.5 M הפתרון HCl תוך מדידת השינוי של ה-pH באמצעות מד pH העליון הספסל. אז, לסנן את זה באמצעות מסנן ואקום העליון 500 mL.
      2. להפוך 15 μL של 10 מ"ג/mL כונדרויטין סולפט פתרון סטנדרטי.
   3. הכינו פתרונות לשיטת הידרוקסיפרוקו.
      1. עבור פתרון עבודה כלוראמין, לפזר 2.4 גרם של סודיום אצטט, 1 גרם של חומצת לימון, ו 0.68 g של נתרן הידרוקסיד 24 מ ל של מים מזוקקים ולהוסיף 240 μL של חומצה אצטית קרחוני, 10 μL של toluene, ו 6 מ ל IPA.
         הערה: לפזר את כל אבקות בתמיסה באמצעות מערבל מערבולת. ניתן לאחסן את פתרון העבודה כלוראמין ב-4 ° צ' עד שלושה חודשים.
      2. עבור תמיסת כלורמין T, לפזר 0.35 g של כלורמין T ב 20 מ ל של פתרון עובד כלוראמין ולהוסיף 2.5 mL של IPA. מערבולת לערבב את כל הרכיבים.
         הערה: התכונן מיד לפני השימוש.
      3. עבור הפתרון P-perchloric, לשים 3.75 g של P-לתוך 6.5 mL של חומצה 15 מ ל של IPA; עטוף אותו ברדיד אלומיניום.
         הערה: התכונן מיד לפני השימוש.
2. הוסף 1 מ ל של פתרון פפאין ל 10 מ"ג של רקמת ליאופ, ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ו מערבולת הצינור כדי לעכל טוב יותר את המדגם.
3. מניחים את שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL במתלה גומי ומעכלים את הדגימות בגביע משנת 500 mL המכיל 300 mL של מים בשעה 60 ° c עבור 16 h.
4. צנטריפוגה ב 9,500 x g עבור 20 דקות, לאסוף את supernatant, ולהעביר אותו צינור חדש.
5. לכמת את ה-DNA שיורית ואת החלבונים העיקריים ברקמת decellularized.
   1. טען 1 μL של דגימה מתעכלת לתוך ספקטרומטר ולמדוד את כמות dsDNA על פי הוראות היצרן.
      הערה: הניסויים צריכים לקשור את השיער לאחור ולחבוש מסכה כדי להימנע מזיהום המדגם.
6. בצע שיטת DMMB כדי לכמת את כמות הבדיחות שנשאר ברקמת decellularized.
   1. מערבבים 1 μL של כונדרויטין סולפט פתרון ו-499 μL של 1x PBS כדי ליצור סטנדרטים. דלל את כונדרויטין סולפט פתרון עם מים מזוקקים בריכוזים של 0, 4, 8, 12, 16, ו-20 μg/mL.
   2. טען מטריליטים של 50 μL של כל ריכוז של התקן ודגימות מתעכל לצלחת 96-באר.
   3. הוסף 200 μL של הצבע DMMB לכל טוב באמצעות הצינורות מרובת ערוצים.
   4. קרא מיד את ספיגת ב525 ננומטר על קורא מיקרולוח.
7. בצע שיטת הידרוקסיפרוקו כדי לכמת את כמות הקולגן.
   1. כדי לבצע שיטת הידרוקסיפרוקו, מ250 μL של מדגם מתעכל עם כמויות שוות של HCl ב 120 ° c עבור 16 h.
   2. יבש את השקעים בטמפרטורת החדר עבור 3 שעות כדי לצנן את הדגימות ולאחר מכן לפזר מחדש את דגימות 1 מ ל של 1x PBS.
   3. צנטריפוגה ב 2,400 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
   4. הכינו 100 μg/mL הידרוקסיקו פתרון כסטנדרט.
   5. לדלל פתרון הידרוקסיקו עם מים מזוקקים בריכוז של 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL עבור פתרון סטנדרטי.
   6. טען מטריליטים של 50 μL של דגימות ופתרון סטנדרטי לצלחת ברמה 96.
   7. הוסף 50 μL של הפתרון של כלורמין T ולאחר מכן דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. הוסף 50 μL של הפתרון p-לייט ו-דגירה עבור 30 דקות ב 60 ° c.
      הערה: הורדה בחדר חשוך. לאחר התוספת, לעטוף את הצלחת עם רדיד אלומיניום.
   9. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
   10. לאחר צינון, למדוד את ספיגת ב 540 ננומטר על קורא מיקרופלייט.

3. הכנה לביודיו

הערה: ניתן לאחסן אבקת pdECM באופן בלתי נשכח ב-80 ° c לפחות שנה אחת. לפני התאמת ה-pH, ניתן לאחסן את הפתרון pdECM מתעכל ב-20 ° צ' לחודש אחד. לפני השימוש, להפשיר את המדגם של פתרון pdECM קפוא ב 4 ° c לילה. ניתן לאחסן את פתרון ה-pH-מנוכי pdECM ב-4 ° צ' עד שבוע אחד. הפתרון pdECM מתעכל ניתן לאחסן ב 4 ° צ' לפחות כמה ימים, אבל לא צריך לחרוג 1 שבוע.

1. לעכל את ההקפאה מיובש pdECM עם pepsin.
   1. לצורך עיכול אפקטיבי של הביודיו, השתמשו בחנקן נוזלי באמצעות מרגמה ומכתש.
   2. לאסוף 200 מ ג של אבקת pdecm ב-50 ml חרוט ולהוסיף 20 מ"ג של פפסין ו 8.4 mL של חומצה אצטית 0.5 M (הריכוז הסופי הוא 2 w/v%).
   3. מניחים את בר המהומה המגנטי בצינור 50 mL ו מערבבים ב 300 rpm עבור 96 h.
2. כוונן את ה-pH של פתרון pdECM מתעכל.
   הערה: כדי למנוע התאמה לפני התאמת החומציות, תהליך זה צריך להתבצע על קרח.
   1. מסננים את החלקיקים לא מעוקרים בפתרון pdecm באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר באמצעות פיפטה הזחה חיובית על קרח כדי להשיג את העיכול האופטימלי של חלקים.
   2. הוסף 1 mL של PBS 10x ו מערבולת לפני השימוש NaOH.
   3. להתאים את ה-pH ל 7 עם 10 מ NaOH בדיקת ה-pH עם רצועות מחוון pH.
      הערה: מערבולת בכל פעם NaOH הוא הוסיף כך bioink מעורבב ביסודיות עם ריאגנטים אחרים.

4. אנליזה רטיולוגית

1. התקנה ניסויית
   1. הכן את 1.5% (w/v) של bioink pdECM כדי להעריך את המאפיינים rheological.
   2. להקים 20 מ"מ צלחת קונוס העדשה (קוטר חרוט של 20 מ"מ עם זווית 2 °) במצב מבוקרת קצב של rheometer.
   3. צור רצפים ניסיוניים בתוכנה המותקנת (שלישיות) כדי למדוד את הצמיגות, הקינטיקה הגלגנציה והמודוללי הדינאמי של הביודיו pdECM.
      1. צמיגות: מקום bioink pdECM על הצלחת. מדידת צמיגות מורכבת (Pa · s) של ביודיו pdECM תחת קצב הטיה גדל מ 1 עד 1,000 s^-1 בטמפרטורה קבועה של 15 ° c.
      2. הגלציה קינטיקה: מניחים את הביודיו pdECM על הצלחת. חישוב מודולוס המורכב (G *) על ידי מדידת האחסון וההפסד של מודול ה-pdECM bioink ב 4-37 ° c עם קצב עלייה מצטבר של 5 ° צ'/מינימום (מצב לטאטא זמן).
      3. מודול דינמי: מניחים את ביודיו pdECM על הצלחת ב 37 ° c עבור 60 דקות לפני המדידה. למדוד את מודול האחסון תלוי התדר (G ') ואת מודול הפסד (G ') של bioink pdECM בטווח של 0.1-100 rad/s ב 2% המתח.

5.3D הדפסה תא של מבנים רקמת הלבלב באמצעות איון

1. הכנת איונים מבודדים
   1. בודד איונים ראשוניים מחולדה בהתאם לפרוטוקולים המתוארים בעבודה קודמת⁵.
   2. כדי להפריד הריסות ותאים מתים מן איון מבודד, לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר. איונים עם קוטר קטן יותר מ-70 יקרומטר נחשבים מתים או חריגים.
   3. להשעות את איונים מבודדים ב RPMI-1640 בינוני ולמקם אותם על צלחת פטרי. הסרת איונים גדולים יותר מ-300 יקרומטר בקוטר באמצעות P200 volume מתחת למיקרוסקופ (4x המטרה עדשה) בארון אבטחה טיחות.
2. עטיפת איון לתוך הביודיו של pdECM
   1. הכנת ה-pH המותאם הביודיו pdECM ו איון מבודד.
      הערה: כדי למנוע הגברה לפני התאמת ה-pH, יש לבצע תהליך זה על הקרח.
   2. בעדינות לערבב את הביודיו pdECM ואת התקשורת הושעו עם איונים (יחס 3:1) באמצעות פיפטה העקירה חיובי עד אחיד מעורב.
      הערה: הריכוז הסופי של הביודיו pdECM הוא 1.5% וצפיפות התא בביודיו pdECM היא 3,000 IEQ/mL.
3. 3D הדפסה תא של מבנים רקמת הלבלב
   1. להכין מזרק עקר ו -22 גרם זרבובית.
      הערה: מד זה נבחר עבור הדפסת איונים עם קוטר של 100-250 μm.
   2. טען הביודיו של איון-לאדן pdECM לתוך המזרק.
   3. הדפס את הbioink עם תנאי ההדפסה הממוטב (קצב הזנה: 150 מ"מ/min; לחץ פניאומטי: 15 kPa) ב -18 ° c בצורת סריג.
   4. כדי להצליב את הביו-דיו, הציבו את המבנה המודפס בחממה למשך 30 דקות.
   5. לטבול את המבנה המודפס לתוך התקשורת התרבות איון אשר הוא RPMI-1640 בינוני עם 10% סרום עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין 100 U/mL סטרפטומיצין.

6.3D הדפסה תא של בניית הלבלב עם מבנה תבנית

1. הכנת שני סוגי הביודיו
   1. כדי לאמת את רב-תכליתיות ההדפסה באמצעות מספר ביודיו מרובים, הכינו שתי סדרות של ביודיו pdECM והכתים אותן על-ידי הוספת 0.4% טריפה כחול ורדים בנגלי לתוך כל ביודיו pdECM ביחס של 1:20, בהתאמה.
      הערה: כדי למנוע התאמה לפני התאמת pH, תהליך זה צריך להתבצע על קרח.
   2. בעדינות לערבב את הביודיו pdECM ואת התקשורת הושעו עם איונים (יחס 3:1) באמצעות פיפטה העקירה חיובי עד אחיד מעורב.
      הערה: הריכוז הסופי של הביודיו pdECM הוא 1.5% וצפיפות התא בביודיו pdECM היא 3,000 IEQ/mL.
2. הדפסת תא תלת-ממד של מבנים מבוססי מרובת חומרים ברקמת הלבלב
   1. להכין מזרקים מעוקר ו 25 גרם זרבובית.
   2. לטעון כל bioink (כחול ואדום) לשני מזרקים שונים, בהתאמה.
   3. הדפס את הביודיו עם תנאי הדפסה ממוטבים (קצב הזנה: 150 מ"מ/min; לחץ פניאומטי: 15 מעלות במהירות 18 ° c בצורת סריג עם קווים מתחלפים של כחול ואדום.
   4. כדי להצליב את הביו-דיו, הציבו את המבנה המודפס בחממה למשך 30 דקות.
   5. לטבול את המבנה המודפס לתוך התקשורת התרבות איון אשר הוא RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% סרום בפרה העובר (FBS), 100 U/mL פניצילין 100 U/mL סטרפטומיצין.

תוצאות

Decellularization של רקמות הלבלב
פיתחנו את התהליך עבור הכנת הביודיו pdECM כדי לספק הלבלב מיקרוסביבות ספציפיות לרקמות לשיפור הפונקציונליות של איונים במבנה רקמות 3D ביוריטד (איור 2א). לאחר התהליך decellularization, 97.3% של dsDNA הוסר והנציג רכיבי ECM כגון קולגן ו...

Discussion

פרוטוקול זה תיאר את ההתפתחות של הביודיו pdECM והייצור של מבנים רקמת הלבלב 3D באמצעות שימוש בטכניקות הדפסה תא תלת-ממד. כדי לבנות מראש את המיקרו-סביבה של רקמת המטרה במבנה הרקמה מהונדסים תלת-ממד, הבחירה של bioink היא קריטית. במחקר הקודם, אנו מאומת כי הרקמה הספציפית ביודיו dECM מועילים לקדם בידול תא גזע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinets	CRYSTE	PURICUBE 1200
Deep Freezer	Thermo Scientific Forma	957
Digital orbital shaker	DAIHAN Scientific	DH.WSO04010
Dry oven	DAIHAN Scientific	WON-155
Freeze dryer	LABCONCO	7670540
Fridge	SANSUNG	CRFD-1141
Grater	ABM	1415605793
Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Microcentrifuge	CRYSTE	PURISPIN 17R
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan GO
Mini centrifuge	DAIHAN Scientific	CF-5
Multi-Hotplate Stirrers	DAIHAN Scientific	SMHS-6
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE-PR
pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	STARA2110
Rheometer	TA Instrument	Discovery HR-2
Vortex Mixer	DAIHAN Scientific	VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors	Hirose	HC.13-122
Forcep	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 ml glass vial	Scilab	SL.VI1243
40 µm cell strainer	Falcon	352340
5 L beaker	Dong Sung Science	SDS 2400
50 mL cornical tube	Falcon	352070
500 mL beaker	Korea Ace Scientific	KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter	Corning	431118
500 mL plastic container	LOCK&LOCK	INL301
96well plate	Falcon	353072
Aluminum foil	DAEKYO
Kimwipe	Kimtech
Magnetic bar	Korea Ace Scientific	BA.37110-0003
Mortar and pestle	DAIHAN Scientific	SC.MG100
Multi-channel pipettor	Eppendorf	4982000314
Petri Dish	SPL	10100
pH indicator strips	Sigma-Aldrich	1095350001
Sieve filter mesh	DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs	Hyclone	SH30258.01
4.7% Peracetic acid	Omegafarm
70% ethanol	SAMCHUN CHEMICALS	E0220 SAM
Distilled water
IPA	SAMCHUN CHEMICALS	samchun I0348
Triton-X 100	Biosesang	T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
10 N NaOH	Biosesang	S2018
Chloramine T	Sigma-Aldrich	857319
Chondroitin sulfate A	Sigma-Aldrich	C4384
Citric acid	Supelco	46933
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Glacial acetic acid	Merok	100063
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Na2-EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	SAMCHUN CHEMICALS	S2097
Papain	Sigma-Aldrich	p4762
P-DAB	Sigma-Aldrich	D2004
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S5636
Sodium hydroxide	Supelco	SX0607N
Sodium phosphate(monobasic)	Sigma-Aldrich	RDD007
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
Bioink
Charicterized FBS	Hyclone	SH30084.03
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7215
Rose bengal	Sigma-Aldrich	198250
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154