תאים כליליים ובסמנים מסיסים בפרוגנוזה לב וכלי דם לאחר אנגיופלסטיקה כלילית

Summary

פיתוח של אירועים משמעותיים וכלי דם לוואי, אשר השפעה פרוגנוזה לב וכלי דם לאחר הניתוח אנגיוקולרי, מושפעים במידה של נזק כלילית ותיקון כלי דם. השימוש בסמנים מסיסים בעלי כלילית תאית ומסיס, מגיב לנזק ולתיקון כלי דם, שימושיים לניבוי התפתחות של MACEs ופרוגנוזה.

Abstract

מייג אירועים שליליים לב וכלי דם (MACEs) השפעה שלילית על הפרוגנוזה לב וכלי דם של חולים שעברו אנגיופלסטיקה כלילית עקב פציעה איסכמי כלילית. היקף הנזק הכלילי ומנגנוני תיקון כלי הדם הם גורמים המשפיעים על התפתחות עתידית של MACEs. תכונות כלי דם פנימיים כמו מאפייני הפלאק ומורכבות עורק כלילית הפגינו מידע התחזיות של MACEs. עם זאת, השימוש בסמנים מחזורי במחזור תאיים כבר היסוד כשיטה נוחה לזיהוי מוקדם הפרוגנוזה של MACEs, כפי שהם יותר קרוב לשקף מנגנונים דינאמיים מעורבים נזק כלילית ותיקון. קביעת כלילית מחזורי הסמנים במהלך הניתוח אנגיופלסטיקה, כגון מספר אוכלוסיות משנה של בתאי מחולל קדמון (MPCs), כמו גם ריכוז של מולקולות מסיסים המשקף דלקת, הדבקה תא, ותיקון, מאפשר הערכה של ההתפתחויות בעתיד ואת הפרוגנוזה של MACEs 6 חודשים לאחר הניתוח אנגיופלסטיקה. שיטה זו מודגשת על ידי הטבע הטרנסג שלה וביצועים טובים יותר מאשר דם היקפי מחזורי ביואריטים לגבי חיזוי של MACEs ואת השפעתו על פרוגנוזה לב וכלי דם, אשר ניתן להחיל על ריבוד סיכון של חולים עם מחלת עורקים בעורק כלילי.

Introduction

אנגיופלסטיקה כלילית והסטטינג מייצגים הליך הצלה עבור חולים עם מחלת עורקים כלילית (CAD). עם זאת, אירועים משמעותיים וכלי דם שליליים (MACEs), כולל מוות לב וכלי דם, אוטם שריר הלב, היצרות מחדש כלילית, ופרקים של אי ספיקת לב או חוסר התאמה, עלול להתרחש חודשים לאחר התערבות כלילית, הצגת ביקורים לא מתוכננת לבית החולים. מק נפוצים ברחבי העולם והתמותה המורבית שלהם הוא גבוה¹.

פגיעה איסכמי כלילית גורמת התגובה כלי דם מוקדם מנגנונים מגיבים מעורבים הגיוס של mpcs בשל יכולת הבידול שלהם ו/או הפוטנציאל מגיב, כמו גם את הייצור של מולקולות מסיסים כמו מולקולות הדבקה התרבות (icams), מטריקס מטלומטיות (mmps), ומינים חמצן תגובתי, המשקף תא ה למרות התכונות הפנימיות כלי דם כמו מאפייני פלאק ומורכבות עורק כלילי שימשו כדי לנבא maces, מחקרים מסוימים הראו כי בסמנים הקשורים מנגנונים של פציעה ותיקון המתרחשים אנדותל כלילית יכול להיות מאוד שימושי לזיהוי מוקדם ופרוגנוזה של אירועי לב וכלי דם בחולים עם CAD נשלח לניתוח כלילית^2,

עניין מתמשך של הבנת המנגנונים בבסיס הפציעה CAD ותיקון יש מוטיבציה חוקרים לחקור בסמנים מחזורי במחזור תאיים, כי דגימה כלילית יותר משקף נזק כלי דם ותיקון⁶. עם זאת, אפיון של סמנים כליליים במחקרים אנושיים כבר נדיר^7,8,9. לכן, מטרת המחקר הנוכחי היה לתאר שיטה כדי לקבוע את הכמות של מחזורי כלילית MPCs ו מולקולות מסיסים, המשקף הן פגיעה בכלי הדם ותיקון, כדי להראות אם אלה בסמנים הקשורים MACEs ואת הפרוגנוזה הקלינית של מטופלים CAD שעברו כלילית אנגיופלסטיקה. שיטה זו מבוססת על שימוש בכלי דם הקשורים, מחזורי MPCs ו מולקולות מסיסים שהתקבלו על ידי מיקומים דגימה הקרובה ביותר לנזק כלי. זה עשוי גם להיות שימושי עבור מחקרים קליניים עבור איסכמיה הגפיים התחתונה, שבץ, דלקת כלי דם, פקקת ורידי, ופציעות אחרות הקשורות לפציעה ותיקון של נימי דם.

Protocol

פרוטוקול זה עונה על ההנחיות המוסדיים מוועדת האתיקה של המחקר האנושי.

1. אנגיוגרפיה כלילית, אולטרסאונד, ודגימת דם

1. בקשת מידע קליני ודמוגרפי בסיסי לפני התערבות כלילית. לאסוף את הנתונים של הפרט: גיל, סקס, מצב עישון הנוכחי, מדד מסת הגוף (BMI), לחץ דם גבוה, dyslipidemia, סוכרת, תרופות, ואת האינדיקציה הנוכחית אנגיוגרפיה כלילית.
2. השתמש בגישה מוקדית כלילית באמצעות צנתור לב. הליך זה צריך להתבצע תחת מדריך fluoroscopy בחדר הומודינמיקה על ידי קרדיולוגים מומחים.
   הערה: לזהות כלי קיבול הניתנים להערכה. עבור המחקר הנוכחי, כלי הערכה הוגדרו כעורקים עם סעיפים גדולים מ 1.5 מ"מ והיצרות לומן של יותר מ 50%.
3. לקדם את קטטר אולטרסאונד intravascular לאזור הריבית תמונות שיא. השתמש בתוכנה המתאימה כדי לאתר ולמדוד את אזור הלומיאל הקטן ביותר.
4. השתמש קטטר כלילית לאסוף 10 מ ל של דם מהמיקום הקרוב ביותר ללוח.
5. לאחר הפרשות המטופל, קבע הערכות רפואיות תקופתיות כדי לעקוב אחר נקודות הלימוד. אם אין אפשרות ליצור קשר טלפוני או שביקור אצל רופא מתעכב במשך יותר מ-2 חודשים, בקש מאדם מורשה (שתוכנן בעבר) לאמת את נקודות הקצה של המחקר.
   הערה: לשקול כל אחד מהבאים: 1) מוות לב וכלי דם, 2) אוטם שריר הלב החדש, 3) אנגינה לא יציבה הצגת ביקור רפואי לא מתוכנן בתוך 24 h, 4) סטנט היצרות מחדש כפי שמתואר על ידי אנגיוגרפיה כלילית, 5) פרקים של פירוק אי ספיקת לב הדורשת. טיפול רפואי

2. קביעת הוראות במחזור (איור 2)

1. . לעבד את הדם בטווח של 1 מתוך הקולקציה העברה 6 מ ל של הדם שנאסף עד 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו לדלל 1:1 (v/v) עם מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS), pH = 7.4.
2. הוסף 2 מ ל של צפיפות בינונית מעבר לשלוש שפופרות בדיקה. העבר בזהירות שלוש שוויון עוצמת הקול של דם מדולל לתוך כל צינור בדיקה המכיל את הצפיפות בינונית מעבר הצבע.
   הערה: נפח הגודל הכולל של צפיפות מעבר הצבע והדם המדולל אינו עולה על שלושה רבעים של הקיבולת המקסימלית של צינור הבדיקה.
3. צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 30 דקות. להעביר את הלהקה בממשק בין השכבות לתוך צינור חדש. הוסף 2 מ ל של PBS ו צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 6 דקות. . הגלולה תכיל את ה-MPCs
4. רחץ את הגלולה מספר פעמים. מריף את הפתרון הקודם ומחדש בעדינות את הגלולה התא ב-PBS טרי. עבור שוטפים הבאים, צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 2 דקות. חזור על התהליך 6x.
5. השהה מחדש את הגלולה. בעוד 1 מ ל של הערוץ מערבבים 20 μL של התא השעיה עם 0.4% טריפה כחול, מדולל 1:1 (v/v). למרוח טיפה על המוכציטוטומטר ולספור את התאים הבלתי מוכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
6. המשך לקביעת ההגדרה MPCs. תווית 5 מ ל זרימה cy, לנסות צינורות, סדרת מחלקים out 1 x 10⁶ תאים לכל צינור. הכינו את הנוגדנים המתאימים לסוג isotype. צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 6 דקות ולמחוק את הסופרנטאנט.
7. להוסיף את הנוגדן העיקרי מדולל ב 100 μL של פתרון דגירה של נוגדן המורכב של 1x PBS (pH = 7.4), 2 מ"מ חומצה ethylenediאצטט (EDTA), ו-0.05% בסרום של פרה (BSA). השעיה מחדש עבור 10 s ו-הדגירה עבור 20 דקות ב 4 ° c, מוגן באור. הפרוטוקול עשוי להיות מושהה בשלב זה על ידי תיקון לימפוציטים ב 4% פאראמפורמלדהיד ב-PBS ואחסון דגימות של עד 24 שעות ב 4 ° c.
   הערה: הריכוזים הסופיים של הנוגדנים העיקריים המשמשים בפרוטוקול הנוכחי היו CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 2 דקות ולהיפטר supernatant. השהה מחדש ב-500 μL של 1x PBS (pH = 7.4), 2 מ"מ EDTA.
9. ביצוע הניתוח cy, הזרימה. השתמש בנוגדנים בקרה שהותאמו לסוג isotype כדי להגדיר את צביעת הרקע. לאחר מכן, לבחור לימפוציטים להתפשט על העלילה FSC/התחתית, מנסה להוציא גרנולוציטים שיורית, הפסולת התאית, וחלקיקים אחרים, אשר ממוקמים בדרך כלל התחתון, שמאל מופץ בעלילה. התפלגות כזו נחשבת כ-100%.
10. השתמש בשער המכיל מספר גבוה של תאים עם משותף immunophenotype⁺ ו CD34⁺. עבור immunophenotypes כפולים חיוביים, השתמש בשער שמזהה בעבר CD45⁺, CD34⁺, עם תוספת של KDR (ווגfr-2)⁺, CD133⁺, או CD184⁺. זיהוי אוכלוסיות המשנה של MPC על-ידי סמני שטח התא הספציפיים שלהם. דווח כאחוז של אירועים מגודרת.
11. זיהוי אוכלוסיות המשנה הראשיות של MPCs. במחקר הנוכחי הסוגים העיקריים של immunophenotypes היו CD45⁺CD34⁺CD133⁺, CD45⁺CD34 +^{CD184+, CD45+}CD34⁺CD133^{+CD184 +}, CD45^{+ CD34+ kdr+, CD45+}CD34⁺kdr⁺CD133⁺, וCD45⁺CD34^{+ kdr+ CD184.}
    הערה: סמני פני השטח הנמצאים בשימוש היו CD45 (לימפוציטים), CD34 (אנדותל ו/או בתאי כלי דם), KDR (מסמן ממברנה של תאי האנדותל), CD133 (תאי מחולל שורש), ו CD184 (תאי גזע המטבטיים ותאי האנדותל).

3. קביעת ביואריטים מסיסים פלזמה

1. השתמש ביישום חיסוני מקושר אנזים (אליסה) כדי לקבוע את הריכוז של סיעם-1 ו-MMP-9 (איור 3, השורה העליונה).
   1. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 3,000 x g, טמפרטורת החדר עבור 5 דקות ולאסוף את הפלזמה.
   2. תייג את הסטנדרטים, הצינורות לדוגמה ושפופרות הבקרה. באמצעות כביסה 2x באמצעות מאגר הכביסה המסופק בערכת ה-דיאגנוסטיקה, ניתן להאביק את הבארות הצופות מראש בצלחת המערכת.
   3. העבר את הסטנדרטים, הדגימות והפקדים לבארות. חותם הדגירה ב 37 ° c עבור 90 דקות.
      הערה: אל תתנו לבארות להתייבש לחלוטין.
   4. למחוק את התוכן ולהוסיף את נוגדן זיהוי biotin. חותם הדגירה ב 37 ° c עבור 60 דקות.
   5. למחוק את התוכן ולשטוף 3x. חותם את הפלאק ואת הדגירה ברצף עם פתרון העבודה streptavidine ואחריו המצע טטרמתיבנזיל ב 37 ° c עבור 30 דקות, מוגן באור. שטוף את 3x בין incubations. כשהצבע מתפתח, הוסף את פתרון העצירה וקרא את ספיגת הצפיפות האופטית בקורא מיקרופלייט.
2. השתמש בקביעה מגנטית אימונוxing כדי לקבוע את הריכוז של נמק הגידול גורם אלפא (tnfα) ו אינטרלויקין 1 בטא (IL-1β) (איור 3, השורה התחתונה).
   1. תייג את הסטנדרטים, הצינורות לדוגמה ושפופרות הבקרה.
   2. . מערבולת החרוזים המגנטיים במשך 30 ס להעביר את ההשעיה חרוז לצינורות בגודל כראוי, ולאחר מכן לבארות בלוח השפורסינג הבסיס. מערבולות תקופתיות מונעת משקעים של החרוזים.
   3. הכנס באופן מאובטח את מכונת הכביסה המגנטית המוחזק ביד. לחכות 2 דקות על החרוזים להצטבר על החלק התחתון של כל טוב ובמהירות להפוך הן את היד החזיק מכונת כביסה ואת הצלחת הרכבה, על כיור או פסולת מכולה. זכור להשתמש ביד מחזיק מכונת כביסה מגנטית לשמור על חרוזים בתוך הבארות.
   4. הוסף 150 μL של לשטוף מאגר לתוך כל באר ולחכות 30 s כדי לאפשר את החרוזים להצטבר בתחתית. מחק את התוכן כמו בשלב 3.2.3. לאחר מכן, הוסף 25 μL של מאגר שיטת הקביעה האוניברסלית (המסופקת בערכה) ואחריו 25 μL של תקנים מוכנים, דגימות ופקדים.
   5. חותם את הצלחת ואת הדגירה לפחות 60 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד. לחילופין, הגנה מפני לילה ב -4 ° c, מוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד במידת האפשר.
   6. שטוף 2x על-ידי הוספת 150 μL של לשטוף את המאגר ולחכות 30 s. למחוק את התוכן על ידי הוספת מנקה החזיק יד מגנטי הלוח. המתן 2 דקות והיפוך על כיור או פסולת מכולה.
   7. דגירה ברצף עם 25 μL של תערובת נוגדן לזיהוי ואחריו 25 μL של פתרון streptavidin-PE בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות, אטום ומוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד. שטוף 2x בין incubations, כפי שמתואר בשלב 3.2.6.
   8. . השג את הקריאות הוסף 120 μL של מאגר קריאה. לאטום את הצלחת ואת הדגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד. הפעל את הקריאה על-ידי קורא שיטת מריבוב. כוונן את פרמטרי הקריאה בהתאם לאחד מהאנליטה.

תוצאות

כלילית, סינוס ורידי דם היקפי נאספו מ 52 חולים שעברו אנגיוגרפיה כלילית (איור 1) והראה שכיחות גבוהה של יתר לחץ דם, dyslipidemia. במהלך הטיפול הקליני, 11 (21.1%) MACEs התרחשה 6 חודשים לאחר אנגיוגרפיה כלילית: מוות (n = 1), אנגינה הדורשת נוכחות בבית החולים (n = 6), אוטם שריר הלב (n = 2), ו...

Discussion

איסוף הדם מעורק העורקים המושפע עלול להיות קשה. לפעמים, עורק העורק הראשי. בקושי נגיש במקרה זה, דגימת סינוס של הורידים עשויה להיות חלופה. בוצעו בדיקות אימות השוואת ביורים מחזורי הסמנים בעורק כלילי לעומת הסינוס ורידי, ללא הבדלים משמעותיים. עם זאת, הביצועים של מחזורי הסמנים הבין-מסתובבים אומתו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm