בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

Summary

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.

Abstract

שחרורו של מלכודות מסחטות (ETs) על ידי נויטרופילים זוהה כגורם תורם להתפתחות של מחלות הקשורות לדלקת כרונית. נויטרופילים מורכב מרשת של DNA, חלבונים היסטון, וחלבונים שונים של הגרניט (כלומר, myeloperoxidase, elastase, ו-צנתור G). תאים חיסוניים אחרים, כולל מקרופאגים, יכולים גם לייצר ETs; עם זאת, עד כמה זה קורה בvivo והאם מקרופאג מלכודות לחילוץ (מטס) לשחק תפקיד במנגנונים פתולוגיים לא נבדק בפרוטרוט. כדי להבין טוב יותר את התפקיד של גרורות בפתווגיות דלקתיות, פרוטוקול פותחה לצורך ויזואליזציה שחרור MET מקרופאגים האנושי העיקרי בתוך מבחנה, אשר ניתן גם לנצל בניסויים immunofluorescence. זה מאפשר אפיון נוסף של המבנים האלה ואת ההשוואה שלהם ETs שוחרר מ נויטרופילים. מקרופאגים של האדם מונוציט הנגזר (HMDM) לייצר גרורות בעת חשיפה גירויים דלקתיים שונים בעקבות בידול ל-M1 pro-הפנוטיפים דלקתיים. שחרורו של מטס יכול להיות מדמיין על ידי מיקרוסקופ באמצעות כתם ירוק הגרעין חומצה פלואורסצנטי כי הוא מיועד לחיות תאים (g., בדיקת רעלים ירוק). השימוש של מקרופאגים ראשוניים מבודדים, כגון HMDM, הוא יתרון במידול באירועים דלקתיים vivo הרלוונטיים יישומים קליניים פוטנציאליים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד שחרור MET מתוך קווי מונוציט האדם התאים (למשל, THP-1) בעקבות בידול לתוך מקרופאגים עם האצטטים myristate מקרופאג או אחרים תא קווי (g., מקרופאג murine כמו J774A. 1 תאים).

Introduction

שחרורו של ETs מ נויטרופילים זוהה לראשונה כתגובה חיסונית מולדת המופעל על ידי זיהום חיידקי¹. הם מורכבים השדרה DNA אשר שונים חלבונים הגרניט עם תכונות אנטי בקטריאלי מאוגדים, כולל נויטרופילים elastase ו myeloperoxidase². התפקיד העיקרי של נויטרופילים (רשתות) היא ללכוד פתוגנים ולהקל על חיסול שלהם³. עם זאת, בנוסף לתפקיד המגן של ETs בהגנה החיסונית, מספר גדל והולך של מחקרים גילו גם תפקיד בפתוגנזה מחלה, במיוחד במהלך התפתחות של מחלות מונחה דלקות (כלומר, דלקת מפרקים שגרונית ו טרשת עורקים⁴). שחרורו של ETs יכול להיות מופעלות על ידי ציטוקינים pro-דלקתיות שונים כולל אינטרלויקין 8 (IL-8) ו נמק גורם הגידול אלפא (tnfα)^5,6, ואת הצטברות מקומי של ETs יכול להגביר את הנזק לרקמות ולעורר תגובה הפרו דלקתית⁷. לדוגמה, ETs היו מעורבים כמו לשחק תפקיד סיבתי בפיתוח טרשת עורקים⁸, קידום פקקת⁹, וחיזוי הסיכון וכלי דם¹⁰.

עכשיו הוא מוכר כי בנוסף נויטרופילים, תאים חיסוניים אחרים (כלומר, התורן תאים, אאוזיפרלס, ו מקרופאגים) יכול גם לשחרר את האור על חשיפה לחיידקים או גירוי פרו-דלקתי^11,12. זה עשוי להיות משמעותי במיוחד במקרה של מקרופאגים, בהתחשב תפקיד המפתח שלהם בפיתוח, רגולציה, והרזולוציה של מחלות דלקתיות כרוניות. לכן, חשוב להשיג הבנה גדולה יותר של הקשר הפוטנציאלי בין שחרור ET מקרופאגים ופיתוח דלקת מחלות הקשורות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מטס ורשתות בפלאק טרשת עורקים אנושיים שלמים ומאורגנים בתרובי¹³. באופן דומה, המטס היו מעורבים בנהיגה פציעה בכליות באמצעות התקנה של תגובות דלקתיות¹⁴. עם זאת, בניגוד נויטרופילים, יש נתונים מוגבלים על מנגנוני היווצרות MET מקרופאגים. מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות האדם מודלים מחוץ לתחום של היווצרות MET להראות כמה הבדלים המסלולים המעורבים בכל סוג תא (כלומר, לגבי העדר הציטרין של היסטון עם מקרופאגים)⁶. עם זאת, חלק הראו כי מהדורת NET יכול להתרחש גם בהעדר האוקירורולציה¹⁵.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וישירה להערכת שחרור MET במודל מקרופאג רלוונטי קלינית. ישנם מספר שונים של מודלים מקרופאג cell מחוץ לתחום ששימשו לחקר מטס (כלומר, קו התאים האנושי THP-1 מונוציט וקווי התאים השונים murine מקרופאג)¹⁶. ישנן מספר מגבלות המשויכות למודלים אלה. לדוגמה, הבידול של THP-1 מונוציטים מקרופאגים בדרך כלל דורש צעד לקרקע, כגון תוספת של מיבריא אצטט myristate (PMA), אשר עצמו מפעיל את החלבון קינאז C (PKC) התלויים שבילים. תהליך זה ידוע להפעיל את שחרור ET⁴ ותוצאות שחרור בסיס נמוך הבזמ thp-1 תאים. מחקרים אחרים הדגישו כמה הבדלים ביו פעילות ותגובות דלקתיות רכוב על ידי מקרופאגים ב vivo לעומת PMA מטופלים THP-1 תאים¹⁷.

באופן דומה, את ההתנהגות ואת התגובות דלקתיות של קווי מורטין מקרופאג שונים כמו הקווים אינם מייצגים לחלוטין את ספקטרום התגובה של מקרופאגים האדם העיקרי¹⁸. לכן, לצורך חקירת היווצרות מקרופאג ET בהגדרה הקלינית, מקרופאגים (HMDMs) של האדם הראשי הנגזר הנחשב להיות מודל רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מקרופאג כמו monocytic או murine.

שחרור ET מ-M1 מקוטב HMDMs הוכח לאחר החשיפה של תאים אלה למספר גירויים דלקתיים שונים, כולל myeloperoxidase הנגזר חומצה היפוכלורית חמצון (HOCl), PMA, TNFα, ו-IL-8⁶. מתוארים כאן הוא פרוטוקול כדי להקטאת HMDMs ל-M1 פניטיפ ולדמיין שחרור MET לאחר מכן בחשיפה לגירויים דלקתיים אלה. PMA משמש גירוי של שחרור MET כדי להקל על השוואות למחקרים קודמים אשר השתמשו נויטרופילים. וחשוב מכך, HOCl, IL-8 ו-TNFα משמשים גם כדי לעורר שחרור MET, אשר האמינו להיות מודלים טובים יותר של הסביבה דלקתית ב vivo. השיטה המיקרוסקופית להדמיה של מהדורת ET כרוכה בצביעת ה-DNA של החילוץ בתרביות תאים חיים באמצעות שימוש ברעלים בירוק, הכתם הירוק של פלורסנט בלתי מורגש בצבע חומצות גרעין שהוחלו בהצלחה במחקרים הקודמים של נויטרופילים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואיכותית של שחרור ET, אך אינה מתאימה כשיטה עצמאית לכמת של מידת שחרור ET. יש להשתמש במתודולוגיה חלופית אם הכמת נדרש כדי להשוות את היקף שחרור ET כתוצאה מתנאי טיפול שונים או התערבויות.

Protocol

ה-HMDM היו מבודדים מההכנות של מעיל הבאפי האנושי המסופק על ידי בנק הדם עם אישור מוסר מאזור הבריאות המקומי של סידני.

1. התרבות החMDM

1. לבודד את המונציטים מן ההכנות מעיל באפי הכין דם היקפי של תורמים אנושיים בריאים באמצעות הכנה מסחרית זמין כדי לבודד לימפוציטים, ואחריו משחררות הנוכחית של הזרם הצנטריפוגלי^{19, . עשרים}דולר
2. לאשר את הנוכחות של מונוציטים על ידי ציטוטווייה וצביעת עם כתם Giemsa שונה לאפיון מונוציט¹⁹.
3. תחת תנאים סטריליים, להתאים את צפיפות של מונוציטים ל 1 x 10⁶ תאים/mL באמצעות RPMI-1640 מדיה ללא נסיוב. להוסיף 1 מ ל של תא זה השעיה לכל באר של 12 היטב העור הרקמה לוחית. תרבות בחממה תא ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ עבור 2 h כדי לקדם את הדבקות לצלחת תרבות רקמה.
4. תחת תנאים סטריליים, להסיר את מדיית התא ולהחליף עם השלמת RPMI-1640 התקשורת התרבותית המכילה 10% (v/v) במאגר סרום אנושי 20 מ"מ L-גלוטמין.
5. תרבות התאים ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא במשך 8 ימים, שינוי התקשורת כל יומיים.

2. פולריזציה של הmdm

1. תחת התנאים סטרילי, להכין את המדיה לקרקע M1 על ידי הוספת אינטרפרון γ (IFNγ; 20 ng/mL) ו ליפופוליד (LPS; 1 μg/mL) לתקשורת מלאה RPMI-1640 תרבות. הכן את מדיית הקרקע M2 על-ידי הוספת אינטרלויקין 4 (IL-4; 20 ng/mL) לRPMI המלאה-1640 תרבות.
2. בתנאים סטריליים, מכילים מדיה מבארות בארות העור המכילות את החברה המכילה את ה-HMDM, אשר שופרה ומתורבת כמתואר בסעיף 1.
3. שטוף בזהירות את הבארות המכילות את התאים 3x עם ה-PBS סטרילי (מחומם מראש עד 37 ° c), באמצעות 1 mL-הבליטים של PBS.
4. הוסף 1 מ ל של מדיית הטרמה של M1 או M2 לכל מדיה המכילה את ה-HMDM (המתאים לניסוי).
5. דגירה את התאים עבור 48 h ב 37 ° צ' בנוכחות של 5% CO₂ ב אינקובטור תא.

3. גירוי של הMDM כדי לגרום לשחרור MET

1. בתנאים סטריליים, להכין את מדיית התרבות המכילה המעוררים שונים של שחרור MET (המתאים לניסוי) לRPMI מלאה-1640 מדיה: PMA (25 ננומטר), רקומביננטי האדם TNFα (25 ng/mL), או האדם רקומביננטי IL-8 (50 ng/mL ).
2. לניסויים עם גירוי HOCl, להכין HOCl (200 μM) ב HBSS (טרום מחומם ל 37 ° c), מיד לפני התוספת לתאים. ודא כי HOCl אינו מוכן במדיית תאים מוחלטת.
   הערה: הריכוז של פתרון המניה של HOCl הוא כימות על ידי מדידת ספיגת UV של הפתרון ב 292 ננומטר ו-pH = 11⁶ ובאמצעות מקדם הכחדה של 350 M^-1ס"מ^-121.
3. לאחר הטיפול הפולריזציה המתואר בסעיף 2, מטפי את מדיית התא מכל הבאר ולשטוף בזהירות את התאים 3x עם 1 mL מקבל ה, או: PBS סטרילי (עבור PMA, TNFα ו-IL-8) או HBSS (עבור HOCl), אשר כבר טרום מחומם 37 ° c.
4. לניסויים עם PMA, TNFα, או IL-8: להוסיף 1 מ ל של המדיה המלאה המכילה PMA, TNFα, או IL-8 לאחר הסרת PBS בשלב הכביסה הסופי.
5. לניסויים עם TNFα, דגירה את התאים עבור 6 h ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא. לניסויים עם PMA ו-IL-8, דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא.
6. לניסויים עם HOCl, להוסיף 1 מ ל של HOCl ב HBSS לאחר הסרת HBSS בשלב הכביסה הסופי. לאחר מכן, דגירה את התאים עבור 15 דקות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ ב אינקובטור תא.
   1. בזהירות לטפי את הטלפון supernatant ולשטוף את התאים 3x עם 1 mL משובטים של HBSS כפי שמתואר בשלב 3.3.
   2. לאחר הסרת HBSS משלב השטיפה הסופי, להוסיף 1 מ ל של RPMI-1640 המלא התקשורת התרבות. לאחר מכן, דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא.

4. הדמיה של מפגש בתרבות התאים החיים

1. הכינו בדיקת רעלים לצבע ירוק HBSS בריכוז של 40 μM.
2. בסוף הטיפולים שתוארו בסעיף 3 כדי לגרום לשחרר MET, ישירות להוסיף 25 μL של 40 μM של הצבע לכל היטב המכילים HMDM.
3. התאים הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות בחושך.
4. הציבו את ה-HMDM בבארות של תרבות הרקמה על במת המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלורסנט הפוך להדמיה.
5. נוהלי מיקרוסקופ
   1. הפעל מקור אור פלורסנט רחב טווח, ברייטסורס מקור אור, ומיקרוסקופ הפוך מותקן עם מצלמה דיגיטלית צבעונית ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
   2. סובב את גלגל הסינון לתנוחת "מספר 2" עבור הזריחה הירוקה (עירור = 504 nm, פליטה = 523 nm) לדימות של הדגימות המוכתמת הירוקות הכלולות בתוך בארות תרבות הרקמה.
   3. באמצעות המטרה 5x, למקד את התמונה עם המוקד גס, ואז ידיות מיקוד עדין על המיקרוסקופ, עד התמונה נראה חד, ברור, וממוקד כאשר מתבוננים דרך העין מיקרוסקופ.
   4. העבר את המיקרוסקופ למצב המצלמה.
   5. הפעל את התוכנה המשויכת.
   6. בחר בלשונית הלכידה בתוכנה.
   7. לחצו על הלחצן ' הפעל ' לתצוגה מקדימה של התמונה והתאימו את כפתור המיקוד העדין במיקרוסקופ עד שהתמונה תיראה חדה, ברורה וממוקדת בחלון התצוגה המקדימה של התוכנה.
   8. לחץ על לחצן הלכידה .
      הערה: התמונה שנלכדה תוצג באופן אוטומטי בתוכנה הנלווית.
   9. בתוך התוכנה, לחץ על קובץ | שמור כסוג קובץ התמונה הדרוש.
   10. על המיקרוסקופ, לסובב את גלגל הסינון אל המיקום "מספר 5" עבור הדמיה ברייטפילד ולחזור על שלבים 4.5.2 – 4.5.9 כדי להשיג את התמונה המקבילה ברייטפילד.
   11. חזור על השלבים 4.5.2 – 4.5.10 לפי הצורך עבור רכישת תמונות עוקבות.

תוצאות

ברייטפילד תמונות המציגות את השינויים הורפולוגיים של HMDM בתגובה לגירויים של בידול התא מוצגים באיור 1. מקרופאגים מקוטבי M1 מניסויים עם HMDM חשופים ל-IFNγ ו-LPS הראו צורה מוארך ובעלת צורת ציר, כפי שמצוין על-ידי החיצים השחורים באיור 1 (הלוח האמצעי). לצורך השוואה, המבנה ש...

Discussion

הדור וההדמיה של היווצרות MET באמצעות M1 הבדיל HMDMs מייצג חדש במודל מבחנה שעשוי להועיל לחקירת התפקיד הפתולוגי הפוטנציאלי של מבנים מקרופאג אלה, במיוחד תחת דלקתי כרונית תנאים. הוא מספק פרוטוקול חזק לגירוי של מקרופאגים אנושיים הראשי כדי לשחרר את המטס, אשר יכול גם להיות מנוצל במחקרים קשורים עם מונ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120Q broad spectrum fluorescent light source	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada		x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)	Sigma-Aldrich	CLS3336	For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)	Polysciences Inc.	24606	Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14025050	For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl)	Sigma-Aldrich	320331	For MET stimulation
Interferon gamma	Thermo-Fisher	PMC4031	For M1 priming
Interleukin 4	Integrated Sciences	rhil-4	For M2 priming
Interleukin 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	For MET stimulation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	59202C	Added to culture media
Lipopolysaccharide	Integrated Sciences	tlrl-eblps	For M1 priming
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS	1114544	For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D5652	For washing steps
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R8758	For cell culture
SYTOX green	Life Technologies	S7020	For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source	Olympus, Tokyo, Japan		x-cite series
Tumor necrosis factor alpha	Lonza	300-01A-50	For MET stimulation