פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

Abstract

Nd: לייזרים YAG שימשו כדי לבצע ניתוח בעינית לא פולשנית, כגון capsulotomy במשך כמה עשורים עכשיו. האפקט המרחיק מסתמך על התמוטטות אופטית במוקד הלייזר. גלי הלם אקוסטי בועות הקצף נוצרות, גרימת קרע ברקמה. גודל בועה והגברה של הלחץ משתנים באמצעות אנרגיית הדופק ומיקומו של נקודת המוקד. במחקר זה, עיניים פורקלסי חזירי הוקמו מול מסחרית זמין Nd: YAG לייזר. משתנה אנרגיות הדופק, כמו גם עמדות שונות של נקודות מיקוד אחורי הקרנית נבדקו. נגעים וכתוצאה מכך הוערכו על ידי שני פוטון מיקרוסקופ ו היסטולוגיה כדי לקבוע את הפרמטרים הטובים ביותר עבור התנתקות בלעדית של תאים אנדותל הקרנית (CEC) עם נזק מינימלי השני. היתרונות של שיטה זו הם הצריבה המדויקת של CEC, מופחתת נזק סביבתי, ומעל לכל, טיפול ללא מגע.

Introduction

שקיפות הקרנית חיונית להעברת האור לרשתית ולפוטוטורטורים¹. בהקשר זה, מצב יחסי של התייבשות הוא קריטי כדי לשמור על סיבי הקולגן בתוך משתית הקרנית מיושרים כראוי. הומאוסטזיס זה מתוחזק על ידי תאי הקרנית אנדותל (CEC) ממוקם על קרום האמת (DM)². האנדותל היא שכבת הקרניות הפנימית ביותר. יש לו מכשול חשוב ותפקוד המשאבה, אשר חיונית עבור שקיפות הקרנית³. בניגוד האפיתל, האנדותל אינו מסוגל לחדש את העצמי⁴. לפיכך, כל נזק תאי שנגרם על-ידי מחלה או טראומה מגרה את התאים האנדותל הנותרים כדי להגדיל ולהגר, לכסות את הפגמים הנובעים ולשמור על פונקציונליות הקרנית⁵. עם זאת, אם צפיפות ה-CEC נופלת מתחת לסף קריטי, פירוק האנדותל מוביל לבצקת, וכתוצאה מכך ראייה מטושטשת וחוסר נוחות או כאב חמור אפילו⁴. למרות הזמינות של תרופות כדי להקל על הסימפטומים, כיום הטיפול הסופי היחיד במקרים אלה הוא השתלת הקרנית, אשר ניתן לבצע בצורה של השתל בעובי מלא או השתלת אנדותל מלצ'יני. הנוהל האחרון הינו זמין בתור ממברנה של הממברנה האנדוספיה (DMEK), כמו גם של התפשטות הנוכחות האוטומטית של מתיחת העומק (DSAEK)⁶. עם זאת, ההגנה של שנותרו CEC ושיפור ההישרדות שלהם יכול להיות יעד חלופי, אשר זקוק למודל מחלה נאותה כדי לבחון תרופות טיפוליות פוטנציאליות.

הנוכחי CEC מחלת הפסד מודלים להתמקד בהשמדת האנדותל באמצעות הזרקה של סוכנים רעילים (g., בנזלקוניום כלוריד) לתוך החדר הקדמי או על ידי שחיקה מכנית של התאים באמצעות שיטה של ירידות פולשני^7,8. בעוד מודלים אלה מבוססים היטב, חסרונות כגון תגובה דלקתית כללית ונזק סביבתי לא מדויק קיימים. לכן, מודלים אלה נוטים יותר לייצג את השלבים הסופיים של המחלה, כאשר האפשרויות הכירורגי הנ ל הם בלתי נמנעים.

עם ההתקדמות אסטרטגיות הטיפול הסלולרי כגון בתאי גזע וטיפול גנטי, היישום של אלה טיפולים סלולריים יכול להיות שימושי בשלבים המוקדמים של הפסד CEC⁹. לאחר מכן, אנו זקוקים למודל המייצג את השלבים המוקדמים האלה של המחלה בצורה מספקת יותר. בהקשר זה, מודלים של תרבות התא השתפרו בעשור האחרון אבל הם עדיין מוגבלים בתוקף שלהם, כמו תאים בתחום החוץ לא יכול להתקרב לשכפול האינטראקציות המורכבות המתרחשות בין סוגי התא השונים בתוך הקרנית¹⁰. לכן, vivo ex ובדגמי המחלות vivo עדיין בביקוש גבוה ושיפור הקיימים הוא בעל אינטרס מוחלט.

פולשני, ניתוח תוך העינית על ידי פוטושיבוש באמצעות מניאודימיום: YAG (Nd: YAG) לייזר הפך הליך שגרתי עבור רופאי עיניים ברחבי העולם מאז השקתו בסוף שנות ה-70¹¹. פוטושיבוש מסתמך על קליטת אור לא לינארית המובילה להקמת פלזמה, הדור של גלי הלם אקוסטי, ויצירת בועות קוויטציה, בכל פעם שאתר היישום ממוקם בסביבה נוזלית¹². באופן כללי, תהליכים אלה תורמים להשפעה המיועדת של חיתוך רקמות מדויק. עם זאת, הם יכולים גם להיות מקור נזק סביבתי מיותרים הגבלת הכליאה המקומית של ניתוח לייזר¹³.

החיזוי של השפעות מכניות כתוצאה מכך השתפר באופן משמעותי באמצעות אפיון של הפצת גל ההלם וקורס החפירה. זוהי המטרה שלנו למקד את CEC עם נזק קטן לרקמות שמסביב ככל האפשר כדי לספק מודל פולשני, לייזר בסיוע ניסיוני המודל עבור בשלבים המוקדמים של הפסד CEC. לצורך זה, יש צורך לקבוע את האנרגיות האופטימליות של הדופק ומיקומי הנקודות של מוקדי הלייזר.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים ברקמת בעלי חיים עוקבים אחר ההנחיות של ועדת האתיקה המקומית לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנת תרבות איברים וטיפול לייזר

1. השיגו עיניים פורקליות טריות מהמטבחיים שמור אותם קריר (4 ° c) ב שונה בינונית הנשר של דולבco (dmem) עם גלוקוז גבוה, שיושלם עם L-גלוטמין, נתרן פירובט, פניצילין/סטרפטומיצין (1%), סרום חזירי (10%), מעתה המכונה במאמר זה כמדיום מלא.
2. הסרת רקמות מיסיביות עם מספריים ולהשרות את העיניים 5% povidone-הפתרון האופטלמולוגי של יוד עבור 5 דקות לפני הצבת אותם מלוחים מעוקר מאגור פוספט (PBS) עד השימוש.
3. עיניים מסך עבור הפתווגיות מקטע הקדמי הראשי, כגון צלקות הקרנית, בצקת, ו אטימות אחרות עם התקן ספקטרלי קוהרנטית אופטי של טומוגרפיה ממוחשבת (טבלת חומרים).
4. למקם את העיניים מול יחידת מנורה שחור מצויד Nd: YAG לייזר (טבלה של חומרים), אשר יש אורך גל של 1,064 ננומטר ו קוטר ספוט מוקד של 10 יקרומטר באוויר.
   הערה: לצורך מיקום אופטימלי מנגנון החזקת תלת-ממד מודפס משמש, אשר נועד להחזיק את חברת העין, מבלי ללחוץ יותר מדי על זה (איור 1).
5. השתמש הגדלה של 12x ולהדוף את התאורה כדי להמחיש את שכבות הקרניות הבודדות.
6. הגדר את אנרגיית הדופק (למשל, 1.6 mJ) ונקודת המיקוד (לדוגמה, 0.16 מ"מ) עבור אבלציה סלקטיבית של תאי האנדותל.
7. במקום הקרנף ברור שיהיה בקרבת לימבוס והכנס אתהחומרהגמיש ביותר (לוח חומרים) כדי לייצב את התא הקדמי.
8. בלו את הקרנית המרכזית שטופלה בלייזר באמצעות טרפין של 8 מ"מ.
9. הניחו את הקרנית המחפירה בבאר של לוחית של 12-הצלחות עם האתר האנדותל הפונה כלפי מעלה והדגם בתוך 3 מ ל של מדיום מלאה ב-37 ° c עד 3 ימים.
   הערה: ניתן להוסיף למדיום סוכני cytop, פוטנציאליים במהלך שלב זה.

2. הכנה להיסטולוגיה

1. הכנת מאגר של סורנסן עם pH של 7.4 המכיל 19.6 mL של 133 mM KH₂פו₄ ו 80.4 Ml של 133 mm Na₂hpo₄.
2. להסיר את המדיום מתוך קרנית המכילה היטב ולקבוע את הרקמה 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) באמצעות מתנול-בחינם פאראפורמלדהיד (4%) במאגר של סורנסן
3. מניחים רקמות ב -20% סוכרוז ב-PBS עד כיורים רקמות (1 h) ולאחר מכן ב 30% סוכרוז ב-PBS לילה ב-RT. דאג להימנע ממגע עם בועות וממשק פני האוויר. הטמע רקמות בטמפרטורת חיתוך מיטבית (OCT) ובחנות at-80 ° c.
4. גזור סעיפים 10 יקרומטר עבה באמצעות קריוסטט ב-27 ° c.
   הערה: מברשת שיער גמלים שימושי כדי להנחות את הקטע המתעוררים על להב הסכין.
5. העבר את המקטע לשקופית מיקרוסקופ על ידי נגיעה בשקופית לרקמות בתוך 1 דקות של חיתוך אותו כדי למנוע הקפאת ייבוש של הרקמה. אחסן את השקופיות ב--80 ° c.

3. המטאוקסילין ואאוזין (H & E) מכתים

1. חלקי אוויר יבשים במשך כמה דקות כדי להסיר לחות.
2. כתם עם מסוננים 0.1% מיימרים המטאוקסילין במשך 10 דקות בצינור 50 mL.
3. בצנצנת Coplin, לשטוף קריר פועל ddH₂O עבור 5 דקות ולטבול ב 0.5% אאוזין 10x.
4. טבול ב-ddH₂O עד אאוזין מפסיק בעירום ולאחר מכן לטבול 50% (10x), כמו גם 70% (10X) אטוה.
5. משקל 95% אטוח (30 s) ו 100% אטוח (60 s) לפני שטבול בקסילן מספר פעמים.
6. לבסוף לטעון, coverslip הדגימה לפני נטילת תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור.

תוצאות

באמצעות ההליך המוצג כאן, התייחסו לעיניים עם Nd: YAG לייזר, הערכת אנרגיות פולס שונות (1.0-4.6 mJ) ועמדות של נקודות מוקד (מרחק מהמשטח האחורי של הקרנית: 0.0-0.2 מ"מ) כדי למצוא את הפרמטרים האופטימליים. מספר משכפל (n = 3) הוערך עבור כל קבוצת כוכבים של פרמטרי הלייזר (12 x 21).

בנוסף לפרוטוקול הנ ל, הדג?...

Discussion

התוצאות של המחקר הטיס הזה עולה כי Nd: YAG לייזר ניתן להשתמש באופן סלקטיבי בתאי הקרנית בצורה סלקטיבית כאשר הפרמטרים המתאימים למינון האנרגיה ומיקום נקודת המיקוד נבחרים.

כמו הפונקציה אנדותל חשוב עבור שקיפות הקרנית ושמירה על הקרנית מתוך בצקת סטרומה, מודלים של בעיות אנדותל לשחק ת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel