JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה יוצר מיקרו-מערכים ביוביופית המספקים שורצים בעלי מליטה באמצעות הספפיל. הוא מספק גישה קלה למגשרים כי נויטרופילים שחרור במהלך הגירה ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית.

Abstract

נויטרופילים שורצים הוא תהליך משותף שבו נויטרופילים לאטום את אתר של זיהום ולקדם התארגנות רקמות. המונים נחקרו באופן קלאסי בvivo בדגמי בעלי חיים המציגים דפוסים אופייניים של נדידת תאים. עם זאת, במודלים vivo יש מספר מגבלות, כולל מגשרים אינטרתאיים שקשה לגשת ולנתח, כמו גם חוסר יכולת לנתח במישרין את הנויטרופילים האנושיים. בגלל מגבלות אלה, יש צורך בפלטפורמת מבחנה כי מחקרים שורצים עם נויטרופילים האדם ומספק גישה קלה האותות המולקולריים שנוצרו במהלך שורצים. בשלב זה, משתמשים בתהליך מיקרו-מעבדים מרובה-צעדים כדי ליצור מיקרוarray של מאמר ביוגרפי, המעוררת שורצים בvivo זיהום. ביוביומאמר microarray גורם נויטרופילים נחיל בצורה מבוקרת ויציבה. על מיקרוarray, העלייה נויטרופילים במהירות וליצור נחילים יציבים סביב אשכולות מאמר ביוגרפי. בנוסף, supernatant שנוצר על ידי נויטרופילים נותחו ו 16 חלבונים התגלו להתבטא באופן מהותי במהלך שורצים. זה בפלטפורמת מתורבת שורצים מקלה ניתוח ישיר של הגירה נויטרופילים ושחרור חלבון באופן שאינו מפוקח, בצורה מבוקרת מרחב.

Introduction

נויטרופילים, הנפוץ ביותר של תא דם לבן במחזור הדם1, הם צוברים תשומת לב כמטרות אבחון וטיפול פוטנציאלי2,3 כי הם עשויים להיות מעורבים במגוון של מצבים רפואיים כולל שיגרון4, אלח דם3, טראומה5,6, סרטן1,7,8, מחלות אוטואימוניות שונים5,9. נויטרופילים שורצים היא מרובת השלבים, תהליך מוסדר בחוזקה עם מורכבות זה עושה את זה מוקד מעניין במיוחד של לימוד5,10,11. במהלך שורצים, נויטרופילים לבודד אתר של דלקת מתוך רקמות בריאות שמסביב5,10,11. התקנה הנכונה של נויטרופילים שורצים חיוני כדי לקדם ריפוי הפצע בסופו של דבר החלטה דלקת5,12. נויטרופילים שורצים נחקרו בעיקר בשנת vivo ב מכרסם12,13,14,15 ו דג הזברפיש10,11,12, 15 מודלים . עם זאת, הטבע של אלה בדגמי בעלי חיים vivo מעניקה מגבלות5. לדוגמה, המגשרים שפורסמו על ידי נויטרופילים במהלך שורצים אינם נגישים בקלות לניתוח5. בנוסף, ישנם מקורות פוטנציאליים רבים עבור מתווך נתון vivo, כך בניסוי vivo חייב להחדיר מחסור גנטי כדי לעכב את הייצור הסלולר ו/או אינטראקציה כדי לחקור את התפקיד של המגשר הזה בתהליך נתון13. על ידי הפעלת התבוננות נויטרופילים ללא ההקשר של תאים נוספים. בנוסף, מחקר המתאר נויטרופילים האדם הגירה מתואמת הוא מוגבל16. על הפלטפורמה שורצים מתורבת, נויטרופילים האדם יכול להיות מנותח ישירות. פלטפורמת שורצים מבחנה יכולה להתרחב על הידע שנרכש במחקרים vivo על ידי מתן הזדמנויות למלא את הפערים שנותרו על ידי מגבלות במחקרים vivo.

כדי לטפל בצורך בפלטפורמת מבחנה המחקה ב vivo נויטרופילים שורצים, פיתחנו פלטפורמת מיקרוהטבעה המאפשרת לנו דפוס ביופסיה מאמר מיקרו מערכים המעוררים נויטרופילים שורצים באופן מבוקר מרחב. אנו יוצרים מיקרוערכים ביוביומאמר על מגלשות זכוכית בתהליך דו-שלבים. ראשית, אנו משתמשים במיקרו-הטבעה כדי ליצור מיקרו מערך של כתמי פוליאלקטרוליט (CP). שנית, אנו מוסיפים פתרון של מאמרים הנצמדים לנקודות CP באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית. על-ידי הראשון מעורר את שכבת CP, אנחנו יכולים באופן סלקטיבי דפוס מאמרים טעונה באופן שלילי על מנת ליצור את התבנית הרצויה נויטרופילים שורצים. השכבה טעונה באופן חיובי מחזיקה את מאמרים ביוטעונים שלילית באמצעות השלב השוטף הנמרץ המסיר את מאמרי הביויולים מהאזורים בשקופית הזכוכית שאין להם את ה-cp. בנוסף, cp השתמשו כאן, סופולימר של אקרילאמיד ו-מונומר מונומר, הוא ביו תואם, אז זה לא לגרום ל יש לו טען משטח גבוה מאוד כי משתק את מאמרי ביוביומיקרון בגודל בינוני לשקופית זכוכית, ובכך מעכב נויטרופילים להסיר את החלקיקים מהמיקום בתבנית על שקופית זכוכית. התוצאה היא אשכולות ביוביומאמרים המסודרים במיקרו-מערך. כאשר הוספנו נויטרופילים למיקרו-מערך, הם יצרו נחילים יציבים סביב האשכולות של המאמרים. באמצעות מעקב הגירה נויטרופילים, מצאנו כי שורצים באופן פעיל להגר לכיוון אשכולות המאמרים ביופסיה. יתר על כן, השתמשנו בפלטפורמה זו כדי לנתח מגשרים מסוימים שחרור נויטרופילים במהלך שורצים. מצאנו 16 מגשרים שמתבטאים באופן מכריע בזמן שורצים. הריכוזים שלהם לעקוב אחר שלוש מגמות כלליות לאורך זמן: להגדיל, להקטין, או ספייק. שלנו בפלטפורמת מבחנה שורצים הפלטפורמה מקלה על ניתוח של שליטת נויטרופילים האדם מבוקרת, כמו גם את האוסף וניתוח של מגשרים שפורסמו על ידי נויטרופילים שורצים. בפרסום קודם, הדגמנו כי חולים עם מצבים רפואיים מסוימים (טראומה, מחלות אוטואימוניות, ו אלח דם), היו נויטרופילים שפעלו באופן שונה מאלה תורמים בריאים5. במחקרי מחקר עתידיים, הפלטפורמה שלנו יכול לשמש לניתוח הפונקציה נויטרופילים בקרב מגוון רחב של אוכלוסיות החולה. פלטפורמה זו יכולה לנתח את הקואורדינציה המורכבת הכרוכה בנויטרופילים שורצים. מחקרים נוספים ניתן לעשות כדי לספק תובנה על הפונקציה נויטרופילים של אוכלוסיית החולה ספציפית או תגובת נויטרופילים לפתוגן של עניין.

Protocol

המחברים מכירים במתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות את דמם. דגימות דם הושגו לאחר הסכמה מתנדבת מושכלת על פי הלוח ביקורת מוסדית (IRB) פרוטוקול #2018H0268 נבדקו על ידי הוועדה למדעים ביו-רפואי באוניברסיטת אוהיו.

1. המיקרו-מיקרוקוד של ביוביומאמר

  1. באמצעות נוהלי ליתוגרפיה סטנדרטיים, ליצור וופל סיליקון מאסטר.
    1. צור הוכחה לעיצוב הרצוי באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD), ולאחר מכן שלח ליצרן פוקשו לייצר מגוון כרום. העיצוב המשמש כאן הוא 4 מ"מ x 4 מ מ מערכים מלבניים של 30 יקרומטר קוטר ממולא במעגלים עם 150 יקרומטר מרכז למרכז מרווח. עיצוב זה יכול להיות שונה כנדרש עבור יישומים שונים.
    2. Spincoat עיל a 40 יקרומטר שכבה עבה של photoresist שלילית על וופל סיליקון. אופים וופל ב 65 ° צ' עבור 5 דקות ו 95 ° צ' עבור 10 דקות.
    3. לחשוף וופל לאור UV באמצעות פוברז כרום עם 150 – 160 mJ/cm2 (איור 1א).
    4. אופים וופל ב 65 ° צ' עבור 5 דקות ו 95 ° c עבור 10 דקות. לטבול וופל במפתח photoresist עבור 10 דקות ולשטוף עם אלכוהול איזופרופילי. בשלב זה, התבנית צריכה להיות גלויה על הפרוסת (איור 1ב).
  2. ביסודיות לערבב 10:1 יחס של polydiמתיל סילאוקאן preoxane ואת הסוכן שלה ריפוי (כלומר, 20 גרם של prepolymer ו 2 גרם של ריפוי הסוכן) ויוצקים את התערובת polydiמתיל siloxane (PDMS) על וופל מאסטר בצלחת פטרי (איור 1ג).
  3. ואקום לטפל בתערובת PDMS לא נרפא עד בועות אוויר לא נמצאים מעל וופל המאסטר. לרפא ב 65 ° c בלילה.
  4. השתמש אזמל לחתוך מסביב לחלק החיצוני של הקטע של הפרוסת וופל, ולהסיר לאט את הלוח PDMS נרפא. מניחים את לוח PDMS על לוח חיתוך נקי עם הצד הפונה כלפי מעלה (איור 1ד).
  5. ניקוב בולים בודדים מלוח PDMS עם פונץ ' ביופסיה של 8 מ"מ (איור 1E). , עבור מגלשת זכוכית אחת. יהיה צורך בשמונה בולים
  6. מניחים כל הפנים בול על הסרט דבק כדי להסיר את כל הפסולת.
  7. מראש, להכין פתרון 1.6 mg/mL של CP במים.
    1. להוסיף את הכמות הנכונה של אבקת CP למים (למשל, 0.8 g כדי 500 mL).
    2. מערבבים על צלחת מהומה בטמפרטורת החדר לילה, או עד שכל המוצקים מומס למים. פתרון CP ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 6 חודשים.
    3. אם רצונך בכך, הפוך את ה-CP לפתרון פלורסנט על-ידי הוספת פולי-L-ליזין מתויג עם fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC).
      1. הנורית כ-10 mL של פתרון CP. הוסף כמות קטנה של PLL-FITC (0.05 מ"ג) לכרך המצוטט. ניתן לשנות את הסכום כדי לכוונן את בהירות הזריחה כרצונך.
      2. מערבולת פתרון CP המסומן עם FITC עבור 20 s, או עד הפתרון הוא אחיד, צבע צהוב חיוור. הגן מפני אור ואחסן ב-4 ° צ' עד חודש אחד.
  8. עם החותמות עם הפנים כלפי מעלה, הממשלה כל חותמת עם 100 μL של 1.6 mg/mL הפתרון של CP, להבטיח לא טופס בועות אוויר בין הפתרון CP ואת החותמת (איור 1F).
  9. היפוך החותמות על שכבה של פתרון CP (איור 1G).
  10. הסר את הבולים מהפתרון CP לאחר 1 h.
  11. לטפוח על כל בול רטוב הפנים מטה אל שקופית זכוכית נקייה 6-8x כדי להסיר את עודפי הנוזלים.
  12. ואקום לטפל החותמות 1 – 2 דקות.
  13. לדבוק שמונה היטב, בקוטר 9 מ"מ מרווח הדמיה בחלק העליון של שקופית זכוכית נקייה כמדריך למיקום בחותמת. עם החלל הזה, כל מגלשת הזכוכית. יכולה להיות שמונה מיקרו-מערכים
  14. הניחו את פני החותמת על שקופית הזכוכית במרכז של כל באר של מרווח ההדמיה (כלומר, השתמשו בשמונה כולל בולים).
  15. מקום 5.6 ± 0.1 g מאוזנת משקל על גבי כל חותמת ולאפשר 10 דקות עבור הטבעה (איור 1H). משקל מאוזן נדרש כדי להבטיח את החותמת היא לחצה באופן שווה על שקופית זכוכית ולקדם אפילו העברה של CP לשקופית זכוכית.
  16. הסר את המשקולות והחותמות מתוך שקופית הזכוכית (איור 1I). הניחו לשכבת ה-CP להתייבש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות לפני הוספת מאמרי הביוביו, כמתואר בשלב 1.17. אם CP הוא מתויג עם FITC, את האפקטיביות של הטבעה ניתן לבדוק בנקודה זו עם מיקרוסקופ פלורסנט ב 488 ננומטר לפני שתמשיך צעד 1.17 (איור 1M).
  17. גזור לוח PDMS ריק לגודל מרווח ההדמיה והשתמש בפונץ ' ביופסיה של 8 מ"מ כדי ליצור בארות ב-PDMS היישר עם הבארות של מרווח הדמיה. לדבוק את לוח PDMS לשקופית הזכוכית עם מרווח הדמיה (איור 1J).
  18. הפשרת פתרון של ביוטיפים (למשל, e. coli או zymosan) ולדלל עד 500 Μg/mL במים להזרקה (wfi).
    הערה: אין צורך להיות מאמרים בביויוטיפים. קולטני פני השטח של נויטרופילים לזהות באופן ישיר מולקולות על הביוטיפים האלה19,20,21.
  19. הוסף 100 μL של פתרון ביוביומאמרים לכל מחשב של PDMS על שקופית הזכוכית (איור 1K).
  20. . נענעי את הזכוכית במשך 30 דקות
  21. שטפו את הבארות ביסודיות במים. ניתן לאחסן את המיקרו-מערך ביוביומטר בסביבה נטולת אבק ב-4 ° c עד 3 חודשים. בשלב זה, התבנית יש לבדוק עם מיקרוסקופ פלורסנט ב 594 ננומטר לפני שתמשיך צעד 2.1 (איור 1N).

2. הכנה לדוגמא

  1. לאסוף לפחות 2 מ ל דם טרי בצינורות K2-EDTA מן התורם הרצוי. התשואה הצפויה של נויטרופילים היא 1 – 2 x 106 תאים/1 מ"ל דם שלם. שיטת ההדמיה דורשת כ 1.5 x10 נויטרופילים, וניתוח של supernatant דורש 1 x 106 נויטרופילים. . תשתמש בדם בתוך 4 שעות
  2. הפרד בין כדוריות הדם האדומות (RBCs) על-ידי הוספת סוכן צבירה של אריתרופואריציט ביחס של 1:5 לכל הדם. המתן 45 דקות עבור שכבה שקופה (מעיל באפי) כדי להפריד מהשכבה של RBCs.
  3. הסר את מעיל באפי ולשטוף עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) באמצעות מעיל באפי 1 mL: 9 מ"ל PBS.
  4. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 190 x ו 20 ° c.
  5. ומשהה את הגלולה ב -5 x 107 תאים/mL.
  6. השתמש בערכת הבחירה החיסונית שלילית כדי לבודד נויטרופילים.
    1. הוסף 50 μL של מתלה/מכשיר השעיה של תא נוגדן/1 mL. . חכה 10 דקות
    2. הוסף 100 μL של מתלה מגנטי חרוזים/1 mL. . חכה 10 דקות
    3. הוסף השעיית תא לצינור תחתון עגול ומקום במגנט גלילי. . חכה 10 דקות
  7. . תשפוך את הסופרנטאנט לתוך צינורית צנטריפוגה הוסף עד 10 מ ל של PBS. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 190 x ו 20 ° c.
  8. . מנושף את הסופראנט השהה מחדש גלולה לבנה ב-IMDM עם 0.4% אלבומין סרום אנושי.
  9. גרעיני כתם עם 20 μg/mL הואכסט 33342 עבור 10 דקות ב 37 ° c.
  10. הוסף 5 מ ל IMDM עם 0.4% סרום האדם אלבומין לשטוף. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 190 x ו 20 ° c.
  11. להשעות את התאים בשעה 7.5 x 105 תאים/ML ב imdm עם 0.4% הנסיוב האנושי אלבומין.
  12. הוסף 100 μL של השעיית התא ל-PDMS היטב המכיל מיקרוarray של מאמר ביוגרפי. ודא כי ההשעיה התא הוא קמור מעל החלק העליון של PDMS היטב אינו מכיל בועות כלשהן.
  13. חותם עם שמיכות. בקוטר 12 מ"מ לכסות את הפתח של היטב PDMS עם שמיכות בקוטר 12 מ"מ. לחץ למטה בעדינות על הכיסויים עם מלקחיים כך ההשעיה התא עודף בורח לקצה של הבאר. השתמש ברקמה כדי להסיר את השעיית התאים העודפים.

3. הפעלת הטיפול וניתוח התמונה

  1. טען מערך מיקרו-חלקיק עם תאים בתחנת הדימות של התא החי עם מיקרוסקופ המצויד באינקובטור מכלוב שנקבע ל-37 ° c, 5% CO2, ו 90% לחות יחסית.
  2. השימוש פלורסנט זמן ומיקרוסקופ ברייטפילד להקליט תמונות בהגדלה 10x כל 10 ב 405 ננומטר, 594 nm, ו ברייטפילד. בניסוי אופייני, התמונות נאספות עד 2 שעות.
  3. השתמש בתוכנה אוטומטית למעקב אחר תאים כדי לעקוב אחר הגירה של נויטרופילים בודדים לכיוון אשכול מאמר ביוגרפי.
    1. השתמש במצב שינוי אוטומטי של תוכנת מעקב אחר תא לזיהוי ספוט. הגדר את רדיוס הספוט ל-5 יקרומטר (הגודל המשוער של גרעין נויטרופילים). הגדר את אורך המסלול המינימלי ל-120 s וגודל הפער המרבי של מסגרת אחת.
    2. מן הנתונים שנוצרו על ידי תוכנת מעקב התא, לחלץ את הקבצים המכילים את מיקום נויטרופילים ומהירות. קבצים אלה ניתן להשתמש עם תוכנה גרפים לייצר מסלולים הגירה נויטרופילים (איור 2ג) ו מפת חום של מהירות לעומת זמן (איור 2D), בהתאמה.
  4. השתמש בתמונות פלורסנט 405 ננומטר כדי לעקוב אחר גודל נחיל לאורך זמן על תוכנה ניתוח תמונה על פי בחירתך.
    1. הגדר אזורים של עניין (ROIs) סביב כל מאמר ביוביוזה שבאשכולות שבו נויטרופילים יהיה נחיל. שמור על אותו גודל תשואה כדי לנתח כל אשכול של מאמר ביוגרפי.
    2. לנתח את עוצמת פלורסנט מתכוון של 405 ננומטר תמונות בתוך כל ROI לאורך זמן.
    3. צור עקומת כיול של עוצמת פלורסנט מתכוון לגודל נחיל על ידי נקיטת מדידות ידניות בגדלים שונים נחיל מ 0 יקרומטר2 לגודל נחיל מקסימלית. השתמש בכיול זה כדי לחשב את גודל הנחיל לאורך זמן.

4. איסוף וזיהוי חלבון

  1. דגירה של נויטרופילים בבארות המכילים את מיקרוarray מאמר ביוביומטר ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 3 h. קחו דגימות מנקודות הזמן הרצויות. בדרך כלל, הדגימות יילקחו ב 0, 0.5, 1, ו-3 h. כדי להתגבר על מגבלת הזיהוי של מערך החלבון שיטת, הנפח כולו של supernatant של באר אחת (200 μL) שימש עבור כל נקודת זמן. . כל פעם נותחו בטרילקאט
  2. באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד, ודא שנחילים נוצרים במיקרו-מערך.
  3. מייבש את supernatant עם הפיפטה 200 μl וטען בצינור 0.45 מסנן צנטריפוגה יקרומטר.
  4. צנטריפוגה את supernatant ב 190 x g ו 20 ° צ' עבור 5 דקות ולאסוף את נפח filtrated.
  5. החנות דגימות ב-80 ° c עד הזמן עיבוד.
  6. השתמש בערכת microarray המזהה מגוון של חלבונים אנושיים כדי לעבד דגימות.
    1. הוסף 200 μL של כל מדגם לצינור דיאליזה נפרד המסופק עם הערכה.
    2. מניחים את הצינורות דיאליזה בגביע המכיל לפחות 500 mL של PBS (pH = 8.0). מערבבים בעדינות על צלחת מהומה לפחות 3 שעות ב -4 ° c. שינוי ה-PBS בגביע וחזור על שלב זה.
    3. העבר כל מדגם לצינור צנטריפוגה נקי וצנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 5 דקות כדי להסיר את כל הזרז. . העבירו כל סופרנטאנט לצינור נקי
    4. Biotinylate אוחר כל מדגם על ידי הוספת 36 μl של תיוג 1x מגיב מערכת לכל 1 מ"ג של חלבון מוחלט במדגם דיאליזה כדי 180 μl של המדגם דיאליזה. מודקון ב 20 ° c עבור 30 דקות. מערבבים בעדינות כל 5 דקות.
    5. הוסף 3 μL של פתרון העצירה שסופקו עם הערכה לתוך כל צינור לדוגמה. העבר כל מדגם לצינור דיאליזה טרי ושלבים חוזרים 4.6.2 – 4.6.3. בשלב זה, ניתן לאחסן את המדגם ב-20 ° c או-80 ° c עד שתהיה מוכן להמשיך.
    6. שקופית הזכוכית המסופקת עם הערכה מאוחסנת ב-20 ° c. . הרשי לו להגיע לטמפרטורת החדר הניחו את שקופית הזכוכית המכונעת במכסה של זרם למינארי בטמפרטורה של 1 – 2 h בטמפרטורת החדר.
    7. הוסף 400 μL של מאגר חסימת שסופק עם הערכה לתוך כל טוב של שקופית זכוכית מורכב. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
    8. צנטריפוגה את הדגימות המוכנות עבור 5 דקות ב 9,000 x g כדי להסיר מאיצים או חלקיקים. לדלל 5x עם מאגר חוסם.
    9. הסר את המאגר החוסם מכל באר. הוסף 400 μL של הדגימות המדוללת לתוך הבארות המתאימות. דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.
    10. . הדקי את הדגימות מכל באר שטוף 3x עם 800 μL של מאגר הכביסה 1x שסיפקתי עם הערכה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כל אחד בזמן הנדנדה.
    11. במיכל נקי, להטביע את השקופית זכוכית מורכב ב-1x מאגר לשטוף אני. לשטוף 2x בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כל אחד בזמן הנדנדה.
    12. הוסף 400 μL של 1x Cy3 מצוותת streptavidin לכל מערך משנה. מכסים עם רצועות פלסטיק דבק. הגן מפני אור לשארית הפרוטוקול.
    13. דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.
    14. Decant הפתרון ולפרק את שקופית הזכוכית מתאי המדגם.
    15. ב 30 מ ל שפופרת צנטריפוגה מסופק עם הערכה, בזהירות להוסיף את שקופית זכוכית מספיק 1x לשטוף מאגר אני לכסות את השקופית זכוכית. כביסה 3x עבור 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.
    16. ב שפופרת צנטריפוגה 30 מ ל, לשטוף 2x עם מאגר כביסה 1x II עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בזמן נדנדה.
    17. שטוף את שקופית הזכוכית עם 30 מ ל של ddH2O עבור 5 דקות להסיר את שקופית הזכוכית מצינור הצנטריפוגה ולאפשר ייבוש 20 דקות במכסה הזרם למינארי. ניתן לאחסן את שקופית הזכוכית המוכנה ב-20 ° c עד שהיא מוכנה לסריקה.
    18. סרוק את שקופית הזכוכית עם סורק מיקרוarray בפליטת פלואורסצנטית של 555 ננומטר.

תוצאות

כאשר נויטרופילים נוספים למיקרו מאמר ביוביומערך, נויטרופילים ליצור קשר עם אשכולות המאמרים להיות מופעל וליזום את התגובה שורצים. המיקרומערך הביויואלי אומת באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט בזמן הקפיצה כדי לעקוב אחר הגירה נויטרופילים לקראת האשכולות מאמר ביופסיה (וידאו S1). הגירה של גרעיני ...

Discussion

פיתחנו מיקרורקיעת הפלטפורמה כדי ליצור מערכים אחידים של ביויוטיפים כדי לגרות בתוך מבחנה שורצים. הטבע מתורבת של הפלטפורמה שלנו מאפשר לנו לעקוף את הסיבוכים הנובעים עם vivo שורצים ניסויים, כלומר היכולת המסכנה לנתח מגשרים שפורסמו על ידי שורצים נויטרופילים5. בנוסף, ב vivo מודלים מבוצע...

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מימון של ויליאם G. Lowrie המחלקה להנדסה כימית ביוקולקלית ואת מרכז הסרטן המקיף באוניברסיטת אוהיו. הנתונים המוצגים בדו ח זה הגיעו מתמונות שעובדו באמצעות מיכל x64 (ver. 9.3.0 Bitplane טוס) זמין במכון המיקרוסקופיה של הקמפוס והדמיה, האוניברסיטה הממלכתית של אוהיו. מתקן זה נתמך בחלקו על ידי גרנט P30 CA016058, המכון הלאומי לסרטן, בת, MD.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
"The Big Easy" EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18001Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell IncubatorOkolab777057437 / 77057343Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation KitSTEMCELL Technologies17957Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2Nikon InstrumentsMEA54010 / MEF55037Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugateInvitrogenE2863Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punchSigma AldrichZ708925To cut PDMS stamps
HetaSepSTEMCELL Technologies7906Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Nucleus fluorescent stain
Human L1000 ArrayRaybiotech Inc.AAH-BLG-1000-4High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA)Sigma AldrichA5843Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubesThermo Fisher Scientific02-657-32Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome PhotomaskFront Range PhotomaskN/ADimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray ScannerPerkin ElmerASCNGX00Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - ImarisBitplane9.3.0Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software PackageNikon InstrumentsMQS31100Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)Sigma AldrichP3069-10MG30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging SpacerGrace Bio-Labs6540088-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon WaferUniversity Wafer590Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin CoaterLaurellWS-650MZ-23NPPBUsed to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025MicroChem2025Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 DeveloperMicroChemY020100Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)Dow16739212-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking SystemKloéUV-KUB 2Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
WaterThermo Fisher ScientificA1287303High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185BASF8185Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugateInvitrogenZ2843Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array

References

  1. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
  2. Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
  3. Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
  4. Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
  5. Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
  6. Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
  7. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
  8. Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
  9. Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
  10. Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
  11. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  12. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  13. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  15. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  16. Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
  17. Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
  18. Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
  19. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
  20. Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
  21. Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
  22. Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
  23. Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
  24. Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
  25. Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
  26. Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
  27. Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
  28. Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156array

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved