במודל עכבר Vivo של זיהום שתל בעמוד השדרה

Summary

הפרוטוקול מתאר מודל עכבר in vivo חדשני של זיהום שתל בעמוד השדרה שבו שתל חוט K מפלדת אל-חלד נגוע בסטפילוקוקוס אאורוס Xen36 ביולומינסנטי. עומס חיידקי מנוטר לאורך עם הדמיה ביולומינסנטית ומאושר עם ספירת יחידות יוצרות מושבה לאחר המתת חסד.

Abstract

זיהומים בשתלי עמוד השדרה מבשרים תוצאות גרועות מכיוון שהאבחון מאתגר ומיגור כירורגי מנוגד ליציבות המכנית של עמוד השדרה. מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי חדשני של זיהום שתל עמוד השדרה (SII) שנוצר כדי לספק כלי invivo זול, מהיר ומדויק לבדיקת טיפולים פוטנציאליים ואסטרטגיות טיפול בזיהומים של שתלי עמוד השדרה.

בשיטה זו, אנו מציגים מודל של ניתוחי עמוד שדרה בגישה אחורית שבו חוט k מפלדת אל-חלד מועתק לתהליך עמוד השדרה L4 של עכברי בר בני 12 שבועות מסוג C57BL/6J ומחוסן ב-1 x 10³ CFU של זן ביולומינסנטי של חיידקי Staphylococcus aureus Xen36. לאחר מכן עכברים מצולמים לאורך, עבור bioluminescence in vivo בימים 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ו-35. אותות דימות ביולומינסנציה (BLI) משדה ראייה סטנדרטי מכומתים כדי למדוד עומס חיידקי in vivo.

כדי לכמת חיידקים הנצמדים לשתלים ולרקמה הפרי-שתלית, ממיתים עכברים וקוצרים את השתל ואת הרקמה הרכה שמסביבו. חיידקים מנותקים מהשתל על ידי סוניקציה, מתורבתים במשך הלילה ולאחר מכן יחידות יוצרות מושבה (CFUs) נספרות. התוצאות המתקבלות משיטה זו כוללות ספירות חיידקים אורכיות כפי שנמדדו על ידי in vivo S. aureus bioluminescence (שטף מרבי ממוצע) וספירות CFU לאחר המתת חסד.

בעוד שמודלים קודמים של בעלי חיים של זיהום מכשור בעמוד השדרה כללו ניתוח פולשני של רקמות ex vivo, מודל העכבר של מכון התקנים המוצג במאמר זה ממנף הדמיה אופטית לא פולשנית בזמן אמת in vivo של חיידקים ביולומינסנטיים כדי להחליף מחקר רקמות סטטיות. היישומים של המודל הם רחבים ועשויים לכלול שימוש בזני חיידקים ביולומינסנטיים חלופיים, שילוב סוגים אחרים של עכברים מהונדסים גנטית כדי לחקור בו זמנית את התגובה החיסונית של המאכסן, והערכת שיטות אבחון וטיפול חדשות או חקירה כגון אנטיביוטיקה או ציפויי שתלים.

Introduction

מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי חדשני של זיהום שתל בעמוד השדרה (SII). מודל זה תוכנן לספק כלי זול ומדויק להערכה גמישה של ההשפעה של משתנים מארחים, פתוגנים ו / או שתלים in vivo. בחינת טיפולים פוטנציאליים ואסטרטגיות טיפול לזיהומים של שתלי עמוד השדרה במודל זה נועדה להנחות את פיתוח המחקר לפני היישום במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים.

זיהום הקשור לשתלים לאחר ניתוח בעמוד השדרה הוא סיבוך הרסני ולמרבה הצער מתרחש בכ-3-8% מהמטופלים שעברו ניתוח אלקטיבי בעמוד השדרה 1,2,3,4,5 ועד 65% מהמטופלים שעברו ניתוח רב-שלבי או רוויזיה 6. טיפול בזיהומים של שתלי עמוד השדרה דורש לעתים קרובות אשפוזים מרובים, ניתוחים מרובים וטיפול אנטיביוטי ממושך. מכון התקנים מבשר על תוצאות גרועות של מטופלים, כולל פגיעה נוירולוגית, נכות וסיכון מוגבר לתמותה. ניהול מכון התקנים יקר ביותר ועולה למעלה מ-900,000 דולר למטופל⁷.

סטפילוקוקוס זהוב הוא הפתוגן האלים הנפוץ ביותר של מכון התקנים 8,9,10,11. חיידקים יכולים לזרוע את החומרה ישירות במהלך הניתוח, דרך הפצע בתקופה שלאחר הניתוח, או מאוחר יותר באמצעות התפשטות hematogenous. בנוכחות שתלי מתכת, S. aureus יוצרים ביופילם המגן על החיידקים מפני טיפול אנטיביוטי ותאים חיסוניים. בעוד הסרת חומרה נגועה עשויה לסייע במיגור יעיל של זיהום, זה לעתים קרובות לא אפשרי בעמוד השדרה מבלי לגרום לערעור יציבות ולהסתכן בפגיעה נוירולוגית¹².

בהיעדר שתילה של חומרה נגועה, נדרשות גישות חדשניות למניעה, גילוי וטיפול במכון התקנים. מבחינה היסטורית, היו מודלים מוגבלים של בעלי חיים של מכון התקנים כדי להעריך ביעילות את הבטיחות והיעילות של טיפולים חדשניים. מודלים קודמים של בעלי חיים במכון התקנים דורשים מספר רב של בעלי חיים ואיסוף נקודות נתונים הדורשות המתת חסד כולל ספירת מושבות, היסטולוגיה ותרבות^13,14,15. בהיעדר ניטור אורכי in vivo, מודלים אלה מספקים נקודת נתונים אחת בלבד לכל בעל חיים ולכן הם יקרים ולא יעילים.

עבודה קודמת שחקרה מודל עכברי של זיהום ארתרופלסטי בברך ביססה את הערך והדיוק של הדמיה אופטית לא פולשנית in vivo לניטור אורכי של עומס זיהום¹⁶. זיהוי ביולומינסנציה מאפשר לכמת את העומס החיידקי על פני מסלול זמן אורכי בחיה אחת באופן הומני, מדויק ויעיל. יתר על כן, מחקרים קודמים הדגימו מתאם גבוה בין ביולומינסנציה in vivo לבין CFUs הדבקים בשתלים¹⁷. היכולת לעקוב אחר זיהום לאורך זמן, הובילה להבנה מורכבת יותר של זיהום הקשור לשתלים. בנוסף, ניטור זיהום אורכי בדרך זו, איפשר את היעילות של טיפול אנטיביוטי ומיקרוביאלים חדשים להיות מוערך במדויק^16,17,18.

תוך מינוף כלים אלה, פיתחנו ותיקפנו מודל של זיהום בשתל עמוד השדרה לאחר הניתוח. בשיטה שהוצגה, אנו משתמשים בחיסון של S. aureus Xen36 ביולומינסנט כדי לבסס מודל עכבר in vivo של מכון התקנים לניטור אורכי של עומס חיידקי^16,17,18. מודל חדשני זה מספק כלי רב ערך לבדיקה יעילה של אסטרטגיות זיהוי, מניעה וטיפול פוטנציאליות עבור מכון התקנים לפני יישומן במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו בהתאם קפדנית לנוהג טוב של בעלי חיים כמוגדר בתקנות הפדרליות כמפורט בחוק רווחת בעלי חיים (AWA), המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה משנת 1996, מדיניות PHS לטיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה, כמו גם המדיניות והנהלים של המוסד כמפורט במדריך ההדרכה לטיפול ושימוש בבעלי חיים, וכל עבודת בעלי החיים אושרה על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (ARC).

1. בחירת זן S. aureus bioluminescent

1. השתמש בזן S. aureus Xen36 הביולומינסנטי כחיסון המעניין.
   הערה: זן זה נגזר מהזן ההורי S. aureus ATCC-49525, שהוא מבודד קליני מחולה ספיגה. ס. אוראוס Xen36 משתמש באופן ייחודי באופרון LuxABCDE, אשר ממוטב ומשולב בפלסמיד המקורי של המארח. ¹⁹ כתוצאה מכך, זן Xen36 מסוגל לייצר אור ביו-לומינסנטי כחול-ירוק עם פליטת שיא של אורך גל של 490 ננומטר. אות פליטה זה מיוצר רק על ידי אורגניזמים חיידקיים חיים פעילים מטבולית.

2. הכנת ס. אאורוס לחיסון

1. הוסף 200 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין למרק לוריא בתוספת 1.5% אגר כדי לבודד S. aureus Xen36 ממזהמים פוטנציאליים, תוך שימוש בגן עמידות לקנמיצין הקשור ללוקס אופרון¹⁹.
2. פזרו את חיידקי S. aureus Xen36 על צלחות אגר סויה טריפטיות (ציר סויה טריפטי [TSB] בתוספת 1.5% אגר) ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 12-16 שעות.
3. בודד מושבות בודדות של S. aureus Xen36 ותרבית בנפרד ב- TSB למשך 12-16 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד (200 סל"ד).
4. לדלל את התרבית המתקבלת ביחס של 1:50.
5. תרבית למשך שעתיים נוספות ב-37°C לבידוד חיידקי השלב המידלוגריתמי.
6. כדור, השהיה מחדש ושטיפת חיידקים במי מלח חוצצים פוספט (PBS) שלוש פעמים.
7. מדוד את הספיגה ב- 600 ננומטר. OD600 האידיאלי הוא בין 0.700 ל 0.750 אשר מתאים 4x10⁵ CFU/mL. בצע דילול סדרתי כדי להשיג את החיסון החיידקי הרצוי (1 x 10³ CFU/2 μL).
   הערה: הריכוז האופטימלי של Xen36 ליצירת זיהום כרוני נמצא 1 x 10³ CFU. מינון נמוך יותר של חיידקים נוקה על ידי מערכת החיסון של המאכסן ומינון גבוה יותר גרם להתמוטטות פצעים. פירוק פצעים אינו מבדיל בין זיהום עמוק בשתל לבין זיהום פצע שטחי, ולכן נמנע במודל זה (איור 1)²⁰.

3. עכברים

1. השתמשו בעכברי בר זכרים בני 12 שבועות מסוג C57BL/6J.
2. עכברי בית בכלובים עם מקסימום של 4 בכל פעם.
3. יש לשמור על זמינות המים בכל עת. שמור על מחזור אור/חושך של 12 שעות ואל תבצע ניסויים במהלך השלב החשוך של המחזור.
4. השתמשו בצ'או ללא אספסת להאכלה עקב הפרעה אפשרית לאיתות פלואורסצנטי.
5. בקש ממחקר או צוות וטרינרי להעריך עכברים מדי יום כדי להבטיח את רווחתם של בעלי החיים לאורך כל הניסוי.

4. הליכים כירורגיים בעכבר

1. יש להשרות הרדמה על ידי הנחת עכברים בתא איזופלורן (2%) למשך כ-5 דקות. ודא עומק הרדמה מתאים על ידי ניטור הנשימה כדי להישאר קצבית ואיטית יותר מאשר כאשר ער ולא משתנה בתגובה לגירויים מזיקים (למשל, מניפולציה כירורגית, צביטת בוהן).
2. מעבירים עכברים מורדמים לתחנת הכנה ומסירים שיער מהעצה לעמוד השדרה החזי העליון בעזרת קוצצי מכרסמים.
3. נקו ועיקרו את העור בשטיפות משולשות של תמיסת בטדין לסירוגין ואלכוהול איזופרופיל.
4. העברת עכברים מורדמים ומעוקרים במצב נוטה למיטת ניתוח סטרילית תוך שמירה על הרדמה עם מתן איזופלורן בשאיפה (2%) דרך חרוט האף.
5. כופף באופן מקסימלי את הירכיים וזהה את מיקום הברך בגובה עמוד השדרה כדי לדמות בקירוב את גוף החוליה המותני 4.
6. בצע חתך אורכי של 2 ס"מ דרך העור עם אזמל כירורגי 15 להבים.
7. למשש את התהליכים בעמוד השדרה כדי לאשר את קו האמצע ולהמשיך את החתך עד העצם.
8. לנתח subperiosteally בצד ימין של תהליך עמוד השדרה L4, הרחבת לרוחב לתהליך הרוחבי.
9. מעבירים תפר קלוע נספג במידה 5-0 וקאודאד לגוף L4 דרך הפאשיה ומשאירים פתוחים, לקראת סגירה עתידית.
10. באמצעות מחט עמוד שדרה 25 G, בצע את התהליך הספינוסי של L4 באמצעות מחט עמוד שדרה 25 G והכנס שתל נירוסטה "בצורת L" בקוטר 0.1 מ"מ ובאורך 1 ס"מ לאורך הלמינה עם הזרוע הארוכה המניחה את הצפלדה.
11. חסן את השתל עם 1 x 10³ CFUs/2 μL bioluminescent S. aureus Xen36, תוך הקפדה על כך שכל התמיסה תבוא במגע עם השתל.
12. יש להמתין כ-10 שניות לפני קשירת התפר הנספג שעבר קודם לכן לאחר החיסון כדי להבטיח הכלה של החיסון על השתל.
13. סגור את העור באופנת ריצה עם תפר נספג.
14. מתן תרופות כאב באמצעות הזרקה תת עורית של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) מיד postop ולאחר מכן כל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר מכן.
15. יש לשחזר עכברים על כרית חימום ולפקח על החזרה לפעילות רגילה.
16. השג צילומי רנטגן לאחר הניתוח כדי לאשר את המיקום המתאים של השתל.

5. הדמיה ביולומינסנציה אורכית In vivo למדידת עומס חיידקי

1. מרדימים עכברים עם איזופלורן בשאיפה (2%). ודא עומק הרדמה מתאים על ידי ניטור הנשימה כדי להישאר קצבית ואיטית יותר מאשר כאשר ער ולא משתנה בתגובה לגירויים מזיקים (למשל, מניפולציה כירורגית, צביטת בוהן).
2. הסר שיער מן העצה אל עמוד השדרה החזי העליון עם קוצץ מכרסמים.
3. העמיס עכברים על שדה הראייה של פלטפורמת הדמיה ביולומינסנטית כדי לבצע דימות ביולומינסנציה in vivo (BLI)¹⁹.
4. לכוד אות ביולומינסנטי על פני זמן רכישה של 5 דקות. השתמש בהגדרות binning גדולות עם שדה ראייה של 15 ס"מ (B).
5. חזור על שלבים 5.1-5.4 בימים 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ו- 35 (או ימים אחרים בהתבסס על תכנון ניסוי ספציפי) כדי לפקח על עומס חיידקי.
6. הצג נתוני BLI באמצעות סקאלת צבעים ושכבת-על על תצלום בגווני אפור. בודד אזור עניין סטנדרטי (ROI) באמצעות תוכנת BLI כדי לכמת BLI בשטף כולל (פוטונים לשנייה) או בשטף מרבי ממוצע (פוטונים/שנייה/סנטימטר²/סטרדיאן).

6. כימות חיידקים הנצמדים לשתלים ולרקמות הסובבות אותם

1. יש להרדים עכברים ב-POD 35 או בתאריך חלופי לאחר הניתוח עם חשיפה לפחמן דו-חמצני בהתאם להנחיות AVMA. לאשר המתת חסד עם נקע צוואר הרחם משני.
2. לעקר את העור הגבי לפי שלב 4.3 ולמקם את העכבר הנוטה לשדה ניתוחי סטרילי.
3. חותכים בחדות את החתך הקודם באמצעות אזמל כירורגי בעל 15 להבים.
4. השתמש במספריים סטריליים כדי לנתח בבוטות את תהליך עמוד השדרה L4 ולזהות את השתל הניתוחי.
5. השתמש בדרייבר מחט כדי לסובב ולהסיר בעדינות את השתל ממקומו בתהליך עמוד השדרה L4.
6. באמצעות מלקחיים ומספריים סטריליים, קוצרים כ-0.1 גרם של עצם תהליך ספינוסי ורקמות רכות סביב השתל הניתוחי ומניחים ב-1 מ"ל PBS בצינור קרנף חרוטי קטן עם 4 חרוזים הומוגניים חדים.
7. רשום משקל של רקמה רכה על ידי שקילת צינור חרוטי לפני ואחרי הקציר.
8. הניחו את השתל ב-0.5 מ"ל של 0.3% Tween-80 ב-TSB ובצעו סוניקציה למשך 15 דקות.
9. מערבלים את מתלה השתל שנוצר למשך 2 דקות ותרבית לילה למשך 12-16 שעות.
10. הומוגניזציה של הרקמה הרכה ותהליכים בעמוד השדרה שהונחו בעבר ב- PBS של 1 מ"ל סביב השתל באמצעות הומוגנייזר.
11. מערבלים את מתלה הרקמות הרכות המתקבל למשך 5 דקות ותרבית לילה למשך 12-16 שעות.
12. לאחר תרבית לילה, יש לספור CFU מהשתל ומהרקמות הסובבות אותו, בהתאמה. ערך מפורש כסך CFU/g שנקצר עבור רקמות רכות ו-CFU/mL עבור שתל סוני.

תוצאות

ההליך המוצג כאן שימש להערכת היעילות של משטרי אנטיביוטיקה במודל עכבר in vivo של מכון התקנים. באופן ספציפי, היעילות של טיפול אנטיביוטי משולב vancomycin ו rifampin הושוותה מונותרפיה vancomycin ובקרות נגועות לא מטופלות.

לפני הניתוח, עכברים חולקו באקראי לטיפול משולב, מונותרפיה או בקרה נגועה. נית...

Discussion

זיהומים הקשורים לשתלים בעמוד השדרה מבשרים תוצאות גרועות עבור חולים 1,2,3,4,5. שלא כמו אזורים רבים אחרים בגוף, חומרה נגועה בעמוד השדרה לעתים קרובות לא ניתן להסיר בשל הסיכון של חוסר יציבות ופגיעה נוירולוג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP