שיטה מתוקנת לגרימת ימפתית משנית בתוך הגפיים של עכברים

Summary

מודל זה חיה מאפשר לחוקרים לגרום מימפתית משני משמעותי מבחינה סטטיסטית בתוך האיבר הארוך של עכברים, שנמשך לפחות 8 שבועות. המודל יכול לשמש כדי ללמוד את הפתופסולוגיה של ימפתית ולחקור אפשרויות טיפול הרומן.

Abstract

דגמי בעלי חיים הם בעלי חשיבות עליונה במחקר של ימפתית על מנת להבין את הפתופסולוגיה של המחלה, אלא גם כדי לחקור אפשרויות טיפול פוטנציאליות. מודל זה של העכבר מאפשר לחוקרים לגרום ימפתית משמעותי מתמשך לפחות 8 שבועות. ימפתית הוא המושרה באמצעות שילוב של הקרנות שבירה ואבלציה כירורגית של lymphatics. מודל זה דורש כי העכברים לקבל מנה של 10 אפור (Gy) קרינה לפני ואחרי הניתוח. החלק הכירורגי של המודל כולל הארכה של שלושה כלי הלימפה החילוץ של שני בלוטות הלימפה מתוך הגוף החוצה העכבר. לאחר גישה לכלי מיקרו כירורגי מיקרוסקופ חיוני, בשל מבנים אנטומיים קטנים של עכברים. היתרון של מודל זה הוא שהוא יוצר ימפתית משמעותיים סטטיסטית, אשר מספק בסיס טוב להערכת אפשרויות טיפול שונות. זוהי גם אפשרות גדולה וזמינה בקלות עבור הכשרה מיקרוכירורגית. המגבלה של מודל זה היא כי ההליך יכול להיות ארוך זמן, במיוחד אם לא לתרגל מראש. המודל מביא לימפתית באופן אובייקטיבי בעכברים, מבלי לגרום לתחלואה קשה ונבדק בשלושה פרויקטים נפרדים.

Introduction

ימפתית מאופיין על ידי הצטברות של נוזל הלימפה המובילה נפיחות רקמות מקומי, אשר מתרחשת בעיקר בשל לקויי או זרימה של נוזל הלימפה בכלי הלימפה¹. זרימת הלימפה יכול להיות לקוי או מופרת על ידי זיהום, חסימה, פציעה או פגמים מולדים במערכת הלימפה². אלה התוצאה הסופית של הצטברות של נוזל הלימפה, אשר מוביל למצב כרוני של דלקת, וכתוצאה מכך פיברוזיס הבאים, כמו גם התצהיר של רקמת האדיפוז³. ניתן לסווג את ימפתית כימפתית ראשי או משני. ראשי ימפתית נגרמת על ידי חריגות התפתחותיות או מוטציה גנטית^2,4. ימפתית משנית מתרחשת בשל מחלה מערכתית הבסיסית, ניתוח או טראומה^2,4. ימפתית משנית היא הצורה הנפוצה ביותר של ימפתית בעולם². במדינות מפותחות, הגורם השכיח ביותר של ימפתית משנית הוא טיפול אונלוגי כגון הקרנות שדון ובלוטות הלימפה לנתיחה⁵. ימפתית הוא הנפוץ ביותר בקרב חולי סרטן השד, אבל יכול גם לפתח בחולים עם גניקולוגיות, מלנומה, שמין או סרטן צוואר^שישה. זה הציע כי מתוך כל הנשים שאובחנו עם סרטן השד, 21% יפתחו ימפתית⁷.

ימפתית יכול להיות מלחיץ את המטופל הן פיזית ופסיכולוגית. חולים עם ימפתית יש סיכון מוגבר של זיהום^5,8,9, איכות ירודה של החיים והוא יכול לפתח חרדה חברתית ותסמינים של דיכאון¹⁰. הסיבוכים של ימפתית כרונית להוביל לעלות גבוהה של טיפול ונטל מחלות מוגברת^9,11. ממצאים הציעו גם כי ימפתית עשוי להיות משויך לסיכון מוגבר למוות לאחר טיפול בסרטן השד¹². ניהול שמרני כגון דחיסה של האזור המושפע, ניקוז לימפה ידני וטיפוח כללי להישאר הגישה הקו הראשון. כרגע אין טיפול מרפא⁶. למרות שההתקדמות נעשתה בתחום הטיפול הכירורגי והרפואי, עדיין יש מקום לשיפור. מחקר נוסף, מתן תובנה הפתופסולוגיה והתקדמות של המחלה, יש צורך לאפשר לרופאים כדי לספק אפשרויות טיפול טוב יותר עבור חולים⁵.

מודלים בעלי חיים נמצאים בשימוש במחקרים פרה-קליניים כדי להבין את הפתופסיולוגיה של מחלות ולפתח אפשרויות טיפול פוטנציאליות. מספר מודלים ימפתית בעלי חיים שונים הוקמו כלבים^13,14, ארנבים¹⁵, כבשים¹⁶, חזירים^17,18 ומכרסמים^{19,20, . 21,22,23,24} המודל מכרסם נראה המודל החסכוני ביותר, כאשר בחקירת שחזור של תפקוד הלימפה, בשל מכרסמים נגיש בקלות יחסית נמוכה במחיר²⁵. רוב המודלים עכברים התמקדו גרימת ימפתית בזנב של עכברים^21,22,23. מודל הזנב הוא מאוד אמין, אבל את הטכניקה כירורגית מדויקת לגרימת ימפתית משתנה באופן משמעותי בחומר שפורסם קודם לכן. התוצאה היא תנודות במשך ובחוסן של הימפתית המפותחות שהוצגו בשנת הארגז הידוע²⁵. טכניקות שונות משמשות גם לגרימת ימפתית במודל הגוף החדש והם גם להניב תוצאות משתנות, אבל המודל החדש עשוי להיות קל יותר להבין מנקודת מבט טרנסלבית. הדגמים הקודמים ימפתית כבר ה על ידי החלטה ספונטנית ימפתית ולכן מודל ימפתית להיות לאחר וקבע צריך²⁵. החוקרים ניסו בעבר להגדיל את מינון הקרינה, כדי למנוע את הרזולוציה ימפתית ספונטנית, אבל זה הוביל לעתים קרובות לתחלואה חמורה הבאים²⁵.

מודל זה מביא לימפתית משמעותיים מבחינה סטטיסטית, מבלי לגרום לתחלואה חמורה, על ידי שילוב מיקרו-ניתוחים עם קרינה. המודל תוקן ממודל כירורגי קודם על ידי הוספת מנה של הקרנה הגורמת ימפתית, מבלי לגרום לתחלואה קשה²⁶. הוא גם מציע הזדמנות מצוינת להכשרה מיקרוכירורגית. לאחר גישה לציוד מיקרו כירורגי מיקרוסקופ הוא הכרחי, בשל מבנים אנטומיים קטנים של העכברים. הליך כירורגי ניתן לבצע כאשר המשתמש כבר לימד טכניקות מיקרו כירורגי בסיסיות, כגון תפירה עם כלי מיקרו כירורגי. המפעילים כי ביצעו את ההליך הזה כל קטעי וידאו הדרכה שנצפו על ידי acland על תנאי מראש של מיומנויות יקרוכירורגית (1981) וטכניקה מיקרותפר בסיסי (1985). אנו ממליצים לתרגל את ההליך הכירורגי 8-10 פעמים לפני השימוש בו במחקר. תרגול ההליך מבטיח כי בוצעו פחות טעויות ושהתהליך יכול להתבצע ביתר יעילות. כאשר שולט, ההליך הכירורגי ניתן לבצע בתוך 45 דקות.

Protocol

בעלי חיים היו שוכנו באוניברסיטת דרום דנמרק מתקן טיפול בעלי חיים לפי הנחיות מוסדי. כל ההליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי ניסויים בבעלי חיים Inspectorate, משרד הסביבה והמזון של דנמרק.

1. הקרנה טרום-ניתוח

הערה: הקרנה טרום ניתוח מתקיימת 7 ימים לפני הניתוח.

1. . לגרום להרדמה
   1. מניחים את העכבר בתוך תיבת אינדוקציה ולהגדיר את האידוי ל 3% isof, עם שיעור זרימת החמצן של 0.8 ליטר L/min כדי לגרום שאיפת הרדמה.
      הערה: לחילופין ניתן להשתמש בהרדמה, אך במשך הזמן הקצר של ההקרנה גורם להרדמה מספקת. לקבלת התוצאות המוצגות במאמר זה, השתמשו בעכברים C57BL6 נקביים בת 9 שבועות.
   2. ודא שהעכבר מורדם לגמרי על-ידי זנב או בדיקת צביטה.
2. הצב את העכבר להקרנה.
   1. אם מסומם לחלוטין, להזיז את העכבר מהתיבה אינדוקציה ולמקם אותו תחת המקור של קרינה במיקום פרקדן ולקבוע בעדינות את הגפיים האחוריות עם קלטת.
      הערה: העכבר יישאר מסומם למשך זמן קצר של הקרינה.
   2. במקום משטח עופרת עבה 1.5 מ"מ כדי להבטיח שרק האזור שעובר ניתוח (כלומר, האזור המעגלי עם קוטר של 25 מ"מ סביב הברך) מקבל הקרינה.
3. ניהול מנה של 10 הקרינה Gy בשיעור מינון של 5.11 Gy/מינימום (100 kVp, 10 mA).
   התראה: יש לנקוט אמצעי זהירות בטיחות בעת עבודה עם קרינה. במהלך ניסוי זה, כל הקרנה בוצעה בחדר מבודד קרינה, ומקור הקרינה הופעל רק כאשר כל אנשי הצוות עזבו ואטמו את החדר.
4. מניחים את העכבר חזרה בכלוב שלו.

2. התקנת ציוד

הערה: יש לבצע את הניתוח בחדר המוקדש להליכים כירורגיים. . המשטח הפעיל חייב להיות עקר

1. נקי ביסודיות כל משטחי האופרטיביים עם 70% אתנול. . תלבש רשת שיער וסרבל השתמש בכלי ניתוח סטריליים וכפפות סטרילי.
2. . הכן הרדמה
   1. לצייר 1 מ ל של פנטניל (0.315 mg/mL), 1 מ ל של midazolam (5 מ"ג/mL), ו 2 מ ל של מים סטריליים. השתמש מזרקים ומחטים שונים עבור הרכיבים השונים.
   2. מערבבים פנטניל ומים סטרילי על ידי ריקון איטי של מזרקים לתוך צינור זכוכית סטרילי. כאשר מעורב, להוסיף midazolam כדי להשלים את פתרון העבודה.
3. . הכן משככי כאבים
   1. לצייר את 0.2 mL של בופרנורפין (0.3 mg/ml) ו 2 מ ל של תמיסת מלח.
   2. ערבב את אמצעי האחסון על ידי ריקון איטי של מזרקים לתוך צינור זכוכית סטרילי כדי להשלים את פתרון העבודה.
4. הפעל את המיקרוסקופ וודא שהדלקת מספיקה, ושהמיקרוסקופ מותאם היטב לעיני המפעיל.
   הערה: יש לבצע את כל ההליכים הכירופלסטיים במיקרוסקופ הפעלה. טווח הגדלה של 4 x-25x מספיק.

3. הכנה

1. שקול את העכבר לפני הניתוח על ידי הצבת העכבר במיכל ריק בקנה מידה נקי.
2. . מנהל הרדמה
   1. לצייר את 0.1 mL של הרדמה לכל 10 גרם של משקל גוף העכבר. הכנס את מתת-עורי ההרדמה. כזריקת בולוס
   2. תן לעכבר לנוח בכלוב עם הרבה מצעים ומחסה במשך כ 10 דקות עד הרגעה מלאה. לבחון את עומק ההרדמה על ידי הערכת הרפיה שרירים ולבצע כפה או הזנב צביטה בדיקה.
3. כאשר הרגעה מלאה, לגלח את הגפיים האחוריות שנבחרו להליך באמצעות קוצץ חשמלי. הקפידו לנגב את השיער העודף.
4. הפעל את מכשיר החימום, כגון משטח חימום ומכסים אותו במטלית כירורגית.
5. הגדר את זרימת החמצן ל-0.8 L/min וחבר אותה באמצעות nosecone. . השתמש ב-100% חמצן
   הערה: nosecone הוא רק עבור משלוח חמצן ולא הרדמה.
6. החל משחה אופטלמולוגית ולהזריק 0.5 mL של תת-עורי מלוחים, רצוי בתוך הבית של העכבר, כדי למנוע hypovolemia במהלך הניתוח.
7. למקם את העכבר לניתוח.
   1. מניחים את העכבר על הבד כירורגי במצב פרקדן. . הניחו את הנוס1 מעל החוטם
   2. מתואם את סוף הגפיים בעדינות עם הקלטת כדי למנוע העכבר מתזוזה במהלך הניתוח.
   3. לחטא את העור באמצעות אלכוהול/כלורהקאיצין או אלכוהול/povidone יוד.

4. כירורגיה

הערה: בדוגמה זו, האיבר האחוריות השמאלי (כאשר העכבר מוצג במצב פרקדן), נבחר עבור ההליך.

1. . תעשו חתך עגול
   1. הרם את העור באמצעות מלקחיים חלקים והצמד לפתח קטן כ-5 מ"מ הקרוב ביותר לפוסות הפוכטיל.
   2. שקופית חדה מספריים לתוך הפתיחה ולהצמיד לעבר הברך כך החתך מסתיים ממש מעל הברך. הקפידו לא לנקב את כלי הקיבול על ידי הרמת העור בעזרת מלקחיים תוך כדי חיתוך.
   3. להזיז את העכבר לתנוחה נוטה ולהמשיך קליפ מן הברך לכיוון פוסות popliteal עד החתך ההיקפי הושלמה.
2. . מנתח את העור מתחת לברך
   1. בעדינות לנתח את האזור מתחת לברך עד כמה מילימטרים מעל הקרסול, על ידי פתיחה איטית וסגירה של מיקרו מספריים תוך הרמת העור עם מלקחיים.
   2. גזור בזהירות את הדבקויות הגלויות שנותרו באמצעות מיקרו-מספריים. השתמש מלוחים סטרילי באופן קבוע כדי לשמור על הרקמה לחות במהלך ההליך כולו.
3. לנתח את העור בשפה האבובית של החתך ההיקפי, כך שניתן לפרק אותו עם מפסק אלסטי.
   הערה: המפסק מאפשר למפעיל לראות טוב יותר את כלי הלימפה האבובית ומונע את השפה האבובית מן הסטה במהלך הניתוח.
4. בעוד שהוא עדיין במצב נוטה, לסובב את האיבר החוצה בעדינות ולקבוע אותו עם הקלטת, כך וריד ischiatic מוצג מן הנקודה ההכי הרבה ביותר של האזור חשוף לנקודה המרוחק ביותר.
5. הכנס כ 0.01 mL של פטנט כחול V תת-עורי בין הבוהן השנייה והשלישית באמצעות מזרק 0.5 mL עם מחט של 30 G. לחץ בעדינות על כף היד כמה פעמים כדי להפיץ את הפטנט הכחול V. המחש את כלי הלימפה ואת הצומת לימפה דרך המיקרוסקופ כמו הפטנט כחול V ממלא את כלי הלימפה.
   הערה: אם הצבע הכחול של כלי הלימפה דוהה במהלך ההליך, בעדינות לעסות את הכף כדי לקדם את ספיגת, במקום להזריק יותר כחול פטנטים V. שימוש עודף של פטנט כחול V עלול להוביל דליפה וצביעה של הרקמה סביב כלי הלימפה אשר עשוי סכן את ההליך.
6. אתר את המבנים החשובים: הצומת הלימפה popliteal (PLN), שני כלי הלימפה המרוחק לצומת לימפה (DLV1 ו DLV2), ואת כלי הלימפה אחד האבותיים לצומת לימפה (PLV).
   הערה: כל כלי הלימפה ניתן למצוא בסמוך לווריד ischiatic. כלי הלימפה האבודיים נמצא בדרך כלל המדילי לווריד, שני כלי הלימפה המרוחק נמצאים המדילי ולרוחב לווריד. הקיצורים של המבנים משמשים בווידאו הנלווה.
7. הגדלה בבהירות להמחיש את PLV ו לישער אותו עם תפר ניילון 10-0 באמצעות מיקרו מחט מחזיק מיקרומלקחיים. לחץ על כף היד כמה פעמים כדי להבטיח כי אין פטנט כחול V עובר האבובית לתפר.
   הערה: זמירה את השומן המקיף את כלי הלימפה עשוי להיות הכרחי.
8. חזור על שלב 4.7 לשער. את שני כלי הלימפה האלה לחץ על כפה מספר פעמים כדי להבטיח כי אין פטנט כחול V עובר האבופה לקשירה. אם כלי הלימפה לשקר קרוב וריד ischiatic נסה לבתר עוד יותר distally.
   הערה: בדוגמה זו, ניתן לראות שאחד מכלי הלימפה מתפוצץ עקב הקשירה המתמנת את זרימת הלימפה. כלי הלימפה לעתים קרובות לפצל מן הווריד יותר למטה.
9. הסר את הצומת לימפה popliteal.
   1. לאתר את הצומת לימפה popliteal ולחתוך חור קטן עם מיקרו מספריים כדי לגשת אליו ולהסיר אותו עם מיקרולקחיים מיקרו מספריים.
      הערה: הצומת לימפה יש פנינה חלקה כמו משטח בניגוד לרקמת השומן שמסביב.
   2. כדי לבדוק אם הרקמה הוסרה היא צומת לימפה, למקם אותו במבחנה מלאה במים.
      הערה: אם הרקמה מורכבת משומן, הרקמה תצוף. , אם הרקמה היא צומת לימפה. הוא ישקע לתחתית
10. להסיר את משטח שומן אינרירינאלה ואת הלימפה.
    1. לפני הסרת משטח שומן מעוקר, להשתמש מקריש דו קוטבית כדי לצרוב את כלי ריצה דרך השומן.
    2. לכרות את משטח השומן באמצעות מיקרולקחיים ומיקרומספריים. מהדק בעדינות את כלי הקיבול הקאולים הזורמים דרך השומן. לאחר מכן לכרות בעדינות את רקמת השומן באזור האינרירינרית.
       הערה: הצומת לימפה הממוקם בשומן הוא לעתים נדירות בצבע על ידי פטנט כחול V והוא יכול להיות קשה להבדיל מן השומן. הסרת משטח השומן בחתיכה אחת היא הדרך הטובה ביותר להבטיח את הצומת לימפה הוסר.
11. לשטוף את הרגל ביסודיות עם תמיסת מלח סטרילי ולאשר דרך המיקרוסקופ כי כל שערות קטנות וחלקיקים הוסרו ביסודיות מהאזור כירורגי כדי למנוע זיהום וזיהום הפצע. . תוודא שאין דימום פעיל
12. תפר את הקצוות העור למטה facia שריר עם תפרים ניילון 6-0 באמצעות מלקחיים ומחזיק מחט, עוזב פער של 2-3 מ"מ כדי להגביל את זרימת הלימפה שטחית.
    הערה: הווידאו הנלווה מציג דוגמה לתפרים גמורים.
13. . לנהל משככי כאבים לצייר עד 0.1 mL של כאבים לכל 30 גרם של משקל גוף העכבר. הכנס את התת-עורי כאבים. בתור זריקת בולוס
14. שוקלים את העכבר לאחר ניתוח להשוואה.
15. מניחים את העכבר בכלוב בארון מחומם להחלמה.

5. טיפול פוסט-פעיל

1. תן את העכברים בודדים בכלובים כדי להתאושש לאחר הניתוח עם מים ומזון libitum.
2. לנהל את המינון תת עורית של 0.02 mL של בופרנורפין 3x מדי יום עבור 3 ימים עבור כאבים.
3. עקוב אחר החיה מדי יום לריפוי הפצע המתאים, סימנים של כאב וזיהום. אם סימנים של זיהום נוכחים, להשתמש משחה אנטיביוטית.

6. הקרנה לאחר הניתוח

1. שלושה ימים לאחר הניתוח, חזרו על ההליך להקרנה טרום ניתוח (שלבים 1.1-1.4).

תוצאות

הליך זה שימש בעבר בשלושה ניסויים נפרדים. כל הניסויים נעשו על ידי חוקרים מובילים שונים אשר כולם מחברים שותפים של מאמר זה. בכל שלושת הניסויים, הטיפול הגדול נלקח לדבוק באותו תהליך כפי שמתואר בפרוטוקול זה. בכל שלושת הניסויים, ימפתית משנית המושרה באחד הגפיים האחרון בעוד האיבר ...

Discussion

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, חשוב כי החוקרים לנקוט אמצעי זהירות בטיחות כאשר עובדים עם רדיואקטיביות. שנית, במהלך הניתוח של פרוטוקול זה, חשוב להתחיל את ההליך ברגע שהעכבר מורדם ולסיים אותו ללא הפסקות מיותרות. זה חשוב להימנע מתקופה כירורגית ארוכה מדי עבור בעל החיים כדי למנוע ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb