שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

Summary

אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.

Abstract

מודלים עכבר הם בדיקות בחינת ביצועים עבור בלימודי סרטן vivo. עם זאת, עלות, זמן, שיקולים אתית הובילו שיחות חלופיות לvivo מודלים סרטניים. הקרום כוראלאלי ממברנה (CAM) המודל מספק חלופה זולה, מהירה המאפשרת ויזואליזציה ישירה של פיתוח הגידול מתאים הדמיה vivo. ככזה, ביקשו לפתח פרוטוקול מיטבי לחרט גינקולוגית ולהפוך גידולים אורולוגיים למודל זה, אשר אנו מציגים כאן. כ 7 ימים הפריה, תא האוויר מועבר לצד הvascularized של הביצה, שם נוצר פתח במעטפת. גידולים ממורין וקווי התאים האנושיים רקמות ראשיות ניתן לאחר מכן מצטלבים. אלה הם בדרך כלל שנזרע תערובת של מטריקס ובינוניות ובינוניים כדי למנוע פיזור הסלולר ולספק תמיכה מזינים עד התאים לגייס אספקת כלי דם. גידולים עשויים לצמוח לאחר מכן עד 14 ימים נוספים לפני בקיעה ביצה. על ידי שתילת תאים באופן בלתי נשכח עם גחלילית לוציפראז, הדמיה ביולומינסנציה יכול לשמש לאיתור רגיש של גידול בקרום והסרטן להתפשט לאורך העובר. מודל זה יכול לשמש לחקר הטווריגניות, פלישה, גרורות, ויעילות טיפולית. מודל מצלמת עוף דורש פחות זמן ומשאבים פיננסיים בהשוואה למודלים murine מסורתיים. מכיוון שהביצים הן בעיות חיסוני ועמידות חיסונית, רקמות מכל אורגניזם יכול להיות מושתל ללא בעלי חיים הטרנסגניים יקרים (למשל, עכברים) נדרש עבור השרשה של רקמות האדם. עם זאת, רבים מהיתרונות של מודל זה יכול להיות גם מגבלות, כולל את זמן הגידול הקצר הדור החיסוני/החיסונית המצב העמידות. בנוסף, למרות כל סוגי הגידולים המוצגים כאן בתוך מודל הקרום כוראלאלי העוף ממברנה, הם עושים זאת עם דרגות שונות של צמיחת הגידול.

Introduction

עכברים שימשו כאורגניזם מודל קלאסי לחקר מחלות אנוש, כולל ממאירות. כיונקים, הם חולקים. דמיון רב לבני אדם רמה גבוהה שלהם של דמיון גנטי אפשרה מניפולציה הטרנסגניים של הגנום העכבר כדי לספק תובנה עצומה לתוך השליטה הגנטית של מחלות האדם¹. ניסיון רב בטיפול של וניסויים עם עכברים הביא להיות מודל הבחירה למחקר ביו רפואי. עם זאת, בנוסף חששות מוסרית ומדעית לגבי דגמי murine, הם יכולים גם להיות יקרים למדי זמן רב^2,3. התפתחות של גידולים יכול לקחת שבועות או אפילו חודשים. הדיור במוסד אופייני בלבד יכול לרוץ במאות עד אלפי דולרים בעוד גידולים מתפתחים. סרטן השחלות הוא דוגמה של חיסרון זה משום הצמיחה שלה במודלים murine יכול בקלות לקחת חודשים. עיכובים התקדמות מחקר פוטנציאלי להשפיע על סרטן השחלות חולים ' בהתמדה נמוכה הישרדות שיעור 5 שנים של רק 47% (כלומר, עלייה בהישרדות של רק 10% מעל 30 שנים)⁴. באופן דומה, סרטן אורולוגי (כליות, ערמונית, וסרטן שלפוחית השתן) מהווים 19% של כל המקרים הסרטניים בארצות הברית ו -11% של מקרי מוות הקשורים לסרטן⁴. כך, רומן בגישה vivo ללמוד סרטן גינקולוגית ואורולוגיים יכול להציל מעבדה משמעותית זמן, עבודה, וכסף, גם אם מודל זה מיושם רק ניסויים הראשונית ההקרנה. בנוסף, ההאצה המתקבלת של ממצאי מחקר יכול להשפיע באופן משמעותי על 177,000 אנשים שאובחנו עם סרטן אלה מדי שנה.

מודל CAM עוף מציע יתרונות רבים הנוגעים בסוגיות הנ ל. מודל פופולרי כדי ללמוד אנגיוגנזה^5,6, הפלישה תא הגידול^7,8, גרורות^7,9, מודל העובר אפרוח מצלמת כבר שימש ללמוד צורות רבות של סרטן, כולל glioma^10,11,12, הראש והצוואר קרצינומה של תאים^13,14, לוקמיה^15,16, סרטן הלבלב¹⁷, ו סרטן המעי הגס¹⁸. בנוסף, מודלים קאם נוצרו עבור נוירובלסטומה¹⁹, לימפומה בורקיט²⁰, מלנומה²¹, וחתולים פיברוסרקומה²². מחקרים קודמים הציגו גם חרט סרטן שלפוחית השתן²³ ו סרטן הערמונית קווי התאים²⁴, אבל עם פרטי פרוטוקול מוגבל. לא רק שהביצים זולות בהרבה מעכברים, אבל הן גם מפיקות תוצאות מאוד מובנות^25,26. הם מראים פיתוח מהיר של ואסילטורה, והתפתחות הגידול יכולה להתרחש מהר ככל כמה ימים ולהיות דמיינו longitudinally דרך החלון הפתוח. עם מסגרת הזמן 21 יום בין הפריה ביצה הבקיעה, ניסויים ניתן להשלים בתוך כמה שבועות. יתרה מזאת, העלות הנמוכה, צורכי הדיור המוגבלים, וגודל קטן מאפשרים בקלות ניסויים בקנה מידה גדול שיהיה מיועד ללימודי העכבר.

לכן, ביקשו למטב את מודל CAM עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית סרטן. בשל המצב החיסוני של העובר הקודם עוף²⁷, שני העכבר ואת התאים האנושיים יכול להיות מושתל בקלות. ככזה, יש לנו בהצלחה לחרט מנופה השחלות, כליות, ערמונית, וסרטן שלפוחית השתן. עבור כל אחד מסוגי הגידולים האלה, מצלמת בקלות מקבל הוקמה murine ו/או האדם תאים הגידול קווי. חשוב מכך, שנקטפו טרי רקמות הגידול האנושי העיקרי יכול גם לעבור מתוך תאים מתעכל או פיסות של רקמה מוצקה עם שיעור גבוה של הצלחה. כל אחד מסוגי הסרטן האלה ומקורות התא דורש אופטימיזציה, אשר אנו חולקים כאן.

Protocol

כל הניסויים שהוצגו בזאת נבדקו ואושרו על ידי הוועדות האתיות המתאימות באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). השימוש deidentified, גידולים אנושיים העיקרי אושרה על ידי הלוח המוסדי באוניברסיטת UCLA (מספרי פרוטוקול 17-000037, 17-001169, ו 11-001363). ב UCLA, מחקר בעלי חיים סקירה ועדת אינו נדרש לניסויים באמצעות עוברי עוף; אישור פרוטוקול נדרש רק כאשר הביצים יוקעו. עם זאת, שיטות העבודה הטובות ביותר, כגון הנחיות AVMA עבור המתת-החסד של בעלי החיים, שימשו לטיפול בעוברי עוף מבחינה אתית וכדי להימנע מכאבים ככל האפשר. חוקרים מעודדים לאמת את דרישות הפיקוח במוסד שלהם לפני הייזום לימודים באמצעות מודלים CAM.

1. הכנת הביצים

1. לפני קבלת הביצים, להרכיב ולספק את אינקובטור ביצה 37.8 ° צ' (100 ° פ') עם 60-70% לחות לאחר הוראות היצרן.
   הערה: כדי למזער את סיכוני הזיהום, ניתן להשתמש במים אוטומטיים כדי לשלוט בלחות.
2. עם קבלת המופרית, רוד איילנד ביצי עוף אדום מספק ביצה מוסמך ברמה מעבדה, יבש לנגב את פני השטח של הפגזים עם נייר מגבות. ניתן להשתמש במגבת מנייר לחה בקלות כדי להסיר חומר מדבק. . תייבש מיד
   הערה: הרטבת מעטפת עם נוזל מתחת 43.3 ° c יכול להחדיר חיידקים לתוך הביצה. אם מישהו בוחר לשטוף או לחטא את הביצים, הטמפרטורה של הנוזל חייבת להיות בין 43.3-48.9 ° c. טמפרטורות גבוהות יותר. יכולות להרתיח את הביצים הבחירה של חיטוי צריך להיות מבוסס על המיקרואורגניזמים גרימת דאגה.
3. השתמש בעיפרון או בסמן כדי לתייג את התאריך על הביצה. זה נחשב יום פיתוח 0.
4. מניחים את הביצים לתוך החממה ביצה הדגירה לפחות 7 ימים עם סיבוב כדי לאפשר פיתוח מצלמת. מסובבי אוטומטי ניתן להשתמש, או הביצים ניתן לסובב 180 ° 2-3x ליום.

2. פתיחת הביצים

הערה: הפתיחה של הביצים יש לעשות כאשר CAM פיתחה במלואו. הדבר מתבצע בדרך כלל ביום הפיתוח 7 או 8.

1. לחטא ארונית ביו-בטיחות. עם 70% אתנול באופן דומה לחיטוי ומקום לתוך הקבינט אבטחה טיחות מתלה ביצים, ביצה כרודלר, סמן, הכלי רוטרי אלחוטי עם סיליקון קרביד שחיקה אבן וגלגל חיתוך עגול, 18 המחט G, בבקר pipet עם שפופרות ואקום רבע אינץ ', אריזת קלטת, משרד מספריים, מספריים מעוקלים, סמקן (או דומה) מלקחיים, כדורי כותנה, ו 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט. כל אימת שניתן, השתמשו בכלים סטריליים, חד פעמיים או אוטומטיים.
2. . כבה את מסובב הביצים מניחים כ-1-3 ביצים בארון הביוטיחות על מתלה הביצים. בזמן החשיכה, הניחו את הביצה כנגד קליפת הביצים כדי לזהות את תא האוויר. . סמן את המיקום של תא האוויר
   הערה: עוצמת התאורה מתוך ביצת הביצה היא חיונית להמחיש את הפנים של הביצה. אם תא האוויר או היום קשה באופן עקבי לראות, נסה להחליף את סוללות הביצית.
3. להעביר את הביצית ביצה על המעטפת כדי למצוא רשת כלי דם גדול. לסובב את הביצה במידת הצורך. במרכז הביצה יהיה מסעף ואצלב אידיאלי. השתמש בסמן כדי לצייר מעל היום כדי לשמש להשתלה.
4. . תדליק את האור במכסה המנוע באמצעות כלי רוטרי אלחוטי מצויד סיליקון קרביד האבן, לקדוח חור קטן במעטפת ישירות מעל המרכז של תא האוויר. תרגיל עד שרוב המעטפת הוסר, אך הקרום הפנימי הלבן אינו שלם.
   הערה: קידוח על פני תא האוויר לפני המיקוד היתרי ובנייה לקבוע את העובי של קליפת ביצה זו מעל תא האוויר ולא מעל מצלמת ה-CAM ו-vascuלטורה. אם המצלמה או הרשת מופרת, אזי הביצית אינה מסוגלת לשרשה.
5. לקדוח ולפתוח עוד חור קטן שבו החלון כלי הדם ייפתח כפי שנעשה עבור תא האוויר (שלב 2.4).
6. שימוש במחט של 18 גרם, לחדור בעדינות דרך הקרום הלבן, הפנימי מעל תא האוויר והסקובלטורה. אם לא יכול לחדור את המעטפת, אז לקדוח בזהירות קצת יותר. ודא כי הקרום הלבן, הפנימי (אך לא ה-CAM) משתבש לאורך כל האזור הקדח. אין צורך להסיר את פיסת הממברנה.
   הערה: אם המצלמה מופרת במהלך שלב זה, מחק את הביצה. נזק ניכר אם יש דם או אלבומין דולף מחור מקדח.
7. . כבה את האור במכסה המנוע באמצעות בדיקת הביצה, ודא כי תא האוויר הועבר מקצה הביצה לאזור שמעל ואצלב. במקרה הצורך, מניחים את הצינורות ואקום מוכנס לתוך בקר pipet סביב החור מעל תא האוויר המקורי בעדינות להחיל יניקה צרורות קצרים כדי להזיז את התא אוויר.
8. השתמש בסמן כדי לתאר את המיקום החדש של תא האוויר כ 0.5 ס מ בתוך גבול מצלמת האוויר. לצרף פיסת נייר אריזה. מעבר לתא האוויר החדש במקרה הצורך, השתמשו במספריים משרדיים סטנדרטיים כדי לחתוך את הקלטת בגודל המתאים.
   הערה: הקלטת יכולה לשבש את זרימת האוויר דרך המעטפת, ולא להיות גדולה מהנדרש כדי לכסות את תא האוויר במלואו.
9. החזר את הביצים לחממה להתחמם ללא סיבוב עם תא האוויר החדש הפונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 2.2-2.9 כדי לפתוח את הביצים הנותרות.
   הערה: ייתכן שהפרוטוקול מושהה כאן. אם בטוח האיכות של פיתוח פקה, מספר קטן של ביצים צריך להמשיך דרך שלב 2.16 לפני פתיחת הביצים הנותרות.
10. מניחים כ 1-3 ביצים עם תאים האוויר הועברו על מתלה הביצה בארון בטיחות.
    הערה: יש לנקוט בטיפול כדי למנוע את החדרת הזיהום לתוך הביצה הפתוחה. לכן, תמיד לפתוח ביצים בתוך הקבינט אבטחה טיחות, ולהשתמש בכלים וציוד סטרילי כל אימת שניתן.
11. באמצעות כלי רוטרי אלחוטי מצויד גלגל חיתוך עגול, לחתוך קו קטן על גבול תא האוויר שצויר בשלב 2.8. ודא כי זה כ 0.5 ס מ בתוך הגבול מצלמת אוויר בפועל כדי למנוע משבש את מצלמת ה-CAM או vascuלטורה. חותכים לגמרי דרך המעטפת אבל להיזהר לא לחדור עמוק מספיק כדי לשבש את מצלמת CAM או ואסילטורה.
12. באמצעות מספריים מעוקלים, לחתוך מסביב לתא האוויר הנותר כדי ליצור חלון במעטפת.
    הערה: אם דם או קרום נמצאים על המעטפת הוסרו, אז הביצה אינה מתאימה השרשה. אם חלק גבוה של הביצים לא נפתח באופן נקי, לשקול לחכות לפחות 1 יום נוסף כדי לפתוח את הביצים הנותרות כדי לאפשר היווצרות מצלמת טוב יותר. אם הקליפות של הביצים שנותרו לא פירסינג, הסיבוב של הביצים בתוך החממה צריך להיות מחודש.
13. . אמת את הכדאיות של העובר עוברים קיימא יציג בולטורה נרחבת, אלבומין ברור, תנועת העובר, או פעימת לב גלויה.
14. באמצעות מלקחיים של סמקן, משוך פיסות כותנה קטנות מכדור כותנה סטרילי. בעדינות למחוק את פני השטח CAM להסיר את אבק פגז ופסולת.
    הערה: יש לבצע את הסרת הפסולת באותו יום שבו נפתחים הביצים.
15. לכסות את פתיחת פגז עם פיסת אחד רבע של 6 x 7 ס"מ הסרט שקוף להתלבש.
16. . החזר את הביצים לחממה ודא שהביצה יושבת מאובטחת עם החלון הפתוח הפונה כלפי מעלה ומצלמת לא נוגעת ברוטב הסרט השקוף. השתמש פיסת מתלה ביצים, קצה של מסובבי הביצה, או עוד פריט מתאים לתמוך בביצים כי להמשיך להתגלגל.
17. חזור על שלבים 2.10-2.16 כדי לפתוח את כל הביצים שנותרו.
    הערה: הפתיחה של הביצים לא צריך להסתיים באותו יום כמו השרשה. מחכה לפחות יום אחד יכול לעזור לחסל ביצים אשר הכדאיות שלה נפרץ על ידי פתיחת המעטפת.

3. הכנת ההשעיה תא סרטן עבור השתלת (אפשרות 1)

הערה: יש להשלים את זה רק לפני ההשתלה, מה שצריך להתרחש באופן אידיאלי בין ימים 7 ו -10. נא עיין בהערות בתחילת שלב 5 או 6 לקבלת מידע נוסף אודות תאריך ההשתלה. גישה זו שימש עבור כל קווי התאים והגידול התרבותי של סרטן הכליה מעכל.

1. הפשרת פתרון מטריצה החילוץ על קרח.
2. השימוש בעיכול מכני ו/או אנזימטי מקבל השעיית תא בודד באמצעות שיטה המתאימה לסוג התא המושתל.
3. השהה מחדש את המספר הכולל של תאים שייושתל במדיום מתאים עבור השרשה. שתלים של 1-2 x 10⁶ תאים לכל ביצה הם טיפוסיים.
   הערה: המדיום המשמש השרשה של קווי התאים הוא בדרך כלל המדיום השלם המשמש לשימוש בתאים, המכיל FBS או החלפת נסיוב. ההשתלה של הגידול מעכל בדרך כלל משתמש בינוני שלם המשמש לקווי תאים culturing של אותו סוג סרטן. עם זאת, התאמות לניסוח בינוני יכול להתבצע אם יש צורך בניסויים. ההשפעות על התפתחות הגידול והצמיחה צריך להיות החלטי מדעית.
4. גלולה את התאים באמצעות מהירות צנטריפוגה ואת הזמן המתאים לתאים בשימוש. מהירויות טיפוסיות הן 250-300 x g, והשעות הן 5-10 דקות.
5. הסר את הסופרנטנט מתאי הקירור באמצעות ליטוף. מכנית מחדש את התאים במדיום שיורית באמצעות מצליף או ליטוף. . הניחו על הקרח להתקרר למדוד את עוצמת הקול של תאים בינונית באמצעות pipet בגודל כראוי.
6. לחשב אמצעי אחסון השרשה כגון 1-2 x 10⁶ תאים מושתלים באמצעי אחסון של 20-100 μl לכל ביצה עם ריכוז מטריצה הסופי של 2.7-4 Mg/mL חלבון. הוסף בינוני, כל גורמי הצמיחה הרצוי או תוספים, פתרון מטריצה מושג בהתאם לחישוב זה. לשמור על הקרח עד מוכן השתל.
   הערה: לחישובים בשלבים 3.3 ו 3.6, כמות נוספת של שתל ביצה אחת לפחות יש לשלב כדי להבטיח נפח הולם עבור כל הביצים בקבוצה. עבור השרשה של שורות התאים של סרטן השחלות (כלומר, SKOV3 ו-ID8), 10⁶ תאים לכל ביצה היו מושתלים. עבור השרשה של תא הכליה קרצינומה של קו התאים RENCA, תאים מתורבתים נגזר מתעכל העיקרי האנושי האדם קרצינומה של תאים, סרטן הערמונית קווי התאים (כלומר, CWR, C4-2, ו MyC-CaP), וסרטן שלפוחית השתן קווי תאים (כלומר, HT-1376 ו T24), 2 x 10⁶ תאים

4. הכנת חתיכות הגידול עבור השרשה (אופציה 2)

הערה: יש להשלים את זה רק לפני השרשה, מה שאמור להתרחש באופן אידיאלי בין ימים 7 ל -10. נא עיין בהערות בתחילת שלב 5 או 6 לקבלת מידע נוסף אודות תאריך ההשתלה. השחלות הראשונית סרטן שלפוחית השתן הושתל כמו חתיכות הגידול.

1. להפשיר פתרון מטריצה מטריתאי על קרח. דלל את ריכוז החלבון הסופי של 2.7-4 מ"ג/mL במדיום המתאים המכיל את כל גורמי הצמיחה הרצוי או תוספים. . המשיכו לאכול
   הערה: השרשה של חתיכות הגידול בדרך כלל משתמשת במדיום השלם המשמש שורות תא culturing של אותו סוג של סרטן. עם זאת, התאמות לניסוח בינוני יכול להיעשות אם יש צורך בניסויים. ההשפעות על התפתחות הגידול ואת הצמיחה צריך להיות מדעית נחוש.
2. , בעזרת אזמל או מספריים. חתיכות בלו מהגידול הטרי המידות האידיאליות נעות מ-2-5 מ"מ בכל צד. לשמור על הרקמות שקוע במדיום עד מוכן השתל.

5. השרשה באמצעות טבעת ללא מקל (אפשרות 1)

הערה: ניתן להשתיל תאים החל מיום הפיתוח 7 אם מצלמת ה-CAM מפותחת במלואה. השרשה יכולה להתרחש בכל עת לפני הבקיעה המאפשרת זמן מספיק להתפתחות הגידול והניסוי הרצוי, אבל לשים לב כי התאים החיסוניים של העובר מתחילים להיות נוכחים בסביבות היום 10 הפריה פוסט²⁷. שיעור גידול הגידול משתנה במידה ניכרת על ידי סוג התא והוא צריך להיות באופן אמפירי נחוש עבור סוג התא של עניין. סרטן השחלות ותאי סרטן הערמונית הושתל באמצעות שיטת הטבעת nonstick. שים לב שכאשר טבעת שאינה ממקל אינה זמינה, ניתן לגזור טיפ מלטף לגודל דומה ולהשתמש בו.

1. השתמש 70% אתנול כדי לחטא את הקבינט אבטחה טיחות ואת כל הכלים הנדרשים: מתלה ביצים, מלקחיים קשתית מעוקל, טבעות nonstick (1/4 אינץ ' בקוטר הפנימי), מערבבים זכוכית מוט, מתאים מאוד pipets מספריים וטיפים, 6 x 7 ס מ שקוף רוטב הסרט, המספריים במשרד, ו סמן או כאשר הדבר אפשרי, יש להשתמש בכלים סטריליים, חד פעמיים או באוטוקליים.
2. מניחים ביצים להיות מושתל על מתלה ביצה בארון בטיחות. לבחור מספר לניהול של ביצים. . עד שישה זה אופייני הימנע מאפשר הביצים להתקרר באופן ניכר בעת העבודה איתם.
3. להסיר את התחבושת הסרט שקוף מתוך המעטפת על ידי גלגול הקצוות לעבר החלון הפתוח כדי למנוע משיכת חלקים של פגז. בדוק כי הביצים הן קיימא ובריא. ביצים אידיאליות יהיה כלי גדול במרכז האזור הפתוח עם ספינות קטנות הסתעפות ממנו.
4. באמצעות מלקחיים קשתית מעוקל, מניחים טבעת סטרילית, לא מקל על מצלמת הכלי, באופן אידיאלי על פני נקודת הסתעפות. השתמש מהומה זכוכית סטרילית מוט כדי שבעדינות מצלמת CAM.
5. Pipet ההשעיה התא משלב 3.6 לתוך המרכז של טבעת nonstick. לחילופין, השתמש מלקחיים למקום פיסת הגידול משלב 4.2 לתוך המרכז של הטבעת nonstick ולכסות עם 20-50 μL של פתרון מטריצה החילוץ שנוצר בשלב 4.1.
6. לחתום את הפתיחה עם פיסת ברבעון אחד של 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט. לתייג את הביצים עם ייעוד השתל המתאים.
   הערה: מספור הביצים בתוך קבוצה מקלה על תצפיות האורך.
7. . החזר את הביצה לחממה ודא שפתח המעטפת יושב זקוף ושהביצה מאובטחת.
   הערה: ניתן להחזיר ביצים לאינקובטור ביצה ללא סיבוב. לחילופין, הכדאיות הגבוהה של החברה ניתן להשיג באמצעות 37-38 באינקובטור תא מעלות צלזיוס עם שיתוף₂ בוטלה ו דדי לפקח על הלחות, אשר צריך להיות 50%-80%.

6. השרשה ללא טבעת שאינה מסטיק (אפשרות 2)

הערה: ניתן להשתיל תאים החל מיום הפיתוח 7 אם מצלמת ה-CAM מפותחת במלואה. השרשה יכולה להתרחש בכל עת לפני הבקיעה המאפשרת זמן מספיק להתפתחות הגידול והניסוי הרצוי, אבל לשים לב כי התאים החיסוניים של העובר מתחילים להיות נוכחים בסביבות היום 10 הפריה פוסט²⁷. שיטה זו שימש השתלת תאים קרצינומה של תאי הכליה ואת התאים הסרטניים בשלפוחית השתן.

1. השתמש 70% אתנול כדי לחטא את הקבינט הביובטיחות ואת כל הכלים הנדרשים: המתאים ביותר לחיות מחמד וטיפים, מאכלים סטריליים 10-cm רקמות הרקמה, מתלה ביצים, 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט, מספריים במשרד, ו סמן.
2. החלשת הנפח של השעיית התא שנוצר בשלב 3.6 לתוך טיפ בגודל מתאים pipet (200 μL אופייני). בעוד מחזיק את החלק העליון של הקצה, בזהירות להוציא את הקצה מלטף ומקום אופקית לתוך מאכל סטרילי, 10 ס מ רקמות רקמה.
3. חזור על שלב 6.2 עבור כל הדגימות בתוך קבוצה עם מנה אחת לכל קבוצה.
4. מקום טיפים לתוך החממה 37 ° c עבור 15-30 דקות כדי לאפשר את מטריצת החילוץ באופן חלקי פולימוניזציה.
5. לאחר 15 דקות של דגירה, התחל לבדוק את הפילמור. כמות קטנה של נוזל בדרך כלל דולפת מתוך הטיפ כאשר מניחים על המנה. ניתן להשתמש בפלוניזציה של נוזל זה כדי לאמוד את מידת הפולימוניזציה של הנוזל שבתוך הקצה.
6. מניחים את הביצים להיות מושתל על מתלה ביצה בארון בטיחות. לבחור מספר לניהול של ביצים. . עד שישה זה אופייני הימנע מאפשר הביצים להתקרר באופן ניכר בעת העבודה איתם.
7. הסר את רוטב הסרט השקוף מהמעטפת על-ידי גלגול הקצוות לעבר החלון הפתוח. זה מונע משיכת חלקים של פגז.
8. בדוק כי הביצים הן קיימא ובריא. ביצים אידיאליות יהיה כלי גדול במרכז האזור הפתוח עם ספינות קטנות הסתעפות ממנו.
9. במקום אחד טיפ pipet על pipet בגודל כראוי. לדכא את הבוכנה כדי לאלץ את השעיית התא באופן חלקי הבולם על מצלמת מצלמה גדולה, מפותחת היטב, באופן אידיאלי על פני נקודת הסתעפות.
10. לחתום את הפתיחה עם פיסת ברבעון אחד של 6 x 7 ס מ שקוף ההלבשה הסרט.
11. התווית את הביצה עם ייעוד השתל המתאים.
    הערה: מספור הביצים בתוך קבוצה מקלה על תצפיות האורך.
12. . החזר את הביצה לחממה ודא שפתח המעטפת יושב זקוף ושהביצה מאובטחת.
    הערה: ניתן להחזיר ביצים לאינקובטור ביצה ייעודי ללא סיבוב. לחילופין, הכדאיות הגבוהה של החברה ניתן להשיג באמצעות 37-38 באינקובטור תא מעלות צלזיוס עם שיתוף₂ בוטלה ו דדי לפקח על הלחות, אשר צריך להיות 50%-80%.

7. הדמיה ביולומינסנציה של גחלילית לוציפראז מסומן גידולים

הערה: אם התאים המושתלת היו מובחנות באופן מאוד עם קידוד גנים גחלילית לוציפראז או גורמים הדמיה אחרים, אז הגידולים המתקבלים עשויים להיות דמיינו באמצעות הדמיה biלומינסנציה. הדמיה פלואורסצנטית אינו מומלץ על ביצים שלמות בשל רקע גבוה מן קליפת הביצה. זוהי ניתוח נקודות קצה, כאשר פתיחת המעטפת מפחיתה באופן דרסטי את ההישרדות. גידולים עשויים להיות בתמונה בכל עת המתאים לצרכים ניסיוניים ואת המהירות של צמיחת הגידול. עם זאת, בממוצע, ביצים לבקוע 21 ימים הפריה. לכן, יום הפיתוח 18 הוא נקודת קצה מתאימה כדי להימנע מבקיעה בלתי רצויה.

1. אם יש צורך, העברת ביצים. למתקן ההדמיה להקליט ביצים על מנות 10 ס מ התרבות הרקמה. החזר אותם 37.8 ° צ' (100 ° פ') אינקובטור עם מנגנון הסיבוב הוסר או בוטלה. הלחות אינה חיונית לתחבורה ולהדמיה.
2. באמצעות מלקחיים קשתית מעוקל, לדחוף בעדינות את מצלמת הרחק מן המעטפת עד מצלמת הוא סומק עם אלבומין והעובר. שימוש רחב מלקחיים הדגימה, לשבור פיסות של המעטפת כדי להרחיב את פתיחת המעטפת כראוי עבור הדמיית הגידול.
3. הכנס מינימום של 50 μL של 30 מ"ג/mL D-לוציפרמין לתוך אלבומין ביצה. כמות דומה של D-לluciferin יכול להיות גם מצנרת לתוך הטבעת לא מקל או על פני השטח של מצלמת באזור המכיל את התאים מושתל. הדבר מבטיח ביולומינציה אופטימלית בהעדר אספקת כלי דם אידיאלית. דגירה של 8 דקות
4. הכנס 20-50 μL של isof, לתוך אלבומין של הביצה כדי להחדיר את הביצה. לחלופין, ניתן להכניס את הביצה לחדר אינדוקציה המכיל 2-2.5% מתאדה. עומק הרדמה נאותה מתקבל כאשר התנועה העובריים מפסיקה.
   הערה: כמויות גדולות יותר של isofלורה ane (100 μL) ניתן להשתמש כדי להרוג את הביצה.
5. מניחים ביצים לתוך מכשיר דימות ביולומינציה ותמונה באמצעות הגדרות מתאימות כפי שנקבעו על ידי הוראות היצרן. עבור מחקר זה, השתמשו בזמן חשיפה של 1 דקות.
6. כדי לצלם את מצלמת העובר הנותרים, לפתוח את הביצה לתוך 10 ס מ העור הגידול הצלחת.
   1. אחוז בביצה באצבעות שתי הידיים על החלק התחתון של הביצה ליד באמצע הביצה והאגודלים משני צדי פתח המעטפת.
   2. בעדינות לפרק את שני החצאים של הביצה עם האגודלים תוך כדי לחיצה עדינה לתוך הביצה עם האצבעות.
   3. כאשר הפגז הוא כמעט חצי מופרדים מתוך מצלמת והעובר, להפוך את הביצה הפוכה מעל הצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה.
   4. המשך להפריד את החצאים של המעטפת. אם מצלמת CAM מנדבק בתוך המעטפת, בעדינות להשתמש באצבעות כדי לדחוף את מצלמת הרחק מן המעטפת.
   5. העובר עשוי להפוך לתבשיל אחר אם יש צורך.
   6. במקרה הצורך, ניתן לנהל את isofלוריאן נוספים כמו בשלב 7.4.

8. קציר הגידול

הערה: גידולים ניתן לקצור בכל עת המתאים לצרכים הניסיוניים ואת מהירות צמיחת הגידול. עם זאת, בממוצע, ביצים לבקוע 21 ימים הפריה. לכן, יום הפיתוח 18 הוא נקודת קצה מתאימה כדי להימנע מבקיעה בלתי רצויה.

1. לתפוס את הגידול עם מלקחיים. באמצעות מספריים (מספריים איריס האביב לעבוד היטב) או אזמל, גידול הבלו בזהירות מ CAM.
2. אם הגידול כבר התמרה עם גן לוציא גחלילית, הדמיה מחדש ניתן לבצע כדי לוודא הסרה מוצלחת של גידולים קשים לדמיין.
   הערה: גידולים מסוימים ניתן לנתח על ידי כל שיטה המתאימה לניסוי מסוים. גידולים ניתן גם להשתיל מחדש לתוך CAM או עכברים. כדי לאשר את זהות הגידול, גידולים עשויים להיות קבוע, פרפין מוטבע, ונבדק עם המטאוקסילין ו אאוזין או אימונוהיסטוכימיה כימיקלים.

תוצאות

עד כה, מצאנו את השיטה הזאת של השרשה כדי להצליח עבור סרטן השחלות, כליה, ערמונית, ושלפוחית השתן. כל אחד מהם היה מיטבי כדי לזהות תנאים ספציפיים לשרשה, למרות שייתכנו גמישות. של סוגי גידולים נבדק, הצמיחה סרטן השחלות היה הרבה פחות מבוטא ובדרך כלל לא גלוי ללא סיוע של הדמיה ביולומינ...

Discussion

הרחבת הגידול וחרט באמצעות מודל מצלמת ההיתרים מהירה יותר הנצפה ישירות הגידול מאשר קיים בדגמי בעלי חיים vivo. בנוסף, עלויות הן נמוכות באופן משמעותי לאחר הרכישה הראשונית של ציוד הושלם, במיוחד כאשר בהשוואה לעלות של עכברים הפרוצים החיסונית. המצב הראשוני והחיסוני של עוברי העוף מתיר בקלות את מצבה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.