השתלת מודל שומן לבן תת-עורית (ISWAT) מדגם ההשתלה של איויין מורנה

Summary

בפרוטוקול זה, שיטה של מורטין איון בידוד והשתלת לתוך רקמת השומן הלבן התת עורית מתוארת. האיים המבודדים של מורנה ממורג מושתלים לתוך המטופל מורין באמצעות קרום מרתף הידרוג'ל. רמת הגלוקוז בדם של המטופלים מנוטרים, ו ניתוח היסטולוגיה של שתלי איון מבוצע.

Abstract

השתלת איון הלבלב הוא טיפול רפואי מבוסס היטב עבור סוכרת סוג 1. קפסולת הכליה הוא האתר הנפוץ ביותר עבור השתלת איון במודלים מכרסמים. עם זאת, קפסולת הכליה הדוקה מגבילה את ההשתלה של איונים מספיקים בבעלי חיים גדולים ובני אדם. רקמת השומן הלבנה לבנה תת עורית (ISWAT), חלל תת עורי חדש, נמצא להיות אתר בעל ערך פוטנציאלי עבור השתלת איון. באתר זה יש אספקת דם טובה יותר מאשר חללים תת עורית אחרים. יתר על כן, ISWAT להכיל מסה איון גדול יותר מאשר קפסולת הכליה, והשתלת לתוך זה הוא פשוט. כתב יד זה מתאר את ההליך של בידוד איון העכבר והשתלת באתר ISWAT של העכבר סוכרתית התחביריים. באמצעות פרוטוקול זה, מורטין איונים הלבלב היו מבודדים על ידי העיכול הסטנדרטי קולגן ומטריצות קרום המרתף הידרוג'ל שימש לתיקון איונים מטוהרים באתר ISWAT. רמות הגלוקוז בדם של עכברי המטופל היו מנוטרים במשך יותר מ 100 ימים. שתלי איון אוחזרו ביום 100 לאחר ההשתלה ניתוח היסטולוגית. הפרוטוקול להשתלה איון באתר ISWAT המתואר בכתב יד זה הוא פשוט ואפקטיבי.

Introduction

השכיחות העולמית והשכיחות של סוכרת מסוג 1 (T1DM) עולים במהירות, על פי הנתונים הסטטיסטיים של הפדרציה הבינלאומית לסוכרת (צה"ל)¹. השתלת איון היא אחת הגישות המבטיחים ביותר לטיפול T1DM⁴. מאז פריצת הדרך הגדולה שנעשתה השתלת איון קליני באמצעות פרוטוקול אדמונטון² דווח, תפקוד הישרדות השתל איון ב T1DM הנמענים לאחר 5 שנים מגיע כעת על 50%³.

בעבר, מספר אתרי השתלת, כגון הכבד, כמוסת כליות, טחול, אזור תוך שרירי, מרחב תת עורי, מח עצם, ואת הכיס אונטל נחקרו עבור השתלת איון ניסיוני^5,6,7. חלק מהאתרים הנ ל נבדקו בהגדרות הקליניות⁸. למרות השתלת איון לתוך הכבד נשאר השיטה הנפוצה ביותר בשימוש ביישום קליני בהווה⁹, יש כמה בעיות חשובות לכתובת בעת שימוש באתר זה. למשל, כיצד להפחית את אובדן מוקדם של האיים המושתלים שנגרמו על ידי התגובה הדלקתית מיידית של דם בתיווך (IBMIR) ואספקת חמצון העניים^10,11 וכיצד לאחזר את שתלי איון במידת הצורך, כי הם מפזרים לוקליזציה בכבד. קפסולת הכליות עשויה להיות אתר אידיאלי עבור נמעני מכרסמים. עם זאת, הקפסולה כליה הדוקה מגביל את ההשתלה של איונים allogeneic מספקת בבני אדם, למרות שזה יכול להיות מתאים יותר עבור השתלת איון xenotransplantation בשל ההכנות מטוהרים מאוד חזירי איון בשימוש קליני^5,12. לכן, החיפוש אחר אתר מתאים יותר עבור השתלת איון הוא בעיצומו.

החלל התת עורי עשוי לשמש כאתר הישימה קלינית עבור השתלת איון בשל הנגישות שלה. עם זאת, את היעילות של השתלת איון לחלל תת עורית הוא נמוך מאוד, ובכך דורשים מספר גדול יחסית של איוקמיה הפוכה¹³. לאחרונה, צוות מחקר יפני מצא את ISWAT, אתר תת עורית הספר מעולה להשתלה איון במודל murine בהשוואה לכבד¹⁴. ISWAT מכיל את העורק האפיקיבה ואת הווריד, כך אספקת הדם העשיר עשוי להבטיח השתלת איון revascularization. בכתב יד זה, אנו מציעים שיטת השרשה קלה באמצעות מטריקס מטריצות קרום הידרוג'ל כדי לתקן איונים murine מורנה ב ISWAT. פרוטוקול זה מוכיח יעיל עבור השתלת איון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בפרוטוקול זה עקבו אחר עקרונות הרווחה של בעלי החיים של הוועדה לסקירת האתיקה של בית החולים השני של שנזן. מקבלי השתל איון ותורמים היו 8-עד 10-שבוע בן C57BL/6 עכברים זכרים שנרכשו מהמרכז הרפואי בעלי חיים בפרובינצית גואנג-דונג. ההליך של קצירת, בידוד, תרבות, או מינהל של תאים שנקטפו בוצעו בתנאים אספטי.

1. הכנה איון

1. הכנת הקולגן הסוג V פתרון עבודה. שוקלים את הסוג V ולפזר עם D-האנק של מאגר לריכוז הסופי של 1 מ"ג/mL, מסנן באמצעות 0.22 יקרומטר מזרק מונחה יחידת מסנן ומזרק 60 mL ו-precool קרח. יש צורך בנפח של 5 מ"ל עבור כל נמען תורם.
2. המתת חסד של 10 שבועות בן C57BL/6 עכבר זכר (23 ± 2 g) על ידי פריקה צוואר הרחם לרסס את החלק החיצוני של העכבר עם 75% אתנול במשך כמה שניות. בינתיים, למלא מזרק 5 מ ל עם הפתרון הקולגן ולשנות את המחט מזרק עם המחט קהה בוטה המחודד (32 G).
3. לשים את העכבר התורם בתנוחה פרקדן על שקית קרח תחת היקף החתך, לחתוך פתח רוחבי באמצעות ישר הצביע מספריים אופטלמולוגי בעור של אזור הערווה, ולחלוטין לממש את העור לעבר הראש. ואז לפתוח לחלוטין את הבטן דרך חתך V מאזור הערווה לתהליך xiphoid.
4. לחשוף את כיס המרה ואת כל אורכו של צינור המרה המשותף על ידי מיקום מחדש של הכבד. ואז להדק את פתיחת התריסריון של צינור המרה המשותף עם מהדק כלי הדם ולחתוך פתח קטן בכיס המרה.
   הערה: מיקום מחטים אופטימלי חשוב למנוע תזים לתוך הכבד והמרה.
5. צינורית צינור המרה המשותף מפתח כיס המרה באמצעות מחט זלוף בשלב 1.2, ואז להזריק ~ 2 mL של הפתרון הקולגן לתוך הלבלב. לאחר מכן, הפרידו את הלבלב המצעם מהמעיים, הקיבה והטחול באמצעות שני זוגות של מיקרופינצטה לא פולשנית, והכניסו אותו לשפופרת של 50 מ ל בקרח.
   הערה: חזור על התהליך עבור כל עכברי התורמים. שלושה משחטות ברציפות (לא יותר מ 40 דקות מלבד) ניתן לשלב לתוך צינור שפופרת של 50 mL מראש עם 3 מ ל של הפתרון הקולגן עבור כל לבלב.
6. הוסף 100 μL DNase I (10 מ"ג/mL) לכל הלבלב לתוך הצינורות החרויים 50 mL, ולעכל את המשחטות באמבט מים ב 37 ° צ' על ידי לטלטל את צינורות החרוט עבור 3 – 5 דקות.
   הערה: לנער את הצינורות במרץ 40 x במרווחי זמן של 10 כדי לנתק את הרקמה לפני העיכול באמבט מים, ולאחר מכן לטלטל את הצינורות בזמן העיכול.
7. הוסף פתרון עצירה (2.5 mg/mL BSA-HBSS פתרון) עד לנפח הסופי של 50 mL כדי לחסום את העיכול, ואת הדופק צנטריפוגה את הצינורות למהירות של 750 x g ב 4 ° c ולהפסיק במהירות.
8. יוצקים את supernatant ולשטוף את כדורי 2x על ידי השעיית מחדש בעדינות ב 15-25 מ ל של BSA-HBSS. הדופק צנטריפוגה את הצינור עם אותם תנאים מהירות כפי שמתואר בשלב 1.7 עבור 1 דקות.
9. יוצקים את הסופרנטאנט ואת הבריכה את כדורי שלושת הצינורות החרוטים לתוך צינורית חרוט 50 mL. השהה מחדש את כדורי בנפח כולל של 10 מ"ל של histopaque-1119. מערבבים הומוגנבאופן רציף, ברציפות להוסיף 5 מ ל של histopaque-1077 ו-5 מ ל של HBSS על ידי ליטוף לאט לאורך הצד של הצינור.
10. לסובב את הדגימות בצנטריפוגה ב 750 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ללא בלמים.
11. מביס את איונים מן HBSS/histopaque-1077 ממשק לתוך צינורית חרוט 50 mL באמצעות חד פעמי 5 מ ל הצינור פסטר, להוסיף BSA-HBSS לנפח הסופי של 50 mL, והדופק צנטריפוגה ב 750 x g ב 4 ° c.
12. שופכים את הסופרנטאנט ושוטפים את איואיי באמצעות 30 מ ל של BSA-HBSS. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 750 x g ב 4 ° c.
13. השעיה מחדש של איונים באמצעות 30 מ ל של תרבות בינונית (10% FBS-1% P/S-CMRL-1066) לצינור ולשפוך ב 10 ס מ קוטר התרבות הדוקה האור. תחת stereomicroscope, באמצעות 200 μL ג'ל טעינת pipet טיפים, לאסוף את איונים מן הפתרון מבוסס על המבנה שלהם (כלומר, מבחינה מעשית, לבן). לשים לתוך צלחת תרבות תא מטופל עם 10 מ ל של מדיום התרבות.
    הערה: איסוף הידיים השני יכול להתבצע אם הטוהר של איונים מטוהרים הראשון אינו אופטימלי לאחר הקטיף הראשון.
14. בדוק את הטוהר של האיים שנבחרו על ידי dithizone מכתים תחת מיקרוסקופ אור לזהות את הכדאיות של איונים על ידי fluorescein diאצטט (FDA)-propidium יודיד (PI) מכתים תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
15. תרבות האיים המבודדים בתווך תרבותי (כמו בשלב 1.13) בחממה ב 37 ° c, 95% air-5% CO₂ לפני ההשתלה.

2. ISWAT השתלת איון

1. לגרום לסוכרת בגבר בן 8 שבועות C57BL/6 עכברים (22 ± 2 גרם) על ידי הזרקה אחת של streptozotocin (STZ). ביום-4, מהר את העכברים ~ 4-6 h, לאחר מכן להכין 2% STZ פתרון באמצעות 0.1 M ציטראט מאגר (pH 4.4). שוקלים, להשעות מחדש במאגר, ולהזריק את העכברים intraperitoneally במינון של 180 מ"ג/ק"ג.
   הערה: הפתרון STZ צריך להיות טרי מוכן לפני השימוש מכוסה ברדיד אלומיניום עקב רגישות האור שלה. יש להשתמש בו מיד, כי היא תאבד פעילות בתוך 15 – 20 דקות.
2. ניקוב ורידים caudal של העכברים STZ-מוזרק לאסוף קצת דם בסביבות 10 בבוקר של יום -1 ויום 0 ולמדוד את רמת הגלוקוז בדם שאינם בצום באמצעות רצועת הבדיקה ומכשיר בסיסי לניטור הגלוקוז בדם. העכברים ישמשו כנמעני השתלת איון אם רמות הגלוקוז בדם של 2 ימי המבחן הרצופות הן לפחות 20 מ מול/L.
3. ביום 0, שקול וסמן את כל עכברי הנמען. הפנטוברביטל כל נמען באמצעות הזרקת 60 מ"ג/ק"ג לintraperitoneally נתרן.
   הערה: לנהל את הבוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה. אם לעכבר הנמען אין רפלקס גמילה, רמת ההרדמה מספיקה לניתוח. אם לא, ניהול נוסף 10 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל נתרן. פנטוברביטל נתרן בשימוש היה מדולל תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי בריכוז של 2% (m/v).
4. קח את ההידרוג'ל ממקפיא של 20 ° c ושמור אותו על הקרח כדי לאפשר את הפשרה. ההידרוג'ל הינו נוזלי בגובה של 4 עד 10 ° c והוא יחזק בטמפרטורה גבוהה יותר.
5. לאסוף ~ 450 – 500 המקבילה איון (IEQ) עבור כל נמען לתוך שפופרת 1.5 mL סטרילי מתחת לstereomicroscope (כמו בשלב 1.13) עם 200 μL של התרבות בינונית ולשמור על הקרח עד מוכן השתלת.
6. לנגב את האזור השמאלי הלבין של המטופל באמצעות 75% אתנול. מניחים אותו במצב פרקדן ולתקן את ארבעת הגפיים באמצעות קלטת כירורגית. לגלח את השיער סביב האתר כירורגי עם קוצץ חשמלי ולנקות את האזור עם שפתי-האור.
7. הפוך את חתך העור האנכי באזור זה באמצעות מספריים אופטלמולוגית ומיקרופינצטה לא פולשנית, לזהות את עורק הקיבה והווריד הנחותים באיזווואט, וליצור כיס קטן מעל כלי הדם.
8. ספין הצינור איים עבור 30 s ב 200 x g ולהסיר את supernatant ככל האפשר. מנושף 20 μL של הידרוג'ל מופל לחלוטין ולטעון אותו לתוך הצינור עם איונים. , להשהות את האיים בעדינות. להימנע מבועות
9. העבר את התערובת של איון-הידרוג'ל כולו בצינור לכיס (שלב 2.7) של המטופל עם טיפ 200 μL.
   הערה: תהליך זה דורש שני טכנאים, אחד להרים את הקצוות של הכיס באמצעות מיקרופינצטה לא פולשנית, והשני לאספקת תערובת איון לתוך הכיס.
10. הוסף 20 μL של צפלוספורין (~ 5 – 10 מ"ג) לתוך האתר השתלת לאחר התערובת איונים-הידרוג'ל הוא מתחזק לחלוטין, ולאחר מכן להשתמש בתפר כירורגי 5-0 לסגור את השריר והעור עם שיטת תפר רציפה.
    הערה: ההידרוג'ל צריך בערך 3 דקות כדי לגבש עקב טמפרטורת הגוף.
11. הציבו את המטופל בכלוב נקי והמשיכו להתחמם באמצעות משטח תרמי. המשך לעקוב עד שהנמען מתאושש במלואו ומתחיל לנוע באופן עצמאי. לאחר מכן לנהל 0.03 mg/ml Buprenorphine עם intraperitoneally מלוחים פיסיולוגיים, על פי 0.1 mg/ק"ג מינון.
12. חזור על שלבים 2.3 – 2.11 עבור כל עכבר נמען.
13. למדוד את רמות הגלוקוז בדם שאינם צום של עכברי הנמען (כמו בשלב 2.2) 3 – 4x בשבוע עבור החודש הראשון, ו-1x בשבוע לאחר מכן.
14. בסוף המעקב (100 ימים לאחר ההשתלה), תחת הרדמה (בוצע כמו בשלב 2.3) הבלו ISWAT הנושאת את השתל מהנמענים בעקבות הצעדים סטרילי המתואר בשלב 2.6. תקן את הרקמה בפורמאלין ופאראפורמלדהיד בהתאם לפרוטוקולים היסטלוגיים עבור המטאוקסילין והאאוזין (H & E) כתמים ואימונולואואורולוגיים של אינסולין וגלוגון.
15. להוסיף צפלוספורין ולסגור את החתך של הנמענים כמו בשלב 2.10, לאחר מכן להתכונן להחלמה כמו בשלב 2.11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שני הליכים מוצגים בפרוטוקול זה: הכנה מורנה איון השתלת איון לאתר ISWAT. , בהליך הראשון לאחר השימוש והעיכול עם מסוג V קולגן הפתרון, טיהור עם Histopaque-1119 ו Histopaque-1077 וצעד נוסף לקטוף יד, איונים murine מבודדים יהיה טהור מספיק עבור השתלת (כפי שמוצג באיור 1) ואת איונים מבודדים כי יש כדאיות גבוה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השתלת איון הלבלב הוא טיפול מבטיח לטיפול T1DM. ההשפעה של טיפול זה מושפע גורמים רבים ובחירת אתר אופטימלי עבור השרשה איון חשוב מאוד. האתר האנטומי האידיאלי עבור השתלת איון צריך את המאפיינים הבאים: נגישות להשתלה פשוטה, ביופסיה, והליכי אחזור השתל; סיבוכים מופחתים; שיעור הצלחה גבוהה של בקרת גלוקוז ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit	Merck Millipore	SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette	JingAn Biological, China	J00085
5 mL syringe	Szboon, China	20170829
50 mL conical tube	Corning	430829
5-0 surgical suture	sh-Jinhuan, China	CR537
60 mL syringe	Szboon, China	20170623
75% Ethanol	LIRCON, China	9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)	Invitrogen	A21202	Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody	Abcam	ab10988	Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody	Cell Signaling Technology	3014s	Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle	Oloey, China	005	32G, yellow
BSA	Meilune, China	MB4219
C57BL/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province		8~10 weeks
cell culture dish	BIOFIL, China	TCD000100	General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge	Thermo Scientific	ST16R
cephalosporin	Lukang medical, China	150303
CMRL-1066	Sigma-Aldrich	C0422
Codos Pet Clipper	Szcodos, China	CP-8000
collagenase Type V	Sigma	C9262
DAPI	Thermo Fisher	D1306
D-hank's buffer	Coolaber, China	PM5140-10
dithizone	Sigma-Aldrich	D5130
Dnase I	Sigma-Aldrich	D4263
Eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
FBS	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
fluorescein diacetate (FDA)	Thermo Fisher	F1303
fluorescent microscope	Leica	DMIL
gel-loading pipet tips	Corning	CLS4884
HBSS	Coolaber, China	PM5150-10
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology	14166S
HISTOPAQUE-1077	Sigma-Aldrich	RNBG0522
HISTOPAQUE-1119	Sigma-Aldrich	RNBG0536
Hydrogel	BD Biosciences	356234	Basement Membrane Matrix
Iodophor	LIRCON, China	5190313
light-tight culture dish	DVS, China	AN-5058548	self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape	Cofoe, China	K12001
non-invasive microtweezers	RWD Life Science	F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
ophthalmic scissors	RWD Life Science	S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin)	Gibco	15140-122
pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P-010
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
STZ (streptozotocin)	Sigma-Aldrich	S0130
Test Strip	GenUltimate	100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00007-2	Dilution (1:200)
vascular clamp	RWD Life Science	R31006-04