פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Summary

פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.

Abstract

מבוסס על תווית חינם מבוססי בחני משמשים יותר ויותר לפני באופן פולשני ליגולי מחקר המושרה gpcr בניסויים בתרבות התא. הגישה מספקת ניטור התא בזמן אמת עם רזולוציית הזמן תלויי התקן עד כמה עשרות אלפיות הראשונה והוא אוטומטי מאוד. עם זאת, כאשר מספרים לדוגמה לקבל גבוה (כגון, מחקרים מינון עבור ליגניות שונות), את העלות של מערכי האלקטרודה החד, כמו גם את רזולוציית הזמן הזמין עבור הקלטות היטב-by-היטב עשוי להיות מגביל. לכן, אנו כאן הצגת פרוטוקול אגוניסט טורי התוספת אשר יש את הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את הפלט של gpcr-התווית חינם. באמצעות פרוטוקול התוספת הטורית אגוניסט, אגוניסט gpcr נוסף ברצף בריכוזים גוברת לשכבת תא אחת ברציפות ניטור העכבה של המדגם (מצב אגוניסט). עם גישה טורית זו, כעת ניתן ליצור עקומת מינון מלא של תגובה עבור אגוניסט gpcr מתוך שכבת תא אחת בלבד. פרוטוקול התוספת הטורית של האגוניסט חל על סוגי צימוד מסוג GPCR שונים, G_q g_{/0 או g והוא} תואם לרמות ביטוי רקומביננטי ואנדוגני של הקולטן תחת המחקר. חסימת הקולטן על ידי האנטוניסטים GPCR הוא הניתן גם (מצב היריב).

Introduction

דו ח זה מציג תיאור מפורט של פרוטוקול התוספת הטורית שפותחה עבור כימות החלבון המושרה G-חלבונים בשילוב קולטן (GPCR) הפעלה בתאים מגודלים על ידי תווית ללא מדידות עכבה. מצמידים בחלבון G (GPCRs) מעורבים בהמון תפקודים פיזיולוגיים ומחלות אנושיות¹. בגלל זה והנגישות הטובה שלהם במשטח התאים, GPCRs הן אחת ממטרות הסמים החשובות ביותר. הערכה זו משתקפת במספר מוערך של ~ 700 תרופות שאושרו על-ידי GPCRs, שוות ערך ל-~ 35% שיתוף בכל התרופות המשווקים².

התפתחות התרופות החדשות כוללת שני תהליכים מרכזיים: (i) האפיון ההזדהות והפונקציונלי של מולקולות היעד הביולוגי ו-(ii) גילוי של חומרי הובלה חדשים והתפתחותם לתרופות בניהול. בשני התהליכים, נדרשות שיטות יעילות כדי להעריך את האינטראקציות של מטרות הסמים ואת תגובת המטה הביולוגית הבאה. בשלבים שונים של תהליך פיתוח תרופות טרום-קליני לעשות שימוש בשיטות ניתוח שונות החל ממחקרים ביוקולריות האינטראקציה בין התרופה והיעד, על פני מחקרים פונקציונליים על תאים בתרבות, לניסויים על חומר האיבר המגורש או בעלי חיים שלמים. הן, המשמעות הפיזיולוגית והמורכבות הביולוגית, מגדילות מהראשון ל^-3האחרון. למרות שזו המטרה הכוללת למזער ניסויים בבעלי חיים, מחקרים פרמקולוגיים המשתמשים באברים מבודדים מבעלי חיים מעבדתיים או אפילו בעלי חיים שלמים נחשבים בלתי נמנעים למאפיינים מקיפים של מועמדים חדשים לסמים. במונחים של הבדיקה האנליטית, לימודי האיברים הפרמקולוגיה מספקים תגובה פונקציונלית מההוליסטית ואינטגרטיבית של הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר. חיסרון של ניסויים כאלה הוא שהם לא תואמים הקרנת תפוקה גבוהה עבור טכני, כמו גם סיבות אתיות כבר הוחלף ברובו על ידי מחקרים המבוססים על התרבות תא מבחנה⁴.

שיטות כדי לכמת gpcr הפעלה בתרבויות תאים כוללים שונים מבוססי תוויות כימיים assays, אשר במפורש לזהות שליחים השני, המדינה זרחון במורד החלבונים איתות, הפעלת הפעלה דרך גורמים שעתוק מסוימים או ליגקין המושרה סחר הקולטן תאיים^4,5. החיסרון של התווית המבוססת על תוויות הוא הצורך לתייג את התאים עם צבעים שעלולים להזיק או סמנים רדיואקטיביים. זה דורש לעיתים קרובות להפעיל את התשובה כקביעת נקודת קצה-הגדרה לזמן חשיפה שיש לציין א פריורי. שימוש בנקודת קצה מבוססת תווית סובל מתזמון מאוד מצומצם ומוטה של הניסוי והסיכון שתוויות כימיות והבדיקות עלולות לשבש את הפיזיולוגיה של התא הרגיל – שעלולים להבחין בידי הניסוי.

בשנים האחרונות, לייבל ללא תווית עבור ניטור gpcr הפעלה התפתחה, כמו מבוססי עכבה טכניקות או שיטות אופטיות החלת מדריך גל^התהודההדרכה 5,⁶. התוויות של התאים הינם ניסויים שאינם נדרשים בגישות אלה. כמו אלה הקריאות הפיזיות לפעול על אותות משרעת נמוכה, שיטות כאלה נחשבות לא פולשנית, הם מאפשרים ניטור תאים רציף פוטנציאלי בזמן אמת וזמן התצפית מוגבל רק על ידי תרבות התא לא על ידי הבדיקה. בדומה לקריאות מאיברים שלמים, גישות ללא תווית בדרך כלל לדווח על תגובות התא הוליסטי , במורד הזרם של הפעלת הקולטן כאשר אינטגרציה לאורך כל רשת איתות מוביל לשינויים תלויי זמן אך לא ספציפיים במבנה התא או הפצה המוניים. בעוד מבוסס עכבה מבוססת למדוד את החתימה מדידות של שינויים בצורה תא^7,8, מדידות באמצעות מדריך גל התהודה המדורגים רגישים לשינויים במדד השבירה בממשק התא-מצע הנובע מפצה דינמית המסה (dmr)⁹. התו האינטגרטיבי הופך שיטות ללא תוויות רגישות מאוד לאירועים בתיווך הקולטן ללא קשר לסוג (s) של G חלבון (G_q, g_i/0, g_s, g_12/13) או β-מעורב בדירוג איתות⁶ ומתאים היטב לרמות ביטוי אנדוגני של הקולטן.

בתוך שיטת העכבה הסטנדרטית ללא תווית, התאים גדלים בגדול בצלחות מרובות-היטב עם אלקטרודות לסרט זהב ישור שהופקדו בתחתית כל באר¹⁰. אלה מערכי אלקטרודה מחוברים מנתח עכבה ואת התגובות התאים לגירוי ניסיוני נרשמים מבארות בודדות על ידי קריאות העכבה שנפתרו זמן. ב שיטת GPCR טיפוסית ליגונה מתווסף ריכוזים שונים בנפרד לכל אדם היטב. השינויים המושרה בקורס לאחר העכבה מנותח לאחר מכן ביחס לתכונות עקומות אופייני כגון שינוי האות המקסימלי, שטח תחת עיקול, שינוי האות בתוך מרווח זמן נתון או מדרון של עקומת בנקודת זמן מוגדר, על מנת לכמת את העוצמה של ligand יעילות¹¹.

עלות מערכי האלקטרודה עשויה להגביל את היישום של טכניקה זו בקמפיינים של הקרנת תפוקה גבוהה (hts). יתר על כן, עם מספר גדל והולך של דגימות להיות במקביל, המספר של מדידות בודדות עולה ובכך מפחית את רזולוציית הזמן הזמין עבור כל היטב בהדרגה-אפילו עבור הקלטות רב ערוצי האמנות. תחת תנאים כאלה מהיר התגובות התא ארעי עשוי לברוח מדידה. בנוסף, המקובל אחד היתרונות – גישה ריכוז אחת מטיל משמעות משמעותית הזמן והעלות על מעשה הגוף על שבב או על שבבים התפתחויות על שבב ביחס להתאמה שלהם בניתוח האינטראקציה LIGAND-gpcr.

מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול מינון חורג המאפשר הקלטה של מינון מלאה-תגובה עקומות של הפעלה GPCR המושרה של ליגיום בתוך מונאולאיירס תא תרבותי על ידי ברציפות ניטור עכבה של באר אחת בעוד ריכוז אגוניסט הוא מוגבר צעד. פרוטוקול התוספת של האגוניסט הטורי מגביר באופן משמעותי את התפוקה לכל היותר מריכוז אחד ועד 10 ריכוזים או יותר, כפי שמוצג בדוגמה הנוכחית של התאים האנושיים U-373 MG, אשר מבטאים באופן מובהק את הקולטן להיסטמין 1 (H1R). לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את התפוקה במחקרים של מינון ללא תווית, בעוד שרזולוציית הזמן נשמרת במקסימום האינסטרומנטלי.

Protocol

1. שזריעת תאים במערכים אלקטרודה

הערה: בחירת פריסת האלקטרודה היא החלפה בין רגישות לבין מספר התאים בלמידה. ככל שאלקטרודה קטנה יותר, המדידה רגישה יותר, אך קטנה יותר היא מספר התאים הנמצאים במחקר. עבור תאים המראים תנודות עכבה חזקות לאורך זמן בתנאים בסיסיים, מעדיפים אלקטרודות גדולות או מקבילות.

1. מחמם מראש את כל הפתרונות הדרושים לפסיית התא הסטנדרטי ולזריעה באמבט מים ב37 ° c. עבור בחני אומר עם האדם U-373 MG תאים שלוקח: מלוחים מואגור פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום, 0.05% (w/v) טריפסין, מדיום תרבות התא (מדיום מינימלי של הנשר (emem) שיושלם עם 5% (v/v) סרום עגל עוברי (fcs), 2 מ"מ L-גלוטמין ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין).
2. שטפו את שכבת התאים של תרבות המניה שגדלה בחלק התחתון של מבחנות או מנות של תרבות התא המקובלת עם ה-PBS פעמיים.
3. הסר את ה-PBS, להוסיף את הפתרון טריפסין (1 mL עבור 25 ס מ²) ולתת את התאים לדגירה ב 37 ° צ' עבור 5 דקות (חל על U-373 התאים MG).
4. בקרה לניתוק מלא של התאים מהחלק התחתון של המצע הגדילה על ידי מיקרוסקופ.
5. הפסיקו את תגובת טריפסין ברגע שהתאים מנותקים לחלוטין על-ידי הוספת 9 מ ל של תרבות התא בינונית ל -1 מ ל טריפסין להשעיה של התא. לשטוף בזהירות את התאים הנותרים מהחלק התחתון של המצע תרבות התא על ידי ליטוף את ההשעיה על המצע.
6. לאסוף את ההשעיה התא עם פיפטה ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה (15 mL או 50 mL שפופרת).
7. ספין את התאים על ידי צנטריפוגה ב 110 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש ביסודיות את הגלולה בתוך התרבות הבינונית לפני ספירת התאים (לדוגמה, על-ידי שימוש ב-hemacytometer עבור מיקרוסקופים בניגוד לפאזה וספירה ידנית).
9. כוונן את השעיית התא לצפיפות התא הרצויה. לניסויים עם תאים U-373 MG, השתמש 100 000 תאים/cm² כדי לגדול שכבת התא confluent בתוך 48 h. זה מתורגם לצפיפות התא של 200 000 תאים/mL עבור 8-היטב מערכי אלקטרודה עם אזור צמיחה של ~ 0.8 ס מ² ו נפח טוב של 400 μl.
   הערה: עבור ניסויים ההפעלה GPCR הפעלה, התאים צריכים להיות מגודלים כדי שוטפת monolayers על מערכי האלקטרודה. כדי להבטיח ביטוי הקולטן הנכון על משטח התא, התאים צריכים להיות הנזרע לפחות 36 h לפני ביצוע הניסוי. בדיקת צפיפויות תאים שונות לזריעת תאים משמעותית לעתים קרובות כדי לזהות את התנאים הניסיוניים הטובים ביותר.
10. הוסף את התא הבולם לבארות של מערך האלקטרודה ולתת להסדיר להתיישב בטמפרטורת החדר עבור 10 – 15 דקות כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של תאים בתחתית הבארות.
11. הגדל תאים לפחות 36 h בחממה סטנדרטית לתרבות התא עם 5% CO₂ (תלוי בסוג בינוני) ב 37 ° c ו לחות האווירה. שנה את תרבות התא בינונית 24 שעות לפני הניסוי.
12. ביום הניסוי, לבדוק את שכבות התא על מערכי האלקטרודות על ידי (ניגודיות הפאזה) מיקרוסקופ כדי להבטיח כיסוי מלא של אלקטרודות עם תאים.

2. השפה הבינונית-ללא שימוש בתאים

1. טרום חם סרום-בינוני, במחקר זה: L15 של ליבוביץ ' s בינונית.
2. הסרת מדיום תרבות התא מתאים שגדלו על מערכי אלקטרודה ומחליפים במדיום ללא התחממות מראש. השתמש ב-200 μL עבור 8-היטב מערכי האלקטרודה, ו 150 μL עבור 96-היטב מערכים אלקטרודה.
3. תנו לתאים להיות בתווך ללא סרום ב-37 ° c לפחות 2 שעות. זמן השיווציה תלוי בסוג התא. לדוגמה, התאים U-373 MG צריכים 2 h, התאים צ'ו צריך 4 h, BAEC עשוי לדרוש לילה בשפה בינונית L-15.
   הערה: L-15 בינוני הוא CO₂ עצמאי ומחייב שיתוף₂-אווירה חינם. עבור שיווציה ב-L-15 להגדיר את החממה 0% CO₂. השפה יכולה להיות מנוטרת על ידי קריאות עכבה, אשר אנו ממליצים לעשות עבור הניסויים הראשונים.

3. ניטור תא מדידה עם קריאות עכבה

1. מניחים את מערך האלקטרודות לתוך המחזיק מערך המחבר של מנתח העכבה.
2. ודא הקשר הנכון העכבה נמוכה בין אלקטרודות מנתח עכבה. בדיקה זו שונה באופן אינדיבידואלי עבור מכשירים שונים.
   הערה: אם המכשיר אינו מצליח ליצור קשר עם האלקטרודות, פתח שוב את מהדק איש הקשר, הכנס את מערך האלקטרודות למיקום הנכון בתוך המחזיק ונסה שוב.
3. בחר סוג אלקטרודה ו/או תבנית מרובת היטב מממשק המשתמש של התוכנה.
4. הגדר את פרמטרי המדידה. אפשרויות שונות זמינות.
   הערה: כדי לבחור את תדירות ה-AC הרגישה ביותר, אנו מתייחסים לספרות ולמדריכים כלים כפי שהוא תלוי בפריסת האלקטרודה וסוג התא תחת לימוד. בדרך כלל, תדירות החישה היא בטווח של 4 kHz – 50 kHz. כאן, U-373 התאים MG גדלו על אלקטרודות עבודה מעגלית של 250 יקרומטר קוטר והם היו מנוטרים בתדר AC של 12 kHz.
   1. אם קיימים מצבי רכישה של נתונים יחידים ומרובים בתדר מרובה, בחר במצב התדר הבודד כדי להבטיח את רזולוציית הזמן המירבית. המדידה תתבצע בתדר אחד זה. לכלי הפריסה הנפוצים ביותר, יש מספר תדרים מוכנים מראש לאורך חלון התדר הזמין.
   2. אם מספר הבארות הנמצאות במחקר נמוך או ברזולוציה של זמן אינו קריטי, בחר במקום זאת הקלטות בתדר מרובות. קריאות עכבה במספר מוגדר של תדרים יירשמו עבור כל טוב לניתוח מאוחר יותר מעמיק.
      הערה: רזולוציית הזמן פוחתת עם מספר הולך וגובר של תדרים שנרשמו למספר הבארות והולך וגדל. האפשרויות עבור תדירות ובחירת מצב רכישת נתונים משתנות עם סוג מכשיר וגירסה.
5. התחל לרכוש נתוני קורס זמן.
6. בצע את העכבה שכבת התא (לפחות 2 h) עד שהעכבה התייצב. בינתיים, הכינו את הפתרונות האגוניסט.
7. כאשר שכבות התא הגיעו לרמת עכבה יציבה, או (אני) להמשיך לתוספת אגוניסט סדרתי בתוך ניסוי זהה או (ii) לסיים את רכישת נתונים ולהתחיל ערכת נתונים חדשה עבור ניטור הפעלת הקולטן אגוניסט.

4. הכנת פתרונות אגוניסט לניסויים במצב אגוניסט

1. חישוב הריכוז של פתרונות אגוניסט לפי הצורך עבור כל שלב של מינון טורי לפי משוואה (1). n טווחים מ-1 עד למספר הכולל של תוספות טוריות i. x מציין ריכוז ונפח בבאר בשלב n. y מציין ריכוז ונפח של "פתרון-להיות-מוסף" בשלב n.

הערה: שקול את מספר השכפל וחשב את הנפח הכולל של "פתרון-להוספה" עבור כל שלב ריכוז. תוצאות חישוב אופייני ניתנות בטבלאות 1-4. זה לוקח רעיון כללי על טווח ריכוז אגוניסט ללמוד כמו הטווח מגדיר את ריכוזי ומספר חלקים להינתן במהלך התוספת הטורית. באמצעות פרוטוקול התוספת אגוניסט סדרתי הריכוז אגוניסט הוא מוגבר חורג. לכן, כמות אגוניסט כבר בבאר כאשר המינון הבא נוסף צריך להילקח בחשבון. כאשר מספר מולקולות אגוניסט כבר נוכח הבאר הוא n_x = c_x ∙ V_x (עם הריכוז הנוכחי c_x ו-volume v_x) ואת מספר המולקולות בבאר אחרי התוספת הבאה היא n_{x + y}, מספר המולקולות שיש להוסיף n_y נקבעת על ידי הריכוז c_y ונפח V_y של הפתרון כדי להיות מיושם על הבאר (n_y = c_y ∙ V_y). לאחר הוספת חלק אגוניסט, כמות חדשה של מולקולות אגוניסט בבאר היא: c_{x + y} ∙ v_{x + y} = c_x ∙ v_x + c_y ∙ V_y. חישוב זה חל על כל שלב שאחריו. בגלל התלות ההדדית של ריכוז אגוניסט בבאר וכמות אגוניסט בחלקים להתווסף עם כל שלב, חשוב להגדיר ריכוזים סופיים לאחר כל צעד מראש.

מצב 1: הכרך בבאר יגדל עם כל שלב כנוזל הוא הוסיף ברציפות.
באמצעות מצב זה ופורמט 8-היטב, השתמש V_x1 = 200 μl ו-v_y1. .. v_yi = 30 μl.

מצב 2: עוצמת הקול בבאר היא קבועה כמו אמצעי האחסון שנוסף עם כל צעד מוסר ממש לפני התוספת הבאה.
באמצעות מצב זה ופורמט 96-היטב, השתמש V_x1 = 150 μl ו-v_y1. .. v_yi = 75 μl.

2. הדפס את גליון הנתונים עם אמצעי האחסון הכולל לריכוז והוראות מפורטות לליטוף.
3. הכן את כל הפתרונות בסכום הנדרש. הפוך את כל הפתרונות האגוניסט באותו מדיום ללא סרום, המשמש לequiציה של התאים.
   התראה: היסטמין דיהידרוטסטוסטרון נחשב מסוכן על-ידי מ2012 התקשורת המסוכנת הסטנדרטית (29 CFR 1910.1200). היסטמין גורם לגירוי בעור, גירוי בעיניים חמורות, עלול לגרום לתגובת עור אלרגית, אלרגיה, תסמיני אסטמה או קשיי נשימה אם לשאוף ועלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. . בבקשה, שקול את גליון הנתונים הבטיחותי
   הערה: הפוך פתרונות אגוניסט טריים ככל האפשר. יציבות האגוניסטים בתמיסה עשויה להשתנות במידה ניכרת. לאחסן פתרונות ב -4 ° c או למטה עד לשימוש בניסוי. עבור מולקולות מסוימות תוספים ייצוב נוספים, כמו bsa בעת שימוש במולקולות מבוססות פפטיד או מבוססי השומנים, עשויים להיחשב כדי למנוע ספיחה לקירות של בארות וצינורות.
4. אם ביצוע הניסוי ב 96-היטב בפורמט, העברת פתרונות לצלחת 96 רגיל-באר (אין אלקטרודות) ולהשתמש 8-(או 12-) ערוץ pipet עבור העברה נוזלית מהירה למערך האלקטרודה.

5. הכנת פתרונות אגוניסט לניסוי במצב היריב

הערה: הכינו את פתרון היריב בריכוז לאורך כל הדרך. נפח וריכוז של פתרון היריב תלוי במצב של תוספת אגוניסט (1 או 2). דוגמאות לניסויים ב 8-טוב או 96-פורמט טוב בנוסף במצב 2: (A) 8-היטב פורמט (V_x1 = 200 μl, V_היריב = 200 μl); (ב) 96-ובכן פורמט (V_x1 = 150 μl, v_היריב = 75 μl).

1. חישוב הריכוז של כל הפתרונות אגוניסט הדרושים עבור כל שלב של מינון סדרתי כמתואר בשלב 4.1.
2. הפוך את כל הפתרונות האגוניסט באותו מדיום נטול-סרום, המשמש לequiציה של התאים והוסף את היריב באותו ריכוז סופי כמתוכנן לבארות המתאימות בניסוי.
   הערה: במקרה זה פתרון מניות היסטמין (10 מ"מ) מוכן בינוני L-15. כאשר אגוניסטים מומס ממיסים אחרים (למשל, diמתיל sulfoxid (DMSO), אתנול) בקרת ממס יש לכלול לחשבון עבור עומס הממס גדל עם כל שלב של תוספת.

6. ביצוע פרוטוקול התוספת הטורית במצב אגוניסט

1. התחל את רכישת הנתונים כמתואר בשלבים 3.1 – 3.5.
2. לחמם את הפתרונות האגוניסט לפני השימוש על ידי הצבת אותם בחממה בערך 10 – 15 דקות לפני התוספת.
   הערה: בעת שימוש בחומרים תרמו-לאבתיים, אין לשמור על הפתרונות ב-37 ° c במשך זמן רב מדי. אם התחממות מראש במשך 10 – 15 דקות נחשבת לקריטית, הביאו פתרונות ל-37 ° c זמן קצר לפני הוספת אמבט מים.
3. הפעל את המינון הטורי האגוניסט התלוי במצב החיבור הנבחר. לאחר מצב 1 את הנפח הכולל בבאר מגדיל עם כל תוספת של המינון הבא. במצב 2 אותו אמצעי האחסון אשר נוסף עם כל שלב מוסר שוב רק לפני הוספת המינון הגבוה הבא.
   הערה: הזמן הדרוש לשפה של שכבת התא בין שתי מנות אגוניסט עוקבות תלויה בזמן התגובה של התאים. הניסוי הראשוני במצב מקביל (אחד טוב-ריכוז אחד) חושף (i) התגובה התאים עבור ריכוזי אגוניסט שונים ו (ii) פרמטר העקומה הרגיש ביותר (למשל, עכבה מקסימום, עכבה אחרי זמן x).

A: מצב 1/8-פורמט טוב

1. הוסף 30 μL של הפתרון הראשון עם הריכוז הנמוך ביותר של אגוניסט לתאים שהיו מסובטים ב 200 μL של מדיום ללא סרום.
2. תן לתאים להגיב ולקצר את פרק הזמן המוגדר מראש (לדוגמה, 15 דקות).
3. הוסף 30 μL של הפתרון השני עם הריכוז הגבוה הבא.
4. חזור על הצעדים 6.3.1-6.3.3 עם השלישי, הרביעי, וכן הלאה, פתרון אגוניסט.
   הערה: עבודה עם 10 צעדי ריכוז תגרום נפח כולל של 500 μL בסוף הניסוי, אשר נמצא ממש מתחת לנפח הישים המקסימלי של בארות אלה של ~ 550 μL.

ב: מצב 2/96-פורמט טוב

הערה: השהה את רכישת הנתונים במהלך כל שלב טיפול בנוזלים (בתוספת/הסרה) באמצעות תוכנת מכשיר העכבה בעת הפעלת ניסויים ב-96-בפורמט טוב. הטיפול הנוזלי המשוכלל יותר עלול לשבש את רכישת הנתונים. השתמש בפיפטה רב ערוצית.

1. השהה את רכישת הנתונים.
2. הוסף 75 μL של הפתרון הראשון עם הריכוז הנמוך ביותר של אגוניסט לתאים שהיו מסובטים ב 150 μL של מדיום ללא סרום.
3. . לחדש את רכישת הנתונים
4. תן לתאים להגיב ולקצר את פרק הזמן המוגדר מראש (לדוגמה, 15 דקות).
5. בערך 1 – 2 דקות לפני הזמן הרגיל המקביל מסתיים, להשהות את המדידה ולהסיר את 75 μL מכל באר.
   הערה: נקודת הזמן שבה יש להסיר את הפתרון תלויה במספר הבארות המנוטרות במקביל ובמהירות הבזק. הזמן הדרוש להסרת הפתרונות לא יעלה על הזמן שבין השלבים הבאים.
6. הוסף 75 μL של הפתרון השני עם הריכוז הגבוה הבא וחדש את המדידה.
7. חזור על הצעדים 6.3.8-6.3.10 עם השלישי, הרביעי, וכן הלאה, פתרון אגוניסט.

7. ביצוע פרוטוקול התוספת הטורית במצב היריב

1. הפעל את המדידה כמתואר בשלבים 3.1 – 3.5.
2. במהלך הרובד של שכבות התא, להכין פתרון היריב (למשל, 200 μL של 1.5 μM הידרוכלוריד מכרה L15 בינוני).
   התראה: הידרוכלוריד בדיפנהידרלי יש פוטנציאל להשפעות רפואיות חדות. הוא מזיק אם בלע או שאפה, עלול לגרום לגירוי בעין ובעור. זה עלול לגרום לגירוי במערכת הנשימה ובדרכי העיכול. . בבקשה, שקול את גליון הנתונים הבטיחותי
3. טרום לחמם את היריב ואת פתרונות אגוניסט על ידי הצבת אותם בחממה על 10 – 15 דקות לפני בנוסף לתרבויות התא (cf. 6.2). אם בארות ללא יריב כלולים גם בתוך השימוש, וגם במדיום ללא סרום חם.
4. הוסיפו את פתרון היריב לבארות המיועדות. תנו לתאים להיות מוקצב עם היריב במשך 15 – 20 דקות. אם הם בארות ללא יריב כלולים, להוסיף את אותו נפח של מדיום ללא סרום לבארות אלה.
5. על פי תוספת היריב במצב 2, להסיר את הפתרון מן הבארות
   (A) 8-היטב פורמט (200 μL)
   (ב) 96-פורמט טוב (75 μL)
6. הפעל את רצף התוספת אגוניסט כמתואר בשלב 6.3.

8. יצוא וניתוח נתונים

1. ייצוא נתונים באמצעות תוכנת מכשיר העכבה כדי להמיר את כל הנתונים המוקלטת מקנייני לתוך תבניות נתונים נפוצות (לדוגמה, csv). שלב זה מאפשר ארגון מחדש של נתונים ומצגת עם חבילות תוכנה אחרות.
2. טען את הנתונים בתבנית csv לתוכנה לניתוח נתונים מדעיים.
3. לנרמל את ערכי העכבה על ידי חיסור העכבה של נקודת הנתונים האחרונה לפני התוספת הראשונה של הפתרון אגוניסט ועל ידי הגדרת הזמן של נוסף ל-t = 0. מתווה את מסלול הזמן של עכבה מנורמלת.
4. להתוות את קורסי הזמן הבודדים ולזהות את מקסימה בעכבה אחרי כל שלב בתוספת. חבר גליון נתונים עם ערכים אלה.
5. להתוות את הערכים של מקסימום (או מינימום, אם ישים) העכבה שינויים כפונקציה של ריכוז אגוניסט. זה יכול להיעשות עבור בארות בודדות או עבור ממוצעים (ממוצע ± SD).
6. השתמש בשגרת התאמת נתונים כדי לקבוע ריכוזים יעילים של חצי מקסימאלי (EC₅₀) ומענה מרבי (E_Max) באמצעות ארבעת המודלים הלוגיסטיים של הפרמטרים (משוואה 2):

הערה: c מציין את הריכוז האגוניסט ,₁ הוא המינימום ו-₂ הוא אסימפטוטה המרבי של עקומת המינון הסיגמואידית-תגובה (A₂ = E_Max). EC₅₀ הוא הריכוז בנקודת פיתול של העקומה, ו n מקביל למדרון היל.

תוצאות

ערכה טיפוסית להכנת פתרונות אגוניסט שונים מוצג לניסוי באמצעות 8-היטב מערכי אלקטרודה עם היסטמין כמו אגוניסט בטבלאות 1-4. טבלה 1 ו- table 2 להציג כרכים וריכוזים עבור ניסוי באמצעות מצב חיבור 1 (cf., איור 1), בעוד טבלה 3 וטבלה 4 להציג ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור מדידות עכבה ללא תווית כדי לקבוע את הקשר המינון-תגובה של agonist המושרה הפעלת GPCR בהעדר או נוכחות של יריבים ספציפיים לאותו קולטן. הוכחת המושג של שיטה זו הוצגה בפרסום האחרון¹². לידיעתנו שלנו הוא המחקר הראשון המתאר את הקמתה של עקומת מינון מלא-תגובה של אגוניס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker counting chamber	Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany)	640210
cell culture flasks 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Diphenhydramine hydrochloride	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S0615
Histamine dihydrochloride	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	51022515	class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704780
Micropipette large (20 - 200 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)	Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D8537
Pipette, serological	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Germany)	26300
Trypsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	T4174	in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	188 271
Tube, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	210 261
U-373 MG cells	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
water bath (TW21)	Julabo (Seelbach, Germany)	\