JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו פרוטוקול עבור הדור והערכה של הומניזציה ונגיף הכשל החיסוני האנושי חעוגה מודל העכבר מבוסס על השתלת תא גזע, הנגיף החיסוני intravaginal האדם חשיפה, ו-droplet דיגיטלי PCR RNA כימות.

Abstract

עכברים הומניזציה לספק פלטפורמה מתוחכמת כדי ללמוד וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ולבדוק תרופות אנטי ויראליות. פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של מערכת חיסונית אנושית בעכברים חעוגה למבוגרים. כאן, אנו מסבירים את כל הצעדים המעשיים מבידוד של דם הטבור הנגזר של האדם CD34 + תאים והשתלת העירוי הבאים שלהם לתוך העכברים, כדי מניפולציה של המודל באמצעות זיהום HIV, טיפול תרופתי שילוב ( עגלה), ודגימת דם. כ 75,000 התאים hCD34 + מוזרק באופן מבוקר לתוך העכברים ורמת הצ האנושי, הידוע גם בשם הומניזציה, בדם היקפי מוערך longitudinally במשך חודשים על ידי cy try זרימה. סך של 75,000 hCD34 + תאים תשואות 20% – 50% האדם CD45 + תאים בדם היקפי. העכברים רגישים לזיהום intravaginal עם HIV ודם ניתן לטעום פעם שבועית לניתוח, וחודשיים פעמיים לתקופות ממושכות. פרוטוקול זה מתאר את השיטה עבור כימות של עומס פלזמה ויראלי באמצעות ה-PCR הדיגיטלי של droplet (ddPCR). אנו מראים כיצד ניתן לטפל באופן יעיל בעכברים באמצעות משטר עגלה סטנדרטי בדיאטה. המשלוח של עגלה בצורה של צ'או עכבר רגיל הוא עידון משמעותי של המודל הניסיוני. מודל זה יכול לשמש ניתוח טרום קליני של שני מערכתית ואקטואלי לקדם חשיפה מניעה, כמו גם עבור בדיקות של טיפולים חדשניים ואסטרטגיות לריפוי HIV.

Introduction

נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) הוא זיהום כרוני עם יותר מ 37,000,000 אנשים נגועים ברחבי העולם1. טיפול ויראלי משולב (עגלה) הוא טיפול מציל חיים, אבל עדיין מוצדקת תרופה. לפיכך, יש צורך במודלים של חיות המראות את מערכת החיסון האנושית ואת תגובותיהם כדי להקל על המשך המחקר ב-HIV. סוגים מרובים של עכברים הומניסטים כי הם מסוגלים לתמוך תאים ורקמות הרקמה פותחו על ידי שתילת תאים אנושיים לתוך עכברים לקוי בחומרה2. עכברים כאלה הומניזציה רגישים לזיהום HIV ולספק חלופה חשובה הפרימטים מודל הכשל החיסוני של האדם, כפי שהם זולים יותר ופשוטים יותר לשימוש מאשר פרימטים אנושיים. עכברים הומניזציה יש מחקר הקלה שידור HIV ויראלי, פתוגנזה, מניעה, טיפול3,4,5,6,7,8,9,10,11.

אנו מציגים מערכת גמישה מודל הומניזציה עבור מחקר HIV שפותחה על ידי שתילת דם טבורי הזרע בתאי גזע האדם לתוך עכברים של נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/jictac (חעוגה) רקע. מלבד היותו של מוצא לא עוברי, הביוהנדסה המעשית של עכברים אלה היא פחות מבחינה טכנית תובענית לעומת ההליכים יקרוכירורגית המעורבים השתלת הכבד בדם בלוטת התימוס (בייקון) לבנות.

אנו מראים כיצד ליצור זיהום HIV באמצעות שידור intravaginal וכיצד לנטר את העומס ויראלי פלזמה עם התקנה המבוססת על ה-droplet דיגיטלי (ddPCR) רגיש. לאחר מכן, נתאר את הקמת העגלה הסטנדרטית הניתנת כחלק מדיאטת העכבר היומית. מטרת השיטות המשולבות הללו היא להפחית את הלחץ לבעלי החיים ולהקל על ניסויים בקנה מידה גדול שבהם הזמן המושקע בטיפול בכל בעל חיים מוגבל ל-12.

בבני אדם, CCR5Δ32/wt או CCR5Δ32/δ 32 גנוטיפ גורם מופחת רגישות לזיהום HIV עם משדר/מייסד וירוסים13, ואמצעי זהירות יש לנקוט כאשר ביולוגי הומניזציה עכברים עם תאי גזע לצורך לימודי HIV. הדבר נכון במיוחד באזורנו, מכיוון שמשתנים באופן טבעי ב- CCR5 gene, במיוחד δ 32 מחיקות, נפוצים יותר באוכלוסיות מקוריות סקנדינביות ובלטיות בהשוואה לשאר העולם14,15. כך, הפרוטוקול שלנו כולל שיטת קל, תפוקה גבוהה עבור הקרנת תאי גזע המטפאות עבור משתנים CCR5 לפני ההשתלה.

עבור החשיפה הintravaginal בחרנו את המשדר/מייסד R5 וירוס RHPA4259, מבודד מאישה בשלב מוקדם של זיהום שהיה נגוע intravaginally16. אנו חושפים את העכברים למינון נגיפי שהספיק להניב שידור מוצלח ברוב העכברים, אבל מתחת לקצב השידור 100%. בחירת מנה כזו מאפשרת טווח דינמי מספיק בקצב השידור, כך שהשפעות אנטי ויראליות של מועמד תרופתי יכולות לגרום לבעלי חיים מוגנים בניסויים במניעת HIV ולהפחית את העומס הנגיפי ללימודי הטיפול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל דגימות הדם הטבורי הושגו בהתאמה קפדנית עם פרוטוקולים מאושרים מקומית, כולל הסכמה מושכלת של תרומה אנונימית על ידי ההורים. כל ניסויי החיות אושרו ובוצעו בהתאמה קפדנית עם התקנות הלאומיות הדנית תחת רישיון 2017-15-0201-01312.

התראה: טפל בעכברים חשופים בדם ובזהירות מירבית. טהרים כל המשטחים והנוזלים שהיו במגע עם HIV עם חיטוי HIV אישר (שולחן החומרים).

1. בידוד של האדם CD34 + תאי גזע

  1. לאסוף דגימות דם טבורי בצינורות איסוף דם EDTA-מצופה לאחר סעיפים המתוכנן ניתוח קיסרי או לידות נרתיקי ועל פי אישורים אתית מקומית.
  2. בידוד PMBCs מתוך דם טבורי על-ידי הפרדה באמצעות מעבר הדרגתי לפי פרוטוקול היצרן.
  3. בידוד CD34 + תאים מן האוכלוסייה PBMC על ידי העשרת מראש הראשון עם נוגדנים נגד סמנים משותפים עבור תאים בוגרים, אשר מעורר את הקישור של תאים של שנים לא רצויות עם כדוריות דם אדומות. לאחר מכן CD34 + העשרת תאים באמצעות חרוזים מגנטיים, על פי פרוטוקול היצרן.
    1. קבע ספירת תאים חיים על-ידי טריפה רגיל הדרה כחולה על ידי השעיית מחדש 10 μL של השעיית תא ב-90 μL של טרי, כחול. הוסף 10 μL של פתרון זה כדי hemacytometer ולספור תאים לא כחולים, על פי פרוטוקול של היצרן.
    2. בלתי נשכח CD34 + תאים בתוך 1 mL של 10% DMSO בסרום העוברי העובר (FBS) עד היום של השתלת העכבר.
    3. הקפאה והקלה של שבריר קטנה של שני מבודדים (CD34 +) ותאים זורמים (CD34-) בנפרד להערכת CD34 + תא גזע טוהר (~ 30,000 תאים של כל מדגם). לחלופין, בדוק את הטוהר על תאים טריים מועשר (ראה שלב 2 להלן).
    4. הקפאת שבריר של לא-מפלטד זרימה (CD34-) לצורך קביעת מצב CCR5δ 32. תאים יכולים להיות קפואים ישירות ללא פתרון הקפאה ממוזג, אבל הנוכחות של כדוריות הדם האדומות בגלולה יכול לעכב את ה-PCR הבאים אם הזרימה-דרך הוא מפלטד.

2. הערכת CD34 + לטוהר תא גזע באמצעות הזרמה cy,

  1. הפשרת התאים הבודדים (CD34 +) ותאי זרימה (CD34-). לשטוף את התאים על ידי השעיית מחדש את התאים מכל בקבוקון 9 מ ל של טמפרטורת החדר (RT) FACS מאגר, המורכב 2% סרום שור עוברי (FBS) ב פוספט מתכלה באגירה (PBS).
  2. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g ב RT כדי התאים גלולה.
  3. יוצקים את supernatant, להשעות מחדש את התאים בנוזל הנותר ולהעביר לצינורות FACS. חזור על שלב הכביסה עם 3 מ ל של מאגר FACS. לאחר הצנטריפוגה השניה, שופכים את הסופרנטאנט ומשכבות את התאים בנוזל הנותר.
  4. הוסף 5 μL של פתרון חסימת הקולטן Fc (טבלת חומרים) ולהשאיר 10 דקות ב RT. אל תשטוף את הפתרון חסימת הקולטן Fc.
  5. הוסף את התמהיל המכיל כרכים מראש של נוגדנים נגד האדם CD3 (שיבוט SK7) BUV395, CD34 (שיבוט AC136), FITC, ו CD45 (שיבוט 2D1) APC (שולחן 1). להשאיר את התאים במשך 30 דקות ב-RT בחושך. Fluorophores יש לבחור בהתבסס על פרמטרים שניתן להעריך עם cytomטומטריים זמינים ללא צורך מטריצה פיצוי.
  6. שטוף את התאים עם 3 מ ל של מאגר FACS.
  7. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g ב RT כדי גלולה את התאים.
  8. יוצקים את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים בנוזל הנותר.
    1. חזור על שלב זה כביסה 2x כדי לוודא שכל הנוגדנים לא מאוגדים הוסרו.
  9. הקלט את הדגימות על הזרימה cytometer (טבלת חומרים) ולבצע ניתוח נתונים עם התוכנההמתאימה. אסטרטגית הפעולה מוצגת באיור 1א – פ.

3. הקרנה גנטית עבור CCR5δ 32 משתנים בדם טבורי

  1. מודטה 1.25 μL של שאינם ממוזגים זרימה-דרך עם 11.25 μL של שילוב ה-PCR המכיל 200 μM של שילוב dNTP, 0.01 הגבוהה ביותר U/μL DNA פולימראז, ו הקדמי קדימה הפוכה מפורט בטבלה 2.
    1. לכוונן את עוצמת הקול עם nuclease-מים ללא כ 12.5 μL עבור כל תגובת PCR.
  2. להגביר את שברי גנומית עם תוכנית האופניים PCR המפורטים בטבלה 3.
  3. הפרד את מוצרי ה-PCR ב-2% ג'ל שנוצר ב-13.
    1. ה-pcr מוצרים מסוג פראי אללים ו δ 32 אללים התשואה PCR שברים של 196 זוגות בסיס ו 164 בסיס זוגות להקות בהתאמה, מה שהופך אותם בקלות להבדיל על ידי ג'ל אלקטרופורזה13 (איור 1G).

4. השתלת תא גזע בעירוי

הערה: אדם אחד להכין את התאים במעבדה ואדם אחר להכין את העכברים ואת סביבת העבודה עבור השתלות היא גישה יעילה.

  1. במתקן לבעלי חיים, 4 – 6 לפני ההשתלה המתוכננת של תאי הגזע, הקרין 6 – 7 בשבוע בת הנהון הנשי. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JICTAC (חעוגה) עכברים (טבלה של חומרים) עם 0.75 Gy עם מקור137 Cs. מינון טרום התניה הטובה ביותר עשוי להשתנות בהתבסס על גיל העכבר, מקור הקרינה, וגורמים אחרים. תהליך זה מהווה את החיות לחרט מוצלח עם תאי גזע אנושיים.
  2. במתקן בעל חיים, להכין את סביבת העבודה של ספסל הזרימה ואת כל הריאגנטים לפני להביא את העכברים או התאים לתוך סביבת העבודה.
    1. מניחים משטח כחול סטרילי לכסות את משטח העבודה של ספסל הזרימה. הכן גזה סטרילית. ומיכל שרפ
    2. מניחים מנורת חימום מחוטאת עם 70% אתנול בספסל הזרימה עם כלוב ריק של עכבר סטרילי מתחת לחום.
  3. במעבדה, הפשרת CD34 + תאים מבודדים ולדלל אותם ב 9 מ ל של 37 ° c רגיל RPMI.
  4. צנטריפוגה את התאים ב 350 x g עבור 5 דקות ב-RT, להיפטר supernatant על ידי השאיפה, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של רגיל RPMI ב 37 ° c.
  5. קבע את ספירת התאים על-ידי החרגת כחול מטרי, וכוונן את אמצעי האחסון ל-200 μL לכל עכבר. הפוך תוספת כדי לקחת בחשבון הפסד אפשרי עקב שלבי הטיפול הבאים.
    1. היכונו להשתלה 75,000 CD34 + תאים לכל 200 μL לתוך כל עכבר.
    2. ניתן לשמור את התאים ב -4 ° c במהלך ההובלה למתקן החי לפני ההשתלה. הימנע משמירת התאים בקרח כדי להפחית את הצבירה או ההחלקה.
  6. במתקן החי, הביאו את הכלוב עם העכברים לתוך ספסל הזרימה והעבירו את העכברים לכלוב שמתחת למנורת החימום כדי להתרחב בכלי הדם. השאר קצה אחד של הכלוב הרחק ממקור החום כך שהעכברים יוכלו להתרחק מהחום ולהתחמם. עכברים שעברו לסוף הכלוב, הרחק ממקור החום, מאוד חמים להזרקה מוצלחת של וריד הזנב.
  7. טען מזרק משומנים 1 mL למעל מארק μL 800 עם מושעה CD34 + תאים. שימוש מזרק משומנים 1 mL יהיה להקל באופן דרמטי את ההזרקה ולהגדיל את הדיוק של טכניקה זו.
  8. לצרף a 30 גר' 13 מ"מ מחט ולהכין את המחט ואת המזרק להזרקה. סדר זה של הפעולה מאפשר המזרק להיות נטען מהר יותר תוך הגנה על היושרה של התאים כדי להיות מושתלים בהינתן נזק אפשרי שיכול להתרחש במהלך השאיפה המהירה של התאים באמצעות מחט כגון קטנה כגון. למלא את רכזת המחט עם נוזל על ידי לחיצה על הבוכנה ולהסיר את הנוזל למטה כדי לסמן את 200 μL של המחט.
  9. המקום עכבר מחומם (שלב 4.6) בתוך הרחקה המשמש למתן זריקות IV. בזהירות להזריק 200 μL של התא הבולם לתוך הווריד האחורי של העכבר. לבלות 2 s לבצע את הצלילה ולשמור את המחט מוכנס כ 2 s לאחר השלמת הזריקה. זה מבטיח כי התאים הועברו כראוי רחוק מאתר ההזרקה לפני הסרת המחט.
  10. בהתאם לצורך, לנגב את זנב העכבר עם גזה סטרילית כדי להסיר כל דם גלוי. החזר את העכבר לכלוב הבית הלא מחומם שלו. חזור על הליך ההזרקה עם העכברים הנותרים.

5. איסוף דם ועיבוד לצורך ניתוח

הערה: תא האדם העפיל בדם היקפי ניתן להעריך באמצעות זרם cy, try 3 – 5 חודשים לאחר השתלת תא גזע אנושי.

  1. ציירו דגימות דם מעכברים באמצעות טכניקות IACUC מקומיות מאושרות.
  2. לאסוף מקסימום של 70 – 100 μL של דם מוחלט לתוך צינורות ה-PCR מיקרוצנטריפוגה סטרילית המכיל 10 μL של 0.5 M EDTA (pH = 8.0) כדי למנוע קרישת דם.

6. הערכה של החרט האנושי באמצעות הזרימה

  1. העבר 40 – 50 μL של דם צינורות FACS.
  2. הוסף 5 μL של הפתרון חסימת הקולטן Fc כדי למנוע איגוד ספציפי של נוגדנים ולעזוב 10 דקות ב RT.
  3. הוסף את העכבר לערבב נוגדן נגד האדם המכיל CD4 (שיבוט SK3) BUV 496, CD8 (שיבוט RPA-T8) BV421, CD3 (שיבוט OKT3) FITC, CD19 (שיבוט sj25c1) PE-Cy7, CD45 (שיבוט 2D1) APC (שולחן 4) ולהשאיר כתם בחושך ב-RT עבור 30 דקות. Fluorophores יש לבחור בהתבסס על פרמטרים כי ניתן להעריך את cytomטומטריים הזמינים ללא צורך מטריצה פיצוי.
  4. הוסף 2 מ ל של מאגר המתאים תא דם אדום לפני כל צינור למטה את כדוריות הדם האדומות. השתמש מאגר הפירוק ניסח במיוחד עבור מכתים נוגדנים לפני הליזה תא דם אדום (דוגמה מתאימה ניתנת בטבלה של חומרים). מערבולת לזמן קצר כדי להבטיח התפלגות שווה של התאים בפתרון lysing ולעזוב 10 דקות ב RT. הפצה שווה של התאים חשוב.
  5. הוסף 2 מ ל של מאגר FACS כדי להפסיק את תגובת הפירוק.
  6. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g ב RT כדי גלולה את התאים.
  7. יוצקים את הסופרנטאנט ואת המערבולת בעדינות עד התאים מושעה מחדש.
  8. הוסף 3 מ ל של מאגר FACS ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g ב RT.
  9. שופכים את הסופרנטאנט. ומשחוזרים את התאים
  10. הקלט את הדגימות על הציטומטר זרימה מתאים ולנתח באמצעות תוכנהמתאימה (טבלת חומרים). ניתוח מייצג ותוצאות מתוארות באיור 2 ובאיור 3.

7. Intravaginal HIV חשיפה

הערה: הווירוס המשמש לחשיפה intravaginal של העכברים ניתן להפיק באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר17. הנגיף נשמר ב-80 ° c ומועבר בין מיקומים תוך שמירה על קרח יבש בעקבות פרוטוקולים שאושרו באופן מקומי. הווירוס מאוחסן על קרח יבש עד מיד לפני חשיפת העכברים. הנגיף יכול להיות מדולל לתוך RPMI רגיל (להימנע RPMI כי יש אנטיביוטיקה או תוספים סרום) כדי להשיג את הריכוז המתאים מיד לפני חשיפה (21,400 IUs שימשו לחשיפה זו IVAG). שנוצר לאחר, לשמור את המניה מדולל על קרח רטוב לאורך ההליך כדי להימנע הקפאת ההפשרה מחזורים שיתרחשו אם הווירוס מדולל הונח חזרה על קרח יבש פעם הופלה.

  1. הכן את כל הציוד ומרחב העבודה של ספסל הזרימה כפי שהוצג באיור 4 לפני הבאת העכברים או הווירוס לתוך הספסל הזורם (בדומה לשלב 4.2).
    1. מניחים את המוקד מנורת החימום במרכז סביבת העבודה שבה העכבר יהיה ממוקם במהלך הליך חשיפה ל-HIV. מנורת החימום תבטיח כי אין ירידה בטמפרטורת הגוף של העכברים. ציוד אחר השולט על הטמפרטורה יכול לשמש גם, (למשל משטח ג'ל מחומם או שמיכה במחזור מים חמים, על פי תקנות IACUC מקומיות18).
    2. הביאו את הטיפים המעוקרים של 20 μL ופיפטה מתאים לספסל. מניחים מיכל עם חיטוי נוזלי (לוח חומרים) בספסל לחוסר הפעלה מיידית של חומרים ונוזלים שהיו במגע עם הנגיף.
  2. הציבו עכבר בחדר עם 3% מגבות גז ונייר. אחוז הגז הזה יורדם את החיות בתוך 2 – 4 דקות. כמו בכל החומרים האחרים המשמשים עם עכברים לקויה, מנגנון ההרדמה חייב להיות מחוטא כראוי לפני השימוש.
  3. לאחר שהיה מורדם, העבר את העכבר למשטח כחול סטרילי מתחת למנורת החימום. הכנס את החוטם העכבר לתוך מסכה המספקת 3% מתמשך גז isof, כדי לשמור על ההרדמה. החזק את העכבר בבסיס הזנב, הבטן פונה כלפי מעלה, כאשר ידך תומכת העכבר חזרה כמתואר באיור 4.
  4. עם טיפ פיפטה סטרילי, לגרות את האזור איברי המין על ידי הוספת קו בעדינות כלפי מעלה לכיוון פי הטבעת כדי לגרום ריקון של פי הטבעת, להקלה על הלחץ על הנרתיק.
  5. חשוף בקפידה את פתיחת הנרתיק על ידי גלישת הזנב העכבר על פני האצבעות כגון הפות באופן טבעי נפתח, אולי עם הסטה קלה באמצעות קצה הצינורות סטרילי.
  6. שנה את העצה ואת הפיפטה 20 μL של וירוס לתוך הנרתיק העכבר מבלי ליצור בועות. אל תכניס את הקצה עמוק לתוך הנרתיק. ליתר דיוק, כאשר הפות נפתח, למקם את העצה הפיפטה ברמה של פתיחת הנרתיק, להימנע הולך עמוק יותר כדי לחסל את הפוטנציאל של שריטות בתהליך החיסונים, לשחרר את הווירוס, ולאפשר הכבידה למשוך את הווירוס לתוך הנרתיק. לחילופין, להשתמש 22 G 1.25 mm בוטה בקצה, מחט ישר, כפי שמתואר ב Veselinovic ואח '6.
  7. לשמור על העכבר בתנוחה זו עם הנרתיק פונה למעלה עבור 5 דקות לאחר החשיפה כדי למנוע דליפה הנגרמת כבידה של השעיית וירוס.
    1. בזהירות למקם את העכבר לתוך כלוב הבית, מטפלת למקם את העכבר על גבו.

8. עיבוד דגימות דם לפני ניתוח העמסה ויראלי

  1. לאסוף דם כמתואר בסעיף 5 לעיל.
  2. צנטריפוגה את דגימות הדם עבור 5 דקות ב 500 x g ב RT כדי להפריד את הפלזמה והתאים.
  3. לאסוף 40 μL של פלזמה עבור מדידת עומס ויראלי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש של ה-PCR שאושרו על ידי ולאחסן ב-80 ° צ' לפחות 1 h עד לעיבוד נוסף. חשוב להקפיא את כל הדגימות לפני החילוץ RNA כדי למנוע את הסיכון של הטיה מהשוואת רמות RNA בדגימות שלא הוקפאו לפני בידוד RNA לדגימות קפואות לפני בידוד RNA.
  4. כוונן את עוצמת הדם בחזרה לאמצעי האחסון המקורי על-ידי הוספת 40 μL של מדיה ההשעיה (PBS עם 2.5% בסרום פרה אלבומין, 50 U/mL פניצילין G ו סטרפטומיצין, ו 10 U/mL DNase, סטרילי-מסונן ב 0.22 μm).
  5. העבר 15 μL של נפח הדם המותאם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מאושר PCR.
  6. הוסף 1 מ ל של הפתרון של 1 x RBC לפירוק (טבלת חומרים), מערבולת, ו הדגירה עבור 10 דקות ב RT.
  7. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 9,600 x g בשעה RT לתאי גלולה.
  8. מכיוון שזיהום תאי דם אדומים. יכול לעכב את ה-PCR
  9. החנות גלולה ב-80 ° c עבור לפחות 1 h עד עיבוד נוסף.
    הערה: באופן אופציונלי, כל דם שנותר משלב 8.4 יכול לשמש עבור ניתוח cy, כמתואר לעיל בשלב 6.

9. החילוץ DNA באמצעות שיטת החילוץ הפרוטאינאז K

  1. לחלץ דנ א של כדורי תא היקפיים (שנוצר בשלב 8.8) באמצעות שיטת החילוץ פרוטטינואז K כפי שמתואר להלן. שיטה זו הוכיחה לחלץ את התשואה DNA הגבוהה ביותר מנפח קטן של דם כגון זה נדרש עבור אוספי הדם הסדרתיים מנוצל במחקר זה19.
  2. הוסף 25 μL של פרוטטינואז K (20 μg/mL) עד 1 מ ל של מאגר טריס 0.1 M.
  3. מערבולת הפתרון הפרוטאינאז K בקצרה.
  4. הוסף 50 μL של הפתרון הפרוטטינואז K לכל גלולה תא להיות מתעכל.
  5. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה ולאשר את ההשעיה של הגלולה התא.
  6. ללחוץ על thermoshaker (טבלה של חומרים) ב 400 סל ד (בהתאם למכשיר) ב 56 ° c עבור 1 h. מנורות למטה כדי להחזיק אותם במקומם, אם יש צורך.
  7. מיד, באותו thermoshaker, הפוך פרוטטינואז K עם שינוי טמפרטורה 95 ° c בעוד הטלטול ממשיך 20 דקות נוספות.
  8. . מערבולת כל דוגמית
  9. מניחים כל מדגם ב-80 ° c למינימום של 30 דקות.
  10. להפשיר, ואז לצנטריפוגה את דגימות ב 17,000 x g עבור 1 דקות בשעה RT כדי גלולה לא רצויות שברים סלולריים.
  11. . לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש
  12. תבנית הדנ א מוכנה. ל-PCR תבניות ה-DNA ניתן לאחסן ב-80 ° c.

10. הוצאת רנ א, סינתזה cDNA, ו ddPCR הקוונפיקציה של רנ א נגיפי

  1. לבודד RNA מפני פלזמה מופבית עם ערכת בידוד RNA וירוס בעקבות פרוטוקול היצרן (טבלת חומרים).
  2. לאחר הוספת המדגם לעמודה, הוסף שלב הטיפול DNase בעמודה כדי להבטיח הסרה של כל ה-DNA בדגימת פלזמה.
    1. עבור כל דוגמה, להוסיף 95 μL של RNase-free DNase פתרון (לערבב 2 μL RNAse-חינם DNase ו 98 μL התגובה מאגר) על העמודה ו-דגירה עבור 15 דקות ב RT.
  3. אחסן את דגימות ה-RNA ב-80 ° c עבור לפחות 1 h לפני עיבוד נוסף. חשוב להקפיא את כל הדגימות לאחר החילוץ RNA למנוע את הסיכון של הטיה בעת השוואת דגימות שלא הוקפאו דגימות כי היו קפואים.
  4. סנתז cDNA באמצעות צעד הפוכה הטרנססקריפט באמצעות ריאגנטים כמתואר בעבר20. הקפד להוסיף 0.5 μL של מעכב RNase לתגובת cDNA כדי למנוע השפלה של RNA.
    1. בצע סינתזה של cDNA עם התוכנית המפורטת בטבלה 5.
  5. אחסן את הדגימות cDNA ב-80 ° c עבור לפחות 1 h. חשוב להקפיא את כל הדגימות לאחר סינתזה cDNA למנוע את הסיכון של הטיה בעת השוואת דגימות שלא הוקפאו דגימות כי היו קפואים.
  6. הכינו דגימות עבור ddPCR כדלקמן20:
    1. מערבבים 3 μL של דגימת cDNA עם 11 μL של התערובת בדיקה ddPCR (אין dUTP)20, 250 ננומטר מינורי groove-מחייב בדיקה, ו 900 nM של כל אחד קדימה והפוך התחל כמפורט בטבלה 6.
    2. כוונן את נפח ה-PCR ל -22 μL עם מים ללא השכרה.
  7. תחליב הPCR מתערבב עם שמן רביב דור לבדיקות על מחולל Droplet בהתאם לפרוטוקול היצרן ולתיאורים הקודמים20.
  8. הפעל את תוכנית ה-PCR כמפורט בטבלה 7.
    הערה: רצף פריימר/בדיקה ותוכניות ה-PCR המוצגות כאן עוצבו במיוחד וממוטבים לאיתור רגיש של מאמץ ה-HIV RHPA4259. פריימר ורצפים בדיקה ניתן בקלות להתאים כדי לזהות כל זן אחר של HIV של בחירה.
  9. זיהוי הקרינה הפלואורסצנטית מהדגימות בקורא droplet, ולנתח את התוצאות עם התוכנה המתאימה בהתאם לפרוטוקול של היצרן.

11. טיפול בעגלת האוכל

  1. להאכיל עכברים עם כדורי המכיל משטר עגלה סטנדרטי המכיל 4,800 מ"ג/ק"ג raltegravir (RAL), 720 mg/kg tenofovir disoproxil fumarate (TDF), ו 520 mg/ק"ג emtricitabine (FTC)21 (שולחן 8). מינונים אלה נקבעו בהנחה כי העכבר שוקל 25 גרם ואוכל 4 גרם של אוכל ליום. זה מתאים למינון יומי של 768 מ"ג/ק"ג RAL, 2.88 מ"ג/ק"ג TDF, ו 83 mg/ק"ג FTC21.
  2. השתמש בדיאטת עגלה שהוכנה על-ידי ספק חיצוני (ראה טבלת חומרים) של תרופות מרשם. חברות אחרות עלולות גם לייצר משטר זה. השתמש בדיאטה עגלה בצבע אדום כדי להבדיל בקלות מהאוכל העכבר הרגיל.
    1. לייצר דיאטה צ'או שליטה ללא עגלה בצבע חום רגיל להבחנה קלה.
  3. לקבלת התחלה של עגלה, להכין כלובים מעוקרים של העכבר עם תוספת של העגלה המכילה הדיאטה צ'או, ולאחר מכן להעביר את העכברים מהכלוב הישן לכלוב החדש.
    1. מעקב אחר משקולות העכברים והצריכה של האוכל המכיל עגלה על ידי בדיקה חזותית כדי להבטיח כי העכברים מסתגלות לשינוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אסטרטגיית העליה לניתוח של טוהר תאי הגזע מתוארת באיור 1. איור 1א – ג מראה את הCD34 המטוהרים + האוכלוסיה והאיור 1ד – F הCD34-flow-באמצעות שימוש כדי להמחיש כי הכמות המינימלית של הCD34 והאוכלוסייה אובדת בתהליך הבידוד. הטוהר של מבודדים CD3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמץ חיסוני חמורה ביותר העכבר נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/jictac (חעוגה) הוא מאוד מתאים להשתלה של תאים אנושיים ורקמות. שני המסלולים החיסונית מולדים מסתגלת בעכברים האלה הם פרוצים. חעוגה ו NSG עכברים הנמל מוטציהSckdc סקאיד שתוצאתה תפקוד פגום T ו-B תא. יתר על כן, עכברים אלה ח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לצוות ביודינין בעלי חיים באוניברסיטת אורהוס, במיוחד גב' יאני Kær למאמצי תחזוקת המושבה ולמעקב אחר משקולות העכבר. המחברים רוצים להודות לפרופסור פלורינה קליין על פיתוח עגלה סטנדרטית לטיפול ולהדרכה. הכימית הבאה הושגה דרך התוכנית לטיפול ב-NIH איידס, חטיבת האיידס, NIAID, NIH: pRHPA. c/2635 (קטלוג 11744) מ ד ר ג'ון Kappes וד ר כריסטינה אוחסנבאואר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Blue padVWR56616-031Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7BD Bioscience557835
CD3 (clone OKT3) FITCBiolegend317306
CD3 (clone SK7) BUV395BD Bioscience564001
CD34 (clone AC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (clone 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263For suspension buffer
dNTP mixLife TechnologiesR0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS)BiowestL0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIStemcell17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Lysing solution 10XBD349202Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton)Falcon352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX)Biolegend422302
Fetal bovine serumSigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
GauzeMesoft157300Should be sterilized prior to use
Heating lampCustom made
Hemacytometer (Bürker-Türk)VWRDOWC1597418
Isoflurane gasOrion Pharma9658
LSR Fortessa X20 flow cytometerBD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approvedSarstedt72692405
Mouse cART foodssniff Spezialdiäten GmbHCustom made product
Mouse restrainerCustom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½"BD304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
Nuclease-free waterVWR chemicals436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kitMacherey-Nagel740691
PCR-approved microcentrifuge tubesSarstedt72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymeraseLife TechnologiesF549S
Pipette tips, sterile, ART 20P BarrierThermoScientific2149P
Proteinase KNEB100005398
QuantaSoft softwareBio-Rad
QX100 Droplet GeneratorBio-Rad1886-3008
QX100 Droplet ReaderBio-Rad186-3003
RBC lysis solutionBiolegend420301
RNase-free DNAse size F + reaction bufferMacherey-Nagel740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitorThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500Dissolve in H20
Softject 1 mL syringeHenke Sass Wolf5010-200V0
Superscript III Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific18080044
ThermoshakerVWR89370-910
Trypane blueSigmaT8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0ThermoFisher Scientific15575-020
Virkon S (virus disinfectant)Dupont7511

References

  1. WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
  2. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  3. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829(2010).
  4. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44(2012).
  5. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  6. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  7. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209(2011).
  8. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257(2010).
  9. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  10. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169(2011).
  11. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  12. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  13. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  14. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  15. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  16. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  17. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  18. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  19. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  20. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  21. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  22. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  23. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  24. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  25. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  26. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  27. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  28. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  29. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  30. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  31. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  32. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118(2018).
  33. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  34. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  35. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  36. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).
  37. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  38. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155HIVCCR5ddPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved