קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

Abstract

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) לתאר רצף משתנה מאוד של מומים התפתחותיים המושרה אתנול, כולל מורפולוגיות הפנים וליקויים נוירולוגיים. עם פתולוגיה מורכבת, FASD משפיע על כ 1 ב 100 ילדים שנולדו בארצות הברית בכל שנה. בשל האופי המשתנה מאוד של FASD, מודלים בעלי חיים הוכיחו ביקורתית הבנה המכונה הנוכחי שלנו של פגמים המושרה בפיתוח אתנול. מספר גדל והולך של מעבדות התמקד בשימוש בדגים כדי לבחון פגמים התפתחותיים המושרה אתנול. Zebrafish לייצר מספר גדול של הופרות חיצוני, מעוקב גנטית, עוברים שקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט בדיוק בעיתוי והמינון של חשיפה אתנול בהקשרים גנטיים מרובים לכמת את ההשפעה של חשיפה האתנול עובריים באמצעות טכניקות הדמיה חיה. זה, בשילוב עם הרמה הגבוהה של שימור של גנטיקה ופיתוח עם בני אדם, הוכיחה הדגים להיות מודל רב עוצמה שבו ללמוד את הבסיס המכונה של הטרוגניות האתנול. עם זאת, חשיפה האתנול משטרי יש מגוון בין מחקרים שונים דג זברה, אשר יש לבולבל את הפרשנות של נתוני דג זברה על פני מחקרים אלה. הנה פרוטוקול כדי כמת ריכוזי האתנול בעוברי דג דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

Introduction

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתאר מגוון רחב של ליקויי נוירולוגיות ו הגולגולת דיסקוורפולוגיות הקשורים לחשיפה האתנול העובריים¹. גורמים מרובים, כולל עיתוי ומינון של חשיפה אתנול ורקע גנטי, לתרום וריאציה של fasd^2,3. בבני אדם, מערכת היחסים המורכבת של משתנים אלה עושה לימוד והבנה של האטיולוגיה של FASD מאתגרת. דגמי בעלי חיים הוכיחו באופן קריטי בפיתוח ההבנה שלנו לגבי הבסיס המכניסטי של האתנול הטרוגניות. מגוון רחב של מערכות מודל בעלי חיים נעשה שימוש כדי ללמוד היבטים מרובים של FASD ותוצאות היו עקביים במידה ניכרת עם מה נמצא בחשיפה בבני אדם⁴. מערכות דגם מכרסמים משמשים כדי לבחון היבטים רבים של fasd, עם עכברים להיות הנפוצים ביותר^5,6,7. רוב העבודה התמקדה פגמים התפתחותיים לחשיפה מוקדמת של אתנול⁸, למרות מאוחר יותר חשיפה לאתנול הוכח לגרום לחריגות התפתחותיות כמו גם⁹. יתר על כן, היכולות הגנטיות של עכברים סייעו מאוד היכולת שלנו לחקור את בסיס גנטי של fasd^10,11. מחקרים אלה בעכברים מצביעים מאוד על כך יש אינטראקציות ג'ין אתנול עם מסלול קיפוד סוניק, חומצה retinoic איתות, סופראוקסיד dismutase תחמוצת חנקן סטנדרטים I, Aldh2 ו Fancd2^{8,10,11,12,13,14,15},¹⁶, 17, 18, 5^{, 19,19,19, 19,20,21}. מחקרים אלה מראים כי מודלים בעלי חיים הם קריטיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של FASD ואת המנגנונים הבסיסיים שלה.

דג דג זברה התפתחה כמערכת דגם רב עוצמה כדי לבחון היבטים רבים של אתנול teratogenesis^22,23. בשל ההפריה החיצונית שלהם, פוריות גבוהה, מעקב גנטי, ויכולות הדמיה חיה, מתאימים באופן אידיאלי לגורמי לימוד כגון עיתוי, מינון, וגנטיקה של האתנול teratogenesis. האתנול יכול להינתן לעוברים מבויים בדיוק והעוברים יכולים להיות בתמונה כדי לבחון את ההשפעה הישירה של אתנול במהלך תהליכים התפתחותיים. עבודה זו יכולה להיות קשורה ישירות לבני אדם, כי התוכניות הגנטיות של הפיתוח הם שימור מאוד בין דג ובני אדם ולכן יכול לעזור להנחות FASD מחקרים אנושיים²⁴. בעוד דגים שימשו כדי לבחון את האתנול teratogenesis, חוסר הסכמה בדיווח ריכוזי אתנול עובריים עושה השוואה לבני אדם קשה²⁵. במערכות היונקים, רמות אלכוהול בדם מתאם ישירות לרמות האתנול של רקמות²⁶. רבים ממחקרי הדגים מתייחסים לעוברים לפני היווצרות מוחלט של מערכת הדם שלהם. ללא מדגם אימהי לבחון, תהליך להערכת ריכוזי אתנול נדרש כדי לכמת את רמות האתנול בתוך העובר. כאן אנו מתארים תהליך לכמת ריכוזי אתנול בתוך העובר בפיתוח דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז שטח הראש.

Protocol

כל העוברים דגים בשימוש בהליך זה הועלו והתרבו בעקבות הוקמה פרוטוקולים IACUC²⁷. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס באוסטין ובאוניברסיטת לואיוויל.

הערה: קו הדגים Tg (fli1: EGFP)^y1 שימש במחקר זה²⁸. כל המים המשמשים בהליך זה הוא סטרילי מים אוסמוזה הפוכה. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות ה8.2.1 מנסרה.

1. הפיכת מדיה לעובר

1. כדי להפוך את מלאי 20x של מדיה העובר, לפזר 17.5 g של הנרוג, 0.75 g של KCl, 2.9 g של CaCl₂, 0.41 g של K₂hpo₄, 0.142 g של NA₂Hpo₄, ו 4.9 g של mgso₄· 7h₂O ב 1 ליטר של מים. התעלם מהזרז הלבן בטפסים; פעולה זו לא תשפיע על המדיה. המסנן מעקר את פתרון המניה ומאחסן אותו ב-4 ° c.
2. כדי ליצור את פתרון המדיה העובר עובד, לפזר 1.2 g של נחקו₃ ב 1 L של 20x העובר מניות מדיה ולהוסיף 19 L של מים. שמרו על פתרון המדיה של העובר הפועל ב -28 ° c.

2. מדידת נפח עובריים באמצעות הזחה במים

הערה: בפרוטוקול זה, משמשות 24 שעות הפריה (hpf) עוברים (איור 1). העוברים המשמשים במדידות אמצעי האחסון אינם משמשים בניתוח האתנול.

1. מקום 10 עוברים ונוזלים מתחלקים ב 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח של 250 μL (איור 2א). הוסיפו מים לקו המילוי של 250 μL (ראו דגימת מים צבועים באיור 2ב').
2. חזור על שלב 2.1 כדי להגדיר את נפחים עבור עוברים שהוסרו מורמונים.
   1. כדי להסיר את chorion, למקם את העוברים בתוך כורכותיהם בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 2 מ"ג/mL של קוקטייל פרוטאז במדיה העובר בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות. כל כמה דקות, מערבולת בעדינות את העוברים כדי לשבור את הצ.
   2. לאחר כל העוברים הם חופשיים chorion שלהם, להסיר את העוברים מתוך מדיה העובר הפרוטאז/קוקטייל מקום חדש 100 מ"מ צלחת פטרי עם מדיית העובר טרי לשטוף את העוברים. חזור על השטיפה הזאת עוד פעם אחת (בסכום של 2 שטיפות). העבירו את העוברים לצלחת פטרי חדשה 100 מ"מ.
3. בעזרת הטיפ הקטן ביותר האפשרי ומבלי לפגוע בעוברים, הסירו בזהירות את כל הנוזלים מסביב לעוברים באמצעות p200 מיקרופיפיאור (איור 2ג) ושוקלים את המים בקנה מידה עם < 0.1 מ ג בדיוק. כדי לקבוע את נפח המדגם של 10 עוברים, להפחית את המשקל/הנפח של המים (1 mL של מים = 1 גרם של מים.) הוסרו מ 250 μL. כדי לקבוע את הנפח של העובר בודד, לחלק את ההפרש בין 250 μL ואת משקל המים הוסרו על ידי 10.

3. טיפול בעוברים באתנול

1. אסוף עוברים ממיכלי ההזדווגות ומקום בצלחת פטרי 100 מ"מ סטנדרטית. לספור את לא יותר מ 100 עוברים לכל צלחת פטרי אחת הדגירה ב 28.5 ° c.
   הערה: אם chorion יוסר (שלב 2.2), זה צריך להיות מוסר לפני הוספת אתנול.
2. ב 6 hpf, להוסיף עד 100 עוברים תקן חדש 100 מ"מ צלחת פטרי או עם העובר מדיה או העובר מדיה + 1% אתנול (v/v). כיסוי, אבל לא לאטום את צלחת פטרי. מניחים את העוברים בחממה הטמפ ' הנמוכה שנקבעה ב-28.5 ° צ' למשך 18 שעות, או עד שהעוברים יגיעו לנקודת הזמן ההתפתחותית של 24 hpf.

4. הכנת זרימת עבודה לפני עיבוד העוברים עבור גז החלל הראשי כרומטוגרפיה

1. לעשות פתרון של 5 M הנאל במים (450 μL יהיה צורך בכל שפופרת לדוגמה) כדי להפוך את כל החלבונים ולמנוע חילוף החומרים אתנול. הפוך את קוקטייל הפרוטאז (טבלת חומרים) בריכוז של 2 מ"ג/mL במדיה העובר.
2. תווית a 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ו 2 mL גז כרומטוגרף בקבוקון עבור כל מדגם. תווית נוספת 2 מ ל כרומטוגרף גז מבחנות עבור תקני האתנול שתוארו להלן, כמו גם אוויר, מים, ו 5 כדורי משקה מדיום/פרוטאז.
3. כוונן שלושה p200 מיקרופיפטורים שניים מוגדרים ל-50 μL, והקבוצה השלישית ל-200 μL; p1000 מיקרופיפיאו מוגדר ל-450 μL ומיקרופיפיפיפיאור p2 מוגדר ל-2 μL. עבור פיפטות זכוכית המשמש להעברת עוברים מצלחות פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, במהירות לעבור את העצה באמצעות הלהבה כדי להחליק את הקצוות כדי לא לפגוע העוברים כאשר למשוך אותם לתוך הפיפטה.

5. עיבוד עוברי גז כרומטוגרפיה בחלל הראש

הערה: שני העוברים בורחוריהם ואלה שהוסרו בעבר מהורמונים שלהם מטופלים באופן זהה לעקביות בחישוב גורמי דילול.

1. באמצעות שני p200 מיקרופיפטורים להגדיר ל50 μL, לצייר 50 μL של פתרון הקוקטייל פרוטאז לתוך אחד ולצייר 50 μL של מים אל השני.
2. באמצעות פיפטה זכוכית ומיקרופיפיאור, מניחים במהירות 10 עוברים (משלב 3.2) בצינור המיקרו-מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL וסוגרים את המכסה (כמתואר באיור 2א). חזור על כל הדגימות כדי להיבדק, פקדים, והעוברים שטופלו אתנול.
3. באמצעות p200 מיקרופיפיאור להגדיר μL, 200 לפתוח במהירות את כובע ולהסיר את כל מדיית העובר שיורית (כפי שמתואר באיור 2ג). מקום במהירות את הפיפטה המכיל 50 μL של מים בצינור במהירות אך בעדינות (לא לפגוע העוברים) להוסיף, ולאחר מכן להסיר את המים. הוסף במהירות 50 μL של פתרון קוקטייל פרוטאז מתוך הפיפטורים הממתינים וסגור את כובע הצינור (איור 2ד).
   הערה: בצע תהליך זה מדגם אחד בכל פעם.
4. תן את המדגם לשבת ב-RT עבור 10 דקות כדי לאפשר קוקטייל פרוטאז לבזות את chorion. לאחר מכן, להוסיף במהירות 450 μL של 5 M הנאל ולסגור את כובע הצינור (איור 2E). מערבולת הדגימות עבור 10 דקות. כדי להאיץ את התהליך, להגדיר את המיקסר כדי מערבולת דגימות מרובות באותו זמן.
   הערה: הוסף כמות קטנה (~ 100 μL) של תערובת חרוזים סיליקה (2 גדלים, 0.5 מ"מ ו 1 מ"מ חרוז) לכל צינור עם עוברים מבוגרים יותר 24 hpf. בעוברים מבוגרים, מיתר הנוטואקורד יישאר שלם בלי קשר לכמה זמן הם הומוגניים.
5. לאחר הומוגניזציה עבור 10 דקות, להסיר במהירות 2 μL של העובר הומוגניים מוליך supernatant ולהוסיף בקבוקון כרומטוגרף גז. אטום במהירות את המבחנה. עם כובע הפוליטאואתילן

6. הכנת תקני תקשורת ואתנול

1. כדי להכין את תקני המדיה, לדלל את המדיה על ידי פקטור של 10 עם פתרון של 5 M/פרוטאז קוקטייל. הוסף 2 μL של כל מדגם לבקבוקון כרומטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארברואואתילן.
2. כדי להכין את תקני אתנול, ליצור דילול סדרתי של 100% אתנול בתוך 5 M התקן/פרוטאז הפתרון לריכוזים הבאים: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, ו 40 mM. הוסף 2 μL של כל תקן לבקבוקון כרומאטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארבאואתילן.

7. הכנת כרומאטוגרף גז החלל הראשי

הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את ההתקנה והפרוטוקול בהתאם לשימוש בכרומטוגרף הגז. גז כרומטוגרפיה של החלל הראשי משמש לכמת רמות אתנול, לא להפרדה.

1. הגדר את התנור עבור הדגם האוטומטי עד 58 ° c והפעל. אפשר את החימום כדי להגיע 58 ° c, ולהדליק את האוויר ואת קווי גז מימן האכלה כרומטוגרף גז (להבה יינון המשמש לכמת את האתנול).
   הערה: psi צריך להיות מוגדר כראוי להפעיל את chromatograph על פי מפרטים של היצרן. וודא שקו ההליום מופעל. ומכוון למסילה הנכונה
2. בשביל המחיצה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו > 100. עבור סיבי ההזרקה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו > 500.
   הערה: אם מדובר על כמות הזריקות, יהיה עליהם לשנות אותם לפני הפעלת דגימות הבדיקה.
3. הפעל את תוכנת הניתוח וודא שתחנת העבודה מוגדרת כראוי. אחסן את כל הנתונים לפי תקני מעבדה/מחלקה. צור רשימה מדגם חדשה כדי שהדגימות יופעלו.
4. הפעל את שיטת ההפעלה והמתן עד שגלאי הלהבה לייצוב יתייצב לפני הפעלת הדגימות. פעם אחת יציבה, הפעל את שיטת ההפעלה של התוכנה כדי לנקות את סיבים.

8. מדידות לדוגמה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

1. לאחר השלמת שיטת האתחול, צור שורה חדשה אחת לכל מדגם ברשימה לדוגמה. מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח, טען 436 שליטת האתנול spme 2013 3min לקלוט 2_5min rg לרוץ. מתאמפטמין עבור כל דוגמה ברשימת המדגם.
   1. מלאו את הרשימה לדוגמה, החל מהאוויר, מים, 5 כדורי משקה מדגם "נl/פרוטאז". לאחר מכן הזן את הסטנדרטים לפי סדר, מ 0.3125 עד 40 mM. עקבו אחר הסטנדרטים בסיבוב השני של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.
   2. הזן את כל דגימות סופר הומוגניים העובר כדי להיבדק, מן הנמוך ביותר לריכוז האתנול החזוי ביותר. מסתיים בכניסה לסיבוב השלישי והאחרון של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.
2. הוסף את מבחנות כרומטוגרף הגז לדגם האוטומטי בסדר בו הוזנו הדגימות. אפשר דוגמאות לחימום במשך 10 – 15 דקות. הפעל את הדוגמה המופעלת בתוכנה.
3. לאחר הפעלת כל הדגימות והרווחים הסופיים, הפעל את שיטת הכיבוי בתוכנה על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימה לדוגמה והפעלה במצב המתנה. לילא. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הפעלת המדגם. כבו את הציוד בסדר הבא: מדוד חימום אוטומטי, מיכל מימן, רק לאחר טמפרטורת chromatograph מגיע 30 ° c, מיכל האוויר. תשאיר את מיכל ההליום. כדי לשמר את עמוד השעווה

9. לדוגמא שילוב של מפיק האתנול וניתוח ריכוז לדוגמה

הערה: כל הערכים מ-9.3 ב-, חושבו בקובץ excel שכל המשוואות התמלאו מראש.

1. לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומאטוגרם הפתוח . פתח את התיקיה המכילה את התוצאות. דגימות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו.
2. בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו (פסגות האתנול בין 2 ל-2.5). לאחר שכל הדגימות אושרו, להדפיס או לייצא את התוצאות.
3. התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף. חישוב השיפוע, Y ליירט ו-R² ערכים עבור תקני אתנול (r² צריך להיות > 0.99).
   הערה: ערכים אלה ישמשו לקביעת ריכוז האתנול מגובה המדגם.
4. לכל דוגמה, הפחת את גובה השיא של המדגם מנקודת החיתוך של ה-Y של תקני האתנול. חלק ערך זה על-ידי השיפוע של תקני האתנול כדי להשיג את ערך האתנול עבור כל מדגם בבקבוקונים GC.

5. כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב תחילה את פקטור הדילול עבור כל דוגמה. לקחת את אמצעי האחסון מחושב בשלב 2.3 של פרוטוקול זה ולחלק אותו על ידי מדידת אמצעי האחסון בתוספת 500 μL. זה מייצג את התמיסה 5 מ ' ליטר/פרוטאז שנוספו לכל מדגם במהלך עיבוד העובר (שלבים 5.3 ו 5.4).

6. בעזרת פקטור הדילול לדוגמה, הכפל לפי ערך האתנול לדוגמה עבור כל דוגמה. התוצאות יהיו בריכוז mM. חישוב דגימות של הפניית מדיה על-ידי הכפלת ערך האתנול של המדיה בפקטור הדילול של 10.

תוצאות

רמות האתנול בדם לא יכול להיקבע ב zebrafish מוקדם, כי הם חסרי מערכת הדם שנוצר במלואו. כדי לקבוע את רמת הריכוז האתנול בעוברי הדגים דג זברה, רמות האתנול נמדדות ישירות מרקמת הומוגניים מעובריים. כדי למדוד כראוי את ריכוזי האתנול עובריים, נפח עובריים יש לקחת בחשבון. העובר (החלמון מוצמד) יושב בתוך הצ (קל?...

Discussion

כמערכת מודל התפתחותית, הדגים מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של גורמים סביבתיים בפיתוח. הם מייצרים מספר גדול של עוברים מופרות חיצוני, אשר מאפשר תזמון מדויק ומינון בלימודי אתנול. זה, בשילוב עם יכולות הדמיה חיה ושימור גנטי והתפתחותי עם בני אדם, להפוך את הדגים מערכת מודל רבת עוצמה ללימודי ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air			Provided by contract to the university
Analytical Balance	VWR	10204-962
AutoSampler, CP-8400	Varian		Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride	VWR	97062-590
Ethanol	Decon Labs	2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL	Agilent	8010-0198	Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800	Varian
Helium			Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column	Agilent	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen			Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate)	Fisher Scientific	M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Fisher Scientific	2682002
Micropipette tips 10 μL	Fisher Scientific	13611106
Micropipette tips 1000 μL	Fisher Scientific	13611127
Micropipette tips 200 μL	Fisher Scientific	13611112
Petri dishes 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette	Gilson	FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap	Agilent	5190-7021	Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Silica Beads .5 mm	Biospec Products	11079105z
Silica Beads 1.0 mm	Biospec Products	11079110z
Sodium Bicarbonate	VWR	BDH9280-500G
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane	Millipore Sigma	57343-U	Replacement fibers
Star Chromatography Workstation	Varian		Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa	Millipore Sigma	23154	Replacement inlet septa