JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי להמחיש ולנתח את העורקים קשת הלוע 3, 4, ו 6 עוברי העכבר באמצעות החיסונית של הר שלמים, ניקוי רקמות, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, ו-3d שחזור.

Abstract

היווצרות לא תקין או שיפוץ של העורקים קשת הלוע (PAAs) 3, 4, ו 6 לתרום כמה צורות חמורות ביותר של מחלת לב מולדים. כדי ללמוד את היווצרות של paas, פיתחנו פרוטוקול באמצעות שימוש מלא החיסונית של האנטי-משתמשים בשילוב עם בנזיל אלכוהול/בנזוקסיל (babb) ניקוי רקמות, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי. הדבר מאפשר הדמיה של קשת הלוע ברזולוציה תאית משובחת, כמו גם את הקישוריות 3D של ואצלב. באמצעות תוכנה, הקמנו פרוטוקול לכמת את מספר תאי האנדותל (ECs) ב PAAs, כמו גם את מספר ECs בתוך מקלעת כלי הדם המקיפים את PAAs בתוך קשתות הלוע 3, 4, ו 6. כאשר הוא מיושם על כל העובר, מתודולוגיה זו מספקת הדמיה מקיפה וניתוח כמותי של ואצלב עובריים.

Introduction

במהלך הembryogenesis העכבר, העורקים קשת של הלוע (PAAs) להתעורר כמו סימטרי, דו צדדי העורקים של עורק המחברים את הלב עם aortae1. כאשר העובר מתפתח, הזוג הראשון והשני של הסגת הדרך של PAAs, בעודהשלישי, 4th, ו-6ה paas לעבור סדרה של אירועים שיפוץ סימטרי כדי ליצור את העורקים קשת של אבי העורקים2.

PAAs 3, 4 ו 6 להתפתח באמצעות vasculogenesis, שהוא היווצרות דה נובו של כלי הדם3. פגמים בהיווצרות או שיפוץ של עורקי קשת אלה להצמיח מומים לב מולדים שונים, כמו אלה שנראו בחולים עם תסמונת digeorge4,5. לכן, הבנת מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של PAAs יכול להוביל להבנה טובה יותר של מחלת לב מולדים (CHD) האטיולוגיה.

גישות נוכחיות להמחיש ולנתח צפות פיתוח כוללים immunofluorescence מפרקים רקמות, כלי דם, הזרקת דיו הודו, מיקרוסקופ האפיסקופלית ברזולוציה גבוהה, ו/או שלמים-הר אימונוהיסטוכימיה1,4,5,6,7. להלן, אנו מתארים פרוטוקול המשלב המכלול שילוב של החיסונית, המיקרוסקופיה ועיבוד תמונה תלת-ממדית כדי לאסוף, לנתח, ולכמת נתונים נפחי, קישוריות כלי דם וזהות התא. עוד, אנו לפרט שיטה למדר ולכמת את המספרים של ECs בכל קשת הלוע כאמצעי ללמוד היווצרות של קשת הלוע מקלעת כלי הדם ואת שיפוץ לתוך PAAs. בעוד פרוטוקול זה מיועד לניתוח פיתוח צפות, ניתן להשתמש בו כדי לנתח אחרים לפיתוח רשתות כלי דם.

Protocol

השימוש בבעלי חיים ונהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת רטגרס.

1. הכנת פתרונות

  1. להכין 1 L של פוספט מלוחים באגירה עם 0.1% טריטון-X-100 (PBST) ומסנן לעקר. ניתן לאחסן פתרון זה בטמפרטורת החדר (RT) למשך שנה לפחות.
  2. להכין 600 μL של חסימת מאגר המורכב 10% של סרום חמור נורמלי PBST. הפוך פתרון זה לטרי בכל פעם.
  3. הכן 50 mL של המתנול הבאים (MeOH) מדלל במכסה המנוע: 25% ממנו במים מייהים (dH2O), 50% Meoh ב dh2o, ו 75% meoh ב dh2o. מערבולת לערבב. חנות ב-RT.
  4. הכינו 50 mL של פתרונות האלכוהול בנזוקסיל (BABB) הבאים בתמיסה של 50 מ"ל.
    1. עבור 100% BABB, להוסיף 32 מ ל של בנזיל בנזואט 16 מ ל של אלכוהול בנזיל (2:1 נפח ליחס הנפח).
    2. עבור 50% BABB, להוסיף 16 מ ל של בנזיל בנזואט ו 8 מ ל של אלכוהול בנזיל כדי 24 מ ל של MeOH.
    3. כיסוי צינורות חרוט ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור. ניתן לאחסן פתרונות אלה ב-RT למשך שנה.
      זהירות: BABB הוא רעיל ומאכל. יש לטפל בו ולהסולק בהתאם ל-MSDS.

2. ניתוח וקיבוע העובר

הערה: פרוטוקול זה מתאים ל-E 9.5 ו-E 10.5 עוברי העכבר (זכר או נקבה) מבודדים מכל זן העכבר. עבור עוברים צעירים ומבוגרים, incubations פעמים צריך להיות מקובע כדי למקסם את האות ליחס הרעש של האות הפלואורסצנטית.

  1. מלאו 1 35 מ"מ ו 1 60 מ"מ מנות פטרי עם PBS 1x ו מקום על הקרח עד הצורך.
  2. המתת חסד בעכבר בהריון באמצעות שאיפת CO2 . לבצע פריקה צוואר הרחם כמדד משני של המתת חסד.
  3. נקו את אזור הבטן של הסכר עם 70% אתנול. לצבוט באזור הבטן באמצעות מלקחיים ולעשות חיתוך כמו V באמצעות מספריים כירורגית החל מהבסיס של קיר הבטן באמצע הקו; המשיך לפתוח את חלל החזה. הרם את רקמת הבטן והזז את המעיים לצד כדי לחשוף את קרני הרחם.
  4. לעשות חתך בבסיס של תעלת הנרתיק, עם מלקחיים, למשוך את הרחם הרחק מן הסכר. לבצע חיתוך נוסף על כל השחלה כדי לשחרר את הרחם. העבר את הרחם לאחת ממנות ה-60 מילימטר המכילות את ה-PBS הקרה 1x.
  5. באמצעות מספריים ישרים, חותכים את קיר הרחם בין כל אתר השרשה. תרימי את ההחלטה עם מחית זכוכית ולהעביר לתוך צלחת פטרי 35 mm עם 1x PBS. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, הכנס מספריים ישרים לחלל שבין הדצידואה לבין קיר הרחם. לחתוך ולהסיר את הקיר הרחם.
  6. עם מלקחיים בסדר, להסיר את ממברנות של Reichert מן העובר על ידי בזהירות ביצוע חתכים רוחבי לאורך הרקמה ומשיכת הרקמה הרחק שק החלמון. הסרת שק החלמון ואת שק השפיר על ידי משיכת בזהירות את הרקמה הרחק העובר וביצוע חתכים באלאנטוזה וריד הטבור.
    הערה: שקי החלמון יכולים לשמש עבור עוברי הגנוקים.
  7. העבר כל עובר עם זכוכית ללטף לתוך היחידה 2 מ ל צינורות ממולא 1 מ ל של 1x PBS. סמן כל צינור עם מזהה ייחודי.
  8. כדי לתקן עוברים, להסיר בזהירות את ה-PBS 1x ולהוסיף 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (בשיא) ב 1x PBS. מודטה ב -4 ° c עם עצבנות עדינה בן לילה.
    הערה: 4% קיבעון בכדורגלן מתאים לנוגדנים שהוזכרו בפרוטוקול זה. עם זאת, הליכי קיבוע יש למטב עבור נוגדנים נוספים.

3. צביעת העובר

הערה: בחלק זה העוברים מחלחלים ומוכתמים בנוגדנים ראשיים ומשניים. בגלל התפתחות צפות ההכנסות במהירות, הבדלים בשלב עובריים ישפיע מאוד על הניתוח במורד הזרם. לכן, עוברים חייב להיות מתאימים לגיל על ידי ספירת מאוד בזהירות כדי להתאים בקרת וזוגות מוטציה לפני מניפולציות נוספות.

  1. כדי לשטוף את העובר (ים), הסר בזהירות 4% בכיוון הערוץ והוסף 1x PBS. הפוך בעדינות את הצינור (ים) מספר פעמים. מניחים שפופרת (s) בצד ימין ומאפשרים לעובר לשקוע. . חזור על הכביסה 3 פעמים מניחים את הצינור (עם) העובר על הקרח.
    הערה: (נקודת עצירה אופציונלית) בעקבות השטף, העוברים יכולים להיות מיובשים בסדרה מדורגת של MeOH עבור 30 דקות לדילול, כמו בסעיף 1.3, ומאוחסן ב-20 ° צ' ב 100% MeOH לשימוש מאוחר יותר עד 6 חודשים.
  2. עבור E 10.5 עוברים, להשתמש בפייפט זכוכית להעביר עובר אחד לצלחת פטרי 35 מ"מ מלא מקורר 1x PBS. בזהירות לצבוט את העובר ממש מעל הגפיים האחוריות עם מלקחיים עדינים ולעשות חתך רוחבי כדי להסיר את החצי האחורי של העובר. זה מאפשר לעובר לשכב שטוח בעמדה משונן עבור שלב 4.2. מניחים את העובר בחזרה לצינור 2 mL עם חדש 1x PBS.
    הערה: שליטה ומוטציה העובר יכול להיות מזווג ומוכתם עם פתרון נוגדן זהה בצינור אחד, עבור שלבים 3.3 עד 3.8.
    1. אם צביעת שני עוברים יחד, לחתוך את הראש של עובר אחד מעל קשת הלוע הראשון על ידי צובט עם מלקחיים עדינים לעשות חתך רוחבי. זה יהיה להבחין בין עוברים של שני גנוטיפים שונים בתוך כל צינור.
  3. כדי לחלחל את העובר (ים), החוצה 1x PBS מהצינור, להיות זהירים לא לגעת העובר (ים). הוסף 1 מ ל של PBST. הניחו את הצינור ב -4 ° c עם עצבנות עדינה בן לילה.
    הערה: (נקודת עצירה אופציונלית) העוברים יכולים להישמר בפתרון PBST ב -4 ° c למשך מספר ימים.
  4. כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים, הסר תחילה את PBST מהצינור, והיזהר שלא לגעת בעובר (ים). הוסף 600 μL של חסימת פתרון המאגר לעובר (ים). חסום את העובר (ים) ב -4 ° c עם עצבנות עדינה בן לילה.
    הערה: חסימת הפתרון צריך להיות מסובב במהירות העליונה על צנטריפוגה שחקן הספסל מיד לפני השימוש כדי להסיר את הפסולת.
  5. כדי להכתים ולכמת ECs, להשתמש נוגדנים נגד VEGFR2 ו ERG. פתרונות נוגדן נעשים במאגר חסימת. Anti-VEGFR2 הנוגדן הוא מדולל 1:200 ו-ERG נוגדן הוא מדולל 1:1000.
    הערה: פתרונות נוגדן צריך להיות מסובב במהירות העליונה על צנטריפוגה הספסל מיד לפני השימוש כדי להסיר חלקיקים.
    1. כדי להסיר את העובר (עם) עם נוגדנים ראשוני, הסרת פתרון מאגר חסימת מהצינור, להיזהר לא לגעת העובר (ים). הוסף 600 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל צינורית. העובר הדגירה (s) ב 4 ° צ' עם עצבנות עדינה עבור 4-5 ימים.
  6. כדי לשטוף את העובר (עם) של פתרון הנוגדן, ראשית להסיר את פתרון הנוגדן העיקרי מהצינור. רוחצים את העובר (ים) כל שעה עם 1 מ ל של PBST בטמפרטורת החדר (RT) עם עצבנות עדינה. שוטפים את העובר (ים) 4-5 פעמים במהלך היום ולאחר מכן מודנות ב -4 ° c עם עצבנות עדינה בן לילה. חזור על שוטף ביום שלמחרת.
  7. להפוך פתרונות נוגדן משני על ידי דילול נגד עז אלקסה Fluor 488 ונגד עכבר אלקסה Fluor 555 1:300 במאגר חסימת. לדלל את המניה DAPI 1:1000 במאגר חסימת.
    הערה: פתרונות נוגדנים חייב להיות מסובב במהירות העליונה על צנטריפוגה הספסל מיד לפני השימוש כדי להסיר חלקיקים. בנוסף, ניתן להשתמש בצבעים אחרים של אלקסה Fluor במקום 488 או 555.
    1. כדי להסיר את העובר (ים) עם נוגדנים משניים, הסר PBST מהצינור. הוסף 600 μL של פתרון נוגדן משני לכל צינורית. העובר הדגירה (s) ב 4 ° צ' עם עצבנות עדינה עבור 4-5 ימים.
  8. כדי לשטוף את העובר (עם) של פתרון נוגדן, תחילה להסיר את פתרון הנוגדן המשני מהצינור. לשטוף את העובר (ים) כל שעה עם 1 מ ל של PBST ב RT עם עצבנות עדינה. שוטפים את העובר (ים) 4-5 פעמים במהלך היום ולאחר מכן מודנות ב -4 ° c עם עצבנות עדינה בן לילה. חזור על שוטף ביום שלמחרת.

4. הטמעת עוברים בצמח

הערה: בסעיף 4, העובר (ים) יוטבע בתוך הצמח. תהליך הטבעה זה משרת שתי מטרות: כדי לכוון כהלכה את העובר לפני ההדמיה, ולסייע באיתור העובר לאחר שנוקה ב-BABB (שלבים 5.2.2-5.3.2).

  1. הכינו 200 mL של 1% הפתרון השני על ידי הוספת 2 גרם של agarose ל 200 מ ל של dH2O. מיקרוגל עד התפרקה כל.
    הערה: ניתן לאחסן את הצמח הנותר ב-4 ° צ' ולחמם מחדש לשימושים מאוחרים יותר.
  2. באמצעות עובש פרפין פלסטיק זכוכית pipet, בעדינות להעביר עובר אחד את העובש. הסירו בזהירות את PBST מהעובר. מניחים את העובר בתנוחה משונן. במהירות, להוסיף כ 0.5 mL של העלה חם על העובש-רק מספיק כדי לכסות את העובר ולמלא את העובש. ודא כי בועות אוויר לא להקיף את העובר.
  3. מניחים את העובש על הקרח ומכסים ברדיד אלומיניום עד שהגעלה התחזק.
    הערה: אל תאפשר לעובר להתייבש בעקבות הסרת PBST. פתרון agarose חייב להיות חם מספיק כדי להישאר נוזלי כאשר הוא מתווסף לעובר. הוסף רק מספיק כדי לכסות את העובר, אבל לא יותר מדי, אחרת זה יהיה קשה לתמונה. עומק התמונה נקבע בחלקו על-ידי מרחק העבודה של המטרה.

5. התייבשות וניקוי רקמות

הערה: בסעיף זה, העובר (ים) מיובשים באמצעות סדרת מתנול, ולאחר מכן מנוקה הממס אורגני, BABB, ו רכוב בין שתי שמיכות מופרדים על ידי מרווח גומי; בפרוטוקול זה מרווחים מהיר היטב גומי משמשים. הפגוש הטוב מהיר יש משטח דבק דו צדדי. החלל צריך ליצור באר, שבו העובר ימוקם ומוחזק בין שתי שמיכות.

  1. התייבשות מתנול
    1. התווית החדשה 2 מ ל צינורות, אחד לכל עובר. הוסף 1 מ ל של 25% MeOH לכל צינור.
    2. באמצעות אזמל נקי, בעדינות לחתוך את הצמח סביב העובר, משאיר מספיק סביב העובר, כך שניתן לאסוף על ידי מלקחיים. השתמש מלקחיים עדינים לתפוס בעדינות את הצמח עם העובר מוטבע ומניחים אותו לתוך הצינור עם תווית 25% MeOH. אל תאפשר ללקחיים לגעת בעובר.
    3. העובר דגירה (עם) ב RT עם עצבנות עדינה במשך שעה אחת בחושך.
    4. הסר 25% MeOH מתוך הצינור, להיזהר לא לגעת העובר. הוסף 1 מ ל של 50% MeOH לכל צינור. מודטה ב-RT עם עצבנות עדינה למשך שעה אחת בחשיכה.
    5. הסר 50% MeOH מהצינור, להיזהר לא לגעת העובר. הוסף 1 מ ל של 75% MeOH לכל צינור. מודטה ב-RT עם עצבנות עדינה למשך שעה אחת בחשיכה.
    6. הסר 75% MeOH מהצינור, להיזהר לא לגעת העובר (ים). הוסף 1 מ ל של 100% MeOH לכל צינור. מודטה ב-RT עם עצבנות עדינה למשך שעה אחת בחשיכה. חזור על 100% ממני לשטוף פעמיים.
  2. ניקוי עם BABB
    1. הסר 100% MeOH מהצינור, להיזהר לא לגעת העובר. הוסף 1 mL של 50% BABB לצינור. מודטה ב-RT עם עצבנות עדינה למשך שעה אחת בחשיכה.
    2. הסר 50% BABB מהצינור, להיזהר לא לגעת העובר. הוסף 1 mL של 100% BABB לצינור. מודטה ב-RT עם עצבנות עדינה למשך שעה אחת בחשיכה. חזור על 100% באבט לשטוף פעמיים.
      הערה: (נקודת עצירה אופציונלית) העוברים יכולים להישאר ב-100% BABB בצינורות במשך כשבוע. אחסון ארוך יותר יגרום BABB לפזר את הפלסטיק של צינורות.
  3. עוברים הרכבה להדמיה
    1. במקום הפגוש היטב במהירות על 24 מ"מ x 60 מ"מ #1 המכסה זכוכית 0.5 מכסה, על ידי קילוף את הדבק פלסטיק מצד אחד. ודא כי אין בועות אוויר בין coverslip ואת הפגוש על ידי החלת לחץ עדין על דבק פלסטיק על גבי הפגוש גומי. סמן את העטיפה בהתאם למספר העובר, גנוטיפ ונוגדנים המשמשים לצביעת.
      הערה: כל מרווח יכול להיות ממוקם בין הכיסויים כל עוד הוא עבה מספיק כדי למנוע ריסוק או השרבוט עובר. אנו משתמשים מרווחים היטב גם בשל העובי והנוחות שלהם, הכולל משטחי דבק משני צדי החלל לאבטח אותו לכיסויים.
    2. בזהירות ללטף את החוצה ולמחוק את 100% BABB מהצינור. לאחר להמחיש את agarose העובר מוטבע בצינור, להשתמש מלקחיים עדינים כדי להרים את agarose ובזהירות להעביר את העובר על הכיסויים בתוך הבאר מהיר-לא לאפשר מלקחיים לגעת העובר.
    3. להסיר את הדבק פלסטיק השני מן הפגוש ולמקם את הכיסויים השני על גבי. להסיר בועות אוויר על ידי לחיצה עדינה על הכיסויים. . תיזהר לא לשבור את הזכוכית
      הערה: ניתן לאחסן דגימות שטוחות במחזיק שקופיות בחשכה בחשיכה במשך עד שנה אם החותם הדוק.

6. רכישת נתונים

הערה: בשלבים הבאים, האנדותל של קשתות הלוע 3, 4, ו-6 יהיו מיוצרים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית.

  1. מיקום שקופיות על במת מיקרוסקופ
    1. כדי עוברי התמונה, להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלית מאובזר עם מטרה טבילה 20x מים, הצמצם מספרית 0.95, מרחק עבודה 0.95 מ"מ, ו-שניס רכיבים AR 5.11.01 64-bit תוכנה.
    2. באמצעות פלואורסצנטית רחב השדה, לאתר חזותית קשתות הלוע. מרכז את תצוגת השדה סביב הצפות 4th .
    3. אם שדה התצוגה של המטרה אינו תופס את כל אזור קשת הלוע כולו, לקחת ולתפור פאנל גדול של תמונות עם 1% חפיפה. כדי למנוע תנועה של המדגם במהלך רכישת התמונה הגדולה, לאבטח בעדינות את מכלול כיסוי לשלב באמצעות דפוס חימר.
  2. הגדרת פרמטרי רכישה
    1. הגדר את גודל החור ל1.0.
    2. תחת הכרטיסייה רכישה ND , הגדר את המגבלות העליונות והתחתונות של הדמיה באמצעות ההתאמה הגסה. קבע גודל שלב Z בהתאם למפרטי התוכנה. קבע את העובי הניתן לדימות על-ידי מרחק העבודה של המטרה והבהירות של המדגם.
    3. בשל עובי העובר, להתאים את הרווח ברחבי Z-מחסנית. הגדר את עוצמת הלייזר והרווח באמצע מחסנית Z עבור כל ערוץ (405, 488 ו-555) והקצה ערכים תחת הכרטיסיה תיקון עוצמות Z . הגדר את אותם ערכים עבור הפרוסה התחתונה.
    4. לגלול דרך העובר עד אותות הזריחה מתחיל להיראות עמעם. הגדל את הרווח של כל אחד מהערוצים עד שעוצמת האות תופיע בדומה למקטע הקודם. הקצה את הערך החדש תחת הכרטיסיה תיקון עוצמה של z . חזור על הפעולה עד שמחסנית z תושלם. יבא הגדרות בחזרה לרכישה ND.
    5. הפעל סריקה באמצעות האפשרות ' הפעל תיקון Z '.

7. ניתוח באמצעות התוכנה של Imaris אריס

הערה: בשלבים אלה, תמונות מיקוד ינותחו באמצעות תוכנת ניתוח המיקרוסקופיה, מ9.2.0 גרסה. במהלך ניתוח זה, נבחר תחילה אזורי עניין לניתוח על-ידי יצירת משטחים. לאחר מכן, נשתמש בפונקציה Mask כדי להפריד בין האזורים באופן חזותי. לבסוף, נשתמש בפונקציה Spot כדי לכמת את מספר ה-ecs בתוך כל אזור מעניין.

  1. בהתאם לתוכנת הדימות המשמשת בשלב 6, המרת תמונות ל-. ims באמצעות ממיר הקבצים של Imaris אריס.
  2. פתח את קבצי ה-. ims. הגדר תמונה לאורתוגונלית תחת מצלמה/תוויות | החלונית ' סוג מצלמה '.
  3. אתר את PAAs והאוריינט את התמונה לחיפוי.
    הערה: כאשר הקבצים נפתחים לראשונה, הם יופיעו כאוסף תלת-ממדי של כל הפרוסות בתמונה. בשלב זה, PAAs יהיה ממוקם על ידי הפיכת התמונה תלת-ממדית לתמונה דו-ממדית. לאחר מכן, התמונה הדו מאפשרת ל-PAAs להיות מונחה כראוי לצורך ניתוח.
    1. תחת החלונית ' מאפיינים ', כבה את עוצמת הקול. תחת החלונית מאפיינים , לחץ על הוסף מבצעה אורטופדית חדשה. הגדר כיוון פרוסה למישור XY. השתמש בתנוחת פרוסה כדי לגלול בתמונה עד למציאת ה-paas.
    2. אם PAAs אינם מקבילים לחלק העליון והתחתון של התמונה, לסובב בחופשיות את התמונה באמצעות סמן העכבר כך PAAs לרוץ משמאל לימין על פני המסך. תחת התפריט הנפתח עיבוד תמונה , בחר באפשרות סובב בחינם ולחץ על אישור.
  4. מבעד לקשת הלוע השלישית (איור 2א, ב-ב)
    הערה: בשלבים אלה, קשתות הלוע והפאס מתבצע באמצעות הכלי לפני השטח כדי ליצור אזור מעניין. זה יאפשר לכל אזור של עניין להיות מבודד חזותית מן הרקמה הסובבת. כאן נתאר את הצעדים לפני השטח וננתח את רכיבי האנדותל של קשת הלועהשלישית . קשתות מולוע 4 ו -6. מנתחים באופן דומה
    1. למשטח האנדותל בקשתהלוע כולה, לחץ על הלחצן ' הוסף משטח חדש ' הממוקם תחת החלונית ' מאפיינים '. לחיצה כפולה על פני השטח 1 ו לשנות את המשטח החדש "קשת הלועהשלישי ".
    2. בחר באפשרות דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני. הגדר כיוון פני שטח למישור YZ (כיוון הדפסה כוראליות). השתמש בתנוחת פרוסה כדי למקם את מישור פני הלועהשלישי של הקשת הלוע למקום שבו הצפותהשלישי ומטה העורקים להתחבר.
    3. סובב את התמונה כדי לראות את מישור הלועהשלישי של משטח הלוע. ביטול הפורס האורתופדיה 1.
    4. תחת התיקו | קונטור | הכרטיסייה ' מצב ', בחרו באפשרות ' מרחק מצב ציור '. התאם את הגדרות הפרמטרים במידת הצורך. שמור על פרמטרים עקביים של החיפוי בין דגימות. עבור דוגמה זו, ריווח קודקוד הוא 10 μm.
    5. כדי להתחיל בחיפוי, הקש על מקש Esc ולאחר מכן לחץ על לחצן לצייר . מעקב אחר היקף קשת הלועהשלישי עם סמן העכבר. השתמש בתנוחת פרוסה כדי להעביר 10-25 פרוסות. . עקוב אחר היקף קשת הלוע . אני חוזר עד שקשת הלוע מלאה
    6. להפקת פני השטח של אזור המעקב, בחרו בלחצן ' צור משטח ' בחלונית ' מאפיינים '.
  5. מבעד לצפות השלישי (איור 2c-c)
    1. כדי לפני השטח של צפות 3rd , תחילה לכבות את אזור השטח משלב 7.4, על ידי ביטול הבחירה3 הלוע הלוע הפנימי קשת התיבה. לאחר מכן, לחץ על הלחצן ' הוסף פני שטח חדש ' שוב. לחיצה כפולה על פני השטח 1 ו לשנות את המשטח החדש ל "3rd צפות".
    2. בחר באפשרות דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני. הגדר כיוון פני שטח למישור YZ (כיוון הדפסה כוראליות). השתמש בתנוחת פרוסה כדי למקם את המישורהצפות התלת-ממדי של פני השטח למקום שבו הצפותהשלישי ומטה העורקים החוזרים מתחברים, ואז חזור על שלבים 7.4.
  6. מיסוך של מבנים ומעלה
    הערה: בשלבים הבאים, כל אזור הריבית של העלה יהיה רעולי פנים. המסיכה מאפשרת לאזור העניין להיות נבדל באופן חזותי משאר רקמת התמונה ומאפשר לכמת את המבנים הנפרדים הללו. להלן, אנו מתארים את השלבים ב-imaris אריס כדי להמחיש ולנתח את צפות אנדותל, כמו גם את מקלעת-היום לטורה הקטן סביב paas בתוך קשתות הלוע. בשלבים אלה, משטח הצפותהשלישי יהיה רעולי פנים כדי להמחיש ולבצע ניתוח רק על paas באמצעות הפונקציה ספוט המתואר בסעיף 7.7.
    1. בחר באמצעי אחסון כדי להמחיש את כל ערוצי המסיכה. הקש על מקש Esc כדי לסובב את התמונה ולמקם את התמונה במיקום XY.
    2. תחת הכרטיסיה עריכה , בחר באפשרות בחירת מסיכה עבורהצפות 3 . בחרו בערוץ DAPI ולחצו על הלחצן ' אשר'. חזור על הערוצים הנותרים.
    3. בלוח המקשים, הקש Ctrl + D כדי להציג את החלונית ' התאמות תצוגה '. בחר כל אחד מהערוצים החדשים ושנה את שמם כדי להבהיר מה כל ערוץ מציג. לדוגמה, פעולה זו תוביל לשלושה ערוצים חדשים: "3rd צפות dapi", "3RD צפות erg", ו-"3rd צפות VEGFR2".
      הערה: בשלבים 7.6.4-7.6.7 אנו ניצור ערוצים עבור מקלעת הלוע הגרון בלבד.
    4. כדי להמחיש את מקלעת האנדותל בנפרד מצפות, נבחר תחילה את המסיכה עבור המשטחהצפות השלישי. בחר בערוץ DAPI. בטל את הסימון בחירת voxels מחוץ לפני השטח ובדוק בחירת voxels בתוך משטח ללחצנים , להגדיר בחירת voxels בתוך משטח לאפס. לחץ על אישור.
    5. חזור על הערוצים הנותרים. פעולה זו לא תכלול את האזור המכיל את ה-צפות מתוך ערוצי המסיכה החדשים. שנה את שם הערוצים כדי להבהיר מה כל ערוץ מציג. לדוגמה, פעולה זו תוביל לשלושה ערוצים חדשים: "Non-צפות DAPI", "לא צפות ERG" ו-"VEGFR2 שאינם צפות".
    6. כדי להמחיש מקלעת אנדותל בתוך קשת הלועהשלישית , בחר מסכה בחירה תחת הכרטיסייה Edit , עבור פני השטחהשלישי של קשת הלוע. בחר בערוץ שאינו צפות DAPI . לחץ על אישור.
    7. חזור על הפעולה עבור הערוצים הנותרים שאינם צפות. שנה את שם הערוצים כדי להבהיר מה כל ערוץ מציג. לדוגמה, פעולה זו תוביל לשלושה ערוצים חדשים: "מקלעת DAPI", "מקלעת", ו-"מקלעת VEGFR2".
  7. קוונפיקציה של מספרי EC
    הערה: הביטוי של מארקס ERG גרעיני אנדותל הופך אותו נוח לכמת מספרי EC. בשלבים אלה, מספר ה-ECs יהיה כימות באמצעות הפונקציה Spot כדי ליצור מקום עבור כל EC המסומן בביטוי ERG ב-צפות ו-מקלעת. בסעיף 7.7, כתמים ייווצרו עבור כל תא ERG-חיוביים ב-צפות רעולי פנים, ואחריו את deselection של נקודות ב-ERG-חיוביים, VEGFR2-שלילי תאים.
    1. בלוח המקשים, הקש Ctrl + D כדי להציג את החלונית ' התאמות תצוגה '. כבה את כל הערוצים למעט צפות ERG.
    2. תחת הכרטיסיה מאפיינים, לחץ על הלחצן הוסף כתמים חדשים . לחץ על נקודות 1 ולשנות את שמו "צפות המספר הכולל של ecs". לחץ על לחצן החץ הכחול . עבור ערוץ מקור, בחר בערוץ צפות erg. כוונן את קוטר ה- XY המשוער ל-4 μm. המשך לפאנל הבא על ידי לחיצה על לחצן החץ הכחול.
    3. כוונן את מספר הנקודות שנראו באמצעות קנה המידה של ההזזה, כדי לוודא שכל גרעין EC (המסומן בביטוי ERG) מיוצג באמצעות נקודה אחת. לחץ על כפתור החץ כפול ירוק .
    4. כבה את ערוץ צפות ERG בהתאמת התצוגה. הפעל את ערוץ צפות VEGFR2 כדי להמחיש את צפות אנדותל.
    5. כדי לכמת במדויק את מספר ה-ECs, אנו מבטיחים כי כל מקום מבטא את הסימונים הEC, ERG ו-VEGFR2. לשם כך, בחר משטח של אובייקט תחת הכרטיסיה עריכה | הוספה/מחיקה של החלונית. הקש על מקש Esc ומחק כתמים שאינם VEGFR2 חיוביים, על-ידי החזקת המקש shift למטה ובחירה בנקודה.
      הערה: בשלב הבא, הנקודות ייווצרו עבור כל תא ERG-חיוביים בתוך מקלעת המסיכה, ולאחריה את מבחר הנקודות בתאים ERG-חיוביים, VEGFR2-שליליים.
    6. תחת הכרטיסיה מאפיינים, לחץ על הלחצן הוסף כתמים חדשים . בחר באפשרות ' כתמים 1 ' ושנה את שמם ל-' מספר מקלעת כולל של ecs '. לחץ על לחצן החץ הכחול . באפשרות ' ערוץ מקור ', בחרו בערוץ ה-מקלעת. כוונן את קוטר ה- XY המשוער ל-4 μm. חזור על שלבים 7.7.1-7.7.5 עבור המספר הכולל של מקלעת ה-ECs.
    7. לחץ על הכרטיסייה סטטיסטיקה של כל פונקציה ספוט כדי לקבוע את המספר הכולל של ecs ב3 צפות ו מקלעת הלוע הצווארי.
    8. חזור על שלבים 7.7.1-7.7.6 עבור מקלעת ה-PAAs והלוע המולוע הנותרים.

תוצאות

הנוהל המלא של הפרוטוקול המוצג כאן מפיק תוצאות ברורות ונקיות, ומאפשר שחזור תלת-מימדשל קשת הלוע, כנראה באיור 1. חשוב לעבור העוברים במשך כמות מספקת של זמן בכל פתרון נוגדן כדי להבטיח חדירה מלאה דרך המדגם, כמו גם, ביסודיות כביסה העוברים לאחר הדגירה נוג?...

Discussion

היכולת להמחיש את האנדותל של עוברי העכבר ב-3D סיפקה תובנות חדשות לפיתוח שלהם3. כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה תלת-ממד של עוברים, ויזואליזציה של קישוריות כלי דם, וניתוחים כמותיים של היווצרות צפות. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק כדי לראות כיצד שינויים גנטיים א?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לבריאנה אלכסנדר, קאולן אודונל ומייקל וורקאלה לקריאה זהירה ועריכה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכת על ידי המימון של הלב הלאומי, ריאות ודם המכון של NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 ל-SA; AJR נתמך על ידי NHLBI HL103920-08S1 ואת המכון הלאומי של דלקת מפרקים והשלד ומחלות עור הדרכה מענק T32052283-11.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSMP BiomedicalsPBS10X02
20x water immersion objectiveNikonMRD77200
AgaroseBio-Rad Laboratories1613101
Alexa Fluor 488 anti-goatInvitrogenA-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouseInvitrogenA-31570
Analysis SoftwareImaris 9.2.0
Benzyl AlcoholSigma-Aldrich305197
Benzyl BenzoateSigma-Aldrich8.18701.0100
Cover SlipsVWR16004-312
DAPI (5 mg/mL stock)Fisher ScientificD3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL)Fisher Scientific05-408-138
EthanolVWR89370-084
Falcon tubes (50 mL)Corning352098
Fast wellsGrace Bio Labs664113
ForcepsRobozRS-5015
Goat anti-VEGFR2R&D Systems, Inc.AF644
MethanolVWRBDH1135-4LP
MicroscopeNikonA1HD25
Mouse anti-ERGAbcamab214341
Normal Donkey SerumSigma-AldrichD9663
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
Pasteur pipetsFisher Scientific13-678-20D
Petri dishes (35 mm)Genesee Scientific32-103
Petri dishes (60 mm)Genesee Scientific32-105
Plastic MoldsVWR18000-128
ScapelsExelint International Co.29552
Triton-X-100Fisher ScientificBP 151-500

References

  1. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
  2. Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
  3. Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
  4. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  5. Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
  6. Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
  7. Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
  8. Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
  9. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
  10. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  12. Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
  13. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  14. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved