ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence

Summary

הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.

Abstract

קרוהן היא הסוג האובחן ביותר של מחלת המעי הדלקתית. דלקת כרונית המתפתחת במעי מוביל להפרעה הפריסטלזיס ולנזק של רירית המעי ונראה להיות משויך לסיכון מוגבר של שינוי המעי הגס הנאופלסטי. צבירת ראיות עולה כי אסטרוגנים וקולטנים אסטרוגן להשפיע לא רק רקמות הורמונלי רגיש, אלא גם רקמות אחרות לא קשור ישירות אסטרוגנים, כגון הריאות או המעי הגס. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעת החיסונית מוצלחת של קולטני אסטרוגן במעי הגס המתקבל ממודל murine של מחלת קרוהן המושרה. פרוטוקול מפורט אינדוקציה של מחלת קרוהן בעכברים והכנה למעיים מסופק, כמו גם צעד אחר צעד אימונוהיסטוכימיקלים הליך באמצעות formalin קבוע-מקטעים המעי מוטבע. השיטות שתוארו הם לא רק שימושי לזיהוי קולטן אסטרוגן החקירה איתות אסטרוגן ב vivo אבל יכול גם להיות מיושם על חלבונים אחרים אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס.

Introduction

קרוהן (CD) היא מחלת מעיים דלקתית (IBD) הנראית כמו דלקת המעי כרונית. האטיולוגיה של תקליטור הוא הבין בצורה גרועה, אבל יש כמה גורמים עיקריים שנראים להיות אחראי על פיתוח תקליטורים, כולל microbiota המעי, וגורמים גנטיים וסביבתיים, כגון דיאטה או מתח¹. להבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלת קרוהן, מודלים שונים של דלקת במעיים שימשו^2,3,4,5,6,7. במאמר זה, אנו מציגים את התוצאות שהתקבלו מ 2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic (TNBS)-מודל murine המושרה של תקליטור.

זה תועד כי אסטרוגנים מסוגלים למודולט דלקת מעיים כרונית^8,9,10,11,12. הפעילות הביולוגית של אסטרוגנים מתווכת על ידי קולטנים קנצוני, ביניהם הם קולטני אסטרוגן גרעיני (ERs), כלומר, erα (ג ' ין ESR1) ו ERβ (גנים ESR2), כמו גם G חלבון מצמידים קולטן אסטרוגן, כלומר, gper (גנים GPER1), המכונה ממברנה מאוגד ER^13,14. ישנן מספר שיטות לקביעת רמת קולטני אסטרוגן, אבל רק מעטים יכולים לשמש כדי להמחיש אותם במעי.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה נפוצה במחקרים קליניים ובסיסיים לאיתור אנטיגנים מסוימים בתאים או ברקמות עם נוגדנים מצוונים fluorochrome. IHC נראה שיטה חשובה הדמיית מבנה רקמות, כמו גם זיהוי ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים, אשר עשוי להיות קריטי להבנת ההתפתחות של קוליטיס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימיה של קולטני אסטרוגן במעי באמצעות immunofluorescence.

Protocol

מחקרי בעלי חיים נערכו בהסכמת הוועדה האתית המקומית (28/ל2016) בהתאם לצו 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ולמועצת ספטמבר 22, 2010 והמלצות מוסדיים.

1. TNBS המושרה מודל מורטין של מחלת קרוהן

הערה: פרוטוקול זה משתמש בעכברים מסוג BALB/C ששוקל 25-28 g. בעלי חיים שוכנו בטמפרטורה קבועה (22-24 ° c) ו, לחות יחסית 55 ± 5%, ומתוחזק 12 h אור/כהה מחזור עם גישה חופשית כדורי אוכל רגיל ברז מים לחות המודעה.

1. הניחו את העכבר לתוך חדר האינדוקציה וסגרו את המכסה בחוזקה. בקיצור העכבר בקצרה עם isofלוריאן (25% O₂ עם o₂ שיעור זרימה ב 1.5-2 L/דקות).
   הערה: קצב הנשימה צריך להישאר קצבי ואיטי מהרגיל, ולא לשנות תגובה לגירוי רעילים.
2. להחדיר 4 מ"ג של TNBS ב 0.1 mL של 30% אתנול ב 0.9% הנאל או 0.1 mL של 30% אתנול בשנת 0.9% בתור שליטה ברכב לתוך המעי הגס דרך קטטר.
   הערה: הקטטר צריך להיות הציג בקפידה כ 3 ס מ לתוך פי הטבעת.
3. נטר את העכבר מדי יום מהיום השני עד שמונה עבור פרמטרים קליניים כולל משקל הגוף, דימום רקטלי, שרפרף עקביות ותמותה.
4. ביום השמיני, המתת החסד. של העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם

איור 1: ציר הזמן עבור המודל המושרה TNBS של מחלת קרוהן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. הפרדת המעי הגס והפקרוסקופי

הערה: יום אחד לפני הפרדת המעי הגס, לדלל 100 μL של אנטיביוטיקה ב 1 מ ל של המלח מאגר פוספט (PBS) ולצאת ב 4 ° c הלילה.

1. נקה את העור מעל הבטן באמצעות 75% אתנול וגזה סטרילית.
2. חותכים את קיר הבטן מעצם החזה לפי הטבעת באמצעות מספריים ופינצטה סטרילית.
3. לחתוך את המעי הגס קרוב ככל האפשר פי הטבעת ו cecum.
4. מניחים את המעי הגס על צלחת פטרי. חותכים את המעי הגס לאורך פי הטבעת לסוף מעי. נקה ושטוף את המעי הגס 2-4 פעמים בפתרון אנטיביוטי-PBS קר.
5. בצע הערכה מאקרוסקופית באמצעות קליבר לפי לוח 1.
   הערה: הדבקה רקמות^* ואודם/^דימום,דם צואה ושלשול כפופים להערכה חזותית.^{# # *} הדבקה רקמות להעריך באמצעות סולם שלוש נקודות (0: נקודתיים ללא הדבקה רקמות, 1: קולון עם הדבקה רקמת בינונית, 2: קולון עם הדבקה רקמה נרחבת); ^מבוססעל היעדרות (0) או נוכחות (1) של אריתמה/דימום, דם צואה ושלשול.

הדבקה*	שאריתמה/דימום	דם צואה	שלשול	אורך הכיב	עובי נקודתיים	אורך נקודתיים
נקודות (0 – 2)	נקודות (0 – 1)	נקודות (0 – 1)	נקודות (0 – 1)	ס מ/נקודות	mm/נקודות	ס מ/נקודות
0 – נעדר	0 – נעדר	0 – נעדר	0 – נעדר	0.5 ס"מ = 0.5 נקודה	n מ"מ = n נקודות	0 – < 10% קצר יותר מהפקד
1 – בינוני	1 – הווה	1 – הווה	0.5 – שרפרף קל/רופף			1 – מ-10 עד 20% קצר יותר מהפקד
2 – הווה			1 – הווה			2 – מעל 20% קצר יותר מאשר הפקד

טבלה 1: מקרוסקופי הניקוד של המעי של עכברים עם מודל המושרה TNBS של מחלת קרוהן.

6. להמיר את אורך הכיב בסנטימטרים לסולם נקודה, כלומר, כל 0.5 ס מ של כיב הוא נספר כנקודת 0.5. להמיר את עובי המעי הגס במילימטרים לסולם נקודה, כלומר, כל n mm מתאים n נקודות.
7. המר את אורך הנקודתיים בסנטימטרים בקנה מידה של שלוש נקודות. אורך המעי הגס שהושג מכל עכבר עם tnbs המושרה מחלת קרוהן מוערך ביחס לאורך המעי הגס הממוצע עבור קבוצת הביקורת (0: < 10% קצר יותר מאשר הפקד, 1: מ 10 עד 20% קצר יותר מאשר הפקד, 2: מעל 20% קצר מכן ה שליטה).
8. לחשב את הציון המקקרוסקופי הכולל על פי המשוואה: ציון כולל מאקרוסקופי = הדבקה (נקודות) + אריתמה/דימום (נקודות) + דם בצואה (נקודות) + שלשול (נקודות) + אורך של כיב (נקודות) + נקודתיים עובי (נקודות) + המעי הגס אורך (נקודות).

3. הכנה לדגימת קולון

1. חותכים את המעי הגס לתוך 1-2 ס מ קטעי ומניחים כל על ספוג בקלטת היסטולוגית הנכונה המסומנת.
   הערה: ספוגים לקלטות היסטולוגית מונעות קיפול קולון במהלך התייבשות ודגירה של פרפין נוזלי.
2. מניחים את מקטע המעי הגס 4% פורמלדהיד ו הדגירה לפחות 24 h ב 4 ° c.
3. להכין ולתכנת את מעבד הרקמה עבור 1 h של דגירה ב 50%, 70%, 90%, 95%, 100% אתנול, קסילן/100% אתנול (1:1; v/v), ו קסילן בלבד, כמו גם עבור לפחות 3 h של דגירה בפרפין נוזלי.
   הערה: התייבשות יש לבצע בריכוזים גוברת של אתנול ו xylene, אבל את הריכוז של אתנול ניתן לשנות. תערובת קסילן/אתנול מומלצת אך אינה נדרשת.
4. העבר את קטע המעי הגס לתיבה היסטולוגית ומקום במעבד הרקמה המתוכנת מראש.
5. . תריץ את מעבד הרקמה
6. לאחר שלבי דגירה, מניחים את רסיס המעי הגס בתבנית מתכת, כך שני הקצוות של המעי הגס הם בתנוחה זקופה ולמלא שליש העובש עם פרפין נוזלי.
7. מניחים את העובש באזור הקירור (5 ° c) לכמה שניות, ולאחר מכן מזיז את התבנית לאזור ההתחממות (70 ° c). מקום בחלק התחתון של התיבה היסטולוגית ולכסות את שבר המעי הגס כולו עם פרפין נוזלי.
8. השאירו את עובש המתכת עם רסיס המעי הגס בפרפין לכמה דקות באזור הקירור. להסיר את תבנית המתכת מבלוק פרפין ו הדגירה לפחות 24 h ב 4 ° c.
9. להסיר פרפין עודף מן הבלוק ולהכניס אותו לתוך מיקרוטומה אוטומטית לחלוטין.
   הערה: בלוק הפרפין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° c לכמה דקות לפני שלב זה.
10. חותכים את קטע המעי הגס לתוך 5 יקרומטר סעיפים.
11. העבר את חתך המעי הגס לאמבט מים מחומם עד 40 ° c.
12. השתמש בשקופית הזכוכית המסומנת כדי להסיר את מקטע הנקודתיים מאמבט המים.
    הערה: מקטעי המעי הגס צפים על המים. שימו את שקופית הזכוכית המסומנת במים מתחת לסעיף המעי הגס ולמשוך את שקופית הזכוכית בזהירות.
13. השאירו את מגלשת הזכוכית 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסון לטווח ארוך, שמרו על שקופית הזכוכית ב -4 ° c לאחר 24 שעות של דגירה בטמפרטורת החדר.

4. אימונוהיסטוכימיה עם מכתים מאימונולובורנציה

הערה: אל תאפשר למקטע הנקודתיים להתייבש בכל שלב במהלך השגרה.

1. הסרת פרפין על ידי דגירה את שקופית הזכוכית קסילן עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
2. מניחים את שקופית הזכוכית xylene/100% אתנול (1:1; v/v) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
3. מחדש את מקטע המעי הגס בסדרה של ריכוזי אתנול הפחתת, כלומר, 70%, 50%, 30% ו 10% אתנול עבור 5 דקות.. חזור על כל שלב שלוש פעמים
4. לשטוף את שקופית הזכוכית תחת מים זורמים עבור 5 דקות.
5. מחממים מאגר אחזור אנטיגן (10 מ"מ נתרן ציטראט; 0.05% רצף 20, pH 6.0) עד 95-98 ° צ' ומחממים את שקופית הזכוכית בתמיסה הרתיחה של האנטיגן במשך 10 דקות.
   הערה: שלב אחזור האנטיגן הוא אופציונלי אך מומלץ. פתרון ללא מיסוך צריך להיות ממוטב בהתאם לנוגדן המשמש את הניסוי.
6. ציירו עיגול סביב מקטע המעי הגס בעזרת עט הידרופובי.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ. העט ההידרופובי מונע בזבוז של ריאגנטים על ידי שמירה על נוזלי במאגר בנפח קטן בתוך מסומן במעגל.
7. מודטה את הסעיף ב 3% המים פתרון של מימן peroxidase עבור 10 דקות.
8. לשטוף את הפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 mM הנאל; 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות.
9. דגירה בפתרון חסימה (5% סרום עז רגיל; 50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 mM הנאל; 0.05% טריטון X-100) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
   הערה: בפתרון החסימה, הנסיוב הרגיל חייב להיות מאותו זן כמו הנוגדן המשני. בשלבים שבהם נדרשת דגירה, הניחו את שקופית הזכוכית בחדר לחות כדי למנוע התאיידות מוגזמת.
10. להסיר את הפתרון חסימה ולהוסיף 20-50 μL של הנוגדן העיקרי נגד ERα, ERβ או GPER מדולל ב 1% בסרום פרה אלבומין עם 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% טריטון X-100.
    הערה: דילול מומלץ של נוגדנים ראשוניים מוצגים בטבלה 2.

סוג נוגדן	נוגדן נגד	Clonality	מין מארח	פעילות מחודשת במינים	דילול
ראשי	מיכל שלמה	פוליבטיים	ארנב	אדם	1:100
				עכבר
				צב
				קפיברה
	ERβ	פוליבטיים	ארנב	אדם
				קוף
				עכברוש
				עכבר
				כבשים
				חזיר
	מיכל הגופר	פוליבטיים	ארנב	אדם
				עכברוש
				עכבר
שני	דילייט 650	פוליבטיים	עז	ארנב	1:250

שולחן 2: מאפייני הנוגדנים.

11. מודלת עם נוגדן ראשוני לילה ב 4 ° c בחשיכה.
12. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 מ"מ הנאל; 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
13. הוסף 20-50 μL של DyLight 650 נוגדן משני מדולל ב 1% בסרום שור אלבומין (המכיל 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 מ"מ הנאל, 0.05% טריטון X-100). דגירה עם נוגדן משני מעלה עם צבע עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחשכה.
    הערה: הדילול המומלץ של הנוגדן המשני מוצג בטבלה 2.
14. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
15. הוסף 2% DiOC6 (3) מדולל 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל ו דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה.
16. הסר את הפתרון ולשטוף בתמיסה כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
17. הוסיפו כמה טיפות מנוזל גליצרול המבוסס על DAPI ישירות על החלק הנקודתיים וכיסו בזהירות בשקופית כיסוי. מחלקת המעי הגס לפחות 24 שעות ב -4 ° c.
    הערה: הימנע מבועות אוויר בעת כיסוי הרקמה עם שקופית המכסה.
18. לנתח את מקטע המעי הגס תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד שמציעות 20x או 63 מטרות וטבילה שמן באמצעות תוכנה ייעודית.
    הערה: טבלה 3 רשימות מאפיינים של fluorochromes בשימוש זה מחקר.

סוג פלואורואוכדום	אורך הגל (nm)		צבע
	עירור	פליטה
דאפי	405	460 – 480	כחול
DiOC6 (3)	485	538 – 595	ירוק
דילייט 650	654	660 – 680	אדום

שולחן 3: מאפייני fluorochromes.

תוצאות

המאפיינים המקסקופיים של נקודתיים בעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS
תמונות מייצגות של נקודתיים שנלקחו מהפקד ועכברים שטופלו ב-TNBS מוצגים באיור 2. בעכברים עם מודל TNBS המושרה של מחלת קרוהן, אורך המעי הגס מופחת בעוד רוחב המעי הגס הוא גדל.

Discussion

ישנם מודלים רבים של בעלי חיים עבור בדיקה פתופסולוגיה IBD, כולל גנטי, מודלים אימונולוגיים או ספונטנית, כמו גם דגמים המושרה כימית¹⁵. בין מספר סוגים של מודלים בעלי חיים של קוליטיס, כימית המושרה מודלים כגון מודל TNBS המושרה המתואר בפרוטוקול זה, הם זולים יחסית וקל להשיג. המודל המושרה TNBS ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
BALB/C mice	University of Lodz	NA
Equipment
Caliper	VWR	62379-531
Cardboard block	NA	NA
Confocal microscope - TCS SP8	Leica Biosystems	NA
Fully automated rotary microtome - RM2255	Leica Biosystems	NA
Glass slide	Thermo Scientific	J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H	Leica Biosystems	NA
Histological box	Marfour	LN.138747
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Laboratory balance	Radwag	WL-104-0048
LAS X software	Leica Biosystems	NA
Metal mold	Marfour	CP.5105
Sterile gauze	NA	NA
Sterile scissor	NA	NA
Sterile tweezer	NA	NA
Tissue processor - TP1020	Leica Biosystems	NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid	Sigma-Aldrich	92822
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3294
DiOC6 (3)	Sigma-Aldrich	318426
DyLight 650 secondary antibody	Abcam	ab96886
ERα primary antibody	Abcam	ab75635
ERβ primary antibody	Abcam	ab3576
Ethanol	Avantor Performance Materials Poland	396480111
Formaldehyde	Avantor Performance Materials Poland	432173111
GPER primary antibody	Abcam	ab39742
Hydrochloric acid	Avantor Performance Materials Poland	575283421
Hydrogen peroxidase	Avantor Performance Materials Poland	885193111
isoflurane (forane)	Baxter	1001936040
Normal goat serum	Gibco	16210064
Paraffin	Leica Biosystems	39602012
Petrie dish	Nest Scientific	705001
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich	P3813
Physiological saline	Sigma-Aldrich	7982
Primocin (antibiotic)	Invitrogen	ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)	Invitrogen	P36971
Sodium chloride	Chempur	WE/231-598-3
Sodium citrate	Avantor Performance Materials Poland	795780429
Tris	Avantor Performance Materials Poland	853470115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Xylene	Avantor Performance Materials Poland	BA0860119