באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

Summary

אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.

Abstract

הזרע מקבל קיבולת הפריה במערכת הרבייה הנשית בתהליך המכונה מדרכיכים. תהליכים משויכים למדרכיכים דורשים אנרגיה. קיים דיון מתמשך בנוגע למקורות היוצרים את ה-ATP המזין את הזרע לתנועתיות מתקדמת, מדרכיכים, היפרהפעלה ותגובה מאקרומה. כאן, אנו מתארים את היישום של מנתח השטף מחילוץ ככלי לניתוח שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך מדרכיכים זרע העכבר. באמצעות H⁺-ו O₂-רגישות fluorophores, שיטה זו מאפשרת בניטור גליקוליזיס ו זרחון חמצוני בזמן אמת ב-non-capacitated לעומת הזרע קיבול. שימוש בשיטה זו בנוכחות מצעים אנרגטיים שונים ו/או מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי יכולים לספק תובנות חשובות לתרומת מסלולים מטבוליים שונים והצטלבות בין איתות מפלי ומטבוליזם במהלך מדרכיכים זרע.

Introduction

היישום של ספקטרומטר המסה יש מהפכה המחקר של חילוף החומרים. ממוקד פרופיל חילוף החומרים והעקיבה metabolomic לאפשר ניטור מדויק של שינויים בחילוף החומרים באנרגיה. עם זאת, ביצוע טבולומיקס בהצלחה דורש הכשרה נרחבת, צוות מנוסה, ו יקר, ספקטרומטר מסה מאוד רגיש לא זמין לכל מעבדה. בשנים האחרונות, באמצעות מנתח השטף של מסחטות, כגון סוסון ים XFe96 גדל פופולרי כשיטה פונדקאית למדידת שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה בסוגי תאים שונים^1,2,3,4,5.

זרע הם תאים מיוחדים מאוד משבצת; אשר משימתו היא לספק את הגנום אבהי כדי oocyte. זרע עוזב את מערכת הרבייה זכר לאחר שפיכה הם עדיין בלתי בוגרים מבחינה פונקציונלית ולא ניתן להפרות את oocyte כי הם לא מסוגלים לחדור את הvestments של oocytes. זרע לרכוש יכולת דישון כאשר הם עוברים דרך מערכת הרבייה הנשית בתהליך התבגרות המכונה מדרכיכים^6,7. הפליטה הטרייה של זרע או זרע בגזור מיותרת הזנב יכול להיות capacitated בחוץ על ידי דגירה באמצעות המדרכיכים מדיה מוגדר המכיל Ca^{2 +}, ביקרבונט (hco₃^-) או מחנה חדיר תאים אנלוגי (למשל, diבוטילטור-מחנה), קבלה כולסטרול (למשל, סרום בשור, bsa), ומקור אנרגיה (למשל, גלוקוז). במהלך המדרכיכים, זרע לשנות את דפוס התנועתיות שלהם לתוך להכות המרצפות אסימטריים, המייצג מצב שחייה שנקרא hyperactivation פעלה^8,9, והם הופכים להיות מוכשרים כדי לעבור את התגובה האקרוכמה⁷, שם אנזימים פרוטבחרדה שפורסמו כי לעכל את הבאויות של oocytes. תהליכים אלה דורשים אנרגיה, ובדומה לתאים סומטיים, זרע לייצר ATP ותרכובות אנרגיה גבוהות אחרות דרך גליקוליזיס, כמו גם מחזור TCA מיטוכונדריאלי וזירחון חמצוני (oxphos)¹⁰. בעוד מחקרים מרובים מדגימים כי גליקוליזיס הוא הכרחי ומספיק כדי לתמוך זרע מדרכיכים^11,12,13,14, התרומה של oxphos הוא פחות ברור. בניגוד לסוגי תאים אחרים בהם גליקולזיס משולב פיזית למחזור ה-tca, הזרע ממדר מאוד ונחשבים לשמור על תהליכים אלה בתאי הריצוף הנפרדים: המיחלק מתמקד במכונות המייטוכונדריאלי, בעוד שהאנזימים המרכזיים של גליקוליזה מופיעים כמוגבלים לחלק העיקרי^15,16. מידור זה מביא לויכוח מתמשך על האם פירובט המיוצר בחלק העיקרי מאת גליקולזיס יכול לתמוך באוקפוס מיטוכונדריאלי באמצע החלק, והאם ATP המיוצר על ידי oxphos ב-midpiece יוכל לפזר במהירות מספקת לאורך הפלאללום כדי לתמוך בדרישות האנרגיה בחלקים העיקריים של החלק העיקרי של הקרן^17,18,19. יש גם תמיכה של תפקיד של oxphos במדרכיכים זרע. לא רק האוקפוס יותר מאשר באופן אנרגטי יותר מאשר גליקוליזיס, היוצר פי 16 יותר ATP מאשר גליקוליזיס, אך מידות נפח ותוכן מיטוכונדריאלי מתואמים במישרין עם כושר הרבייה במינים היונקים המוצגים דרגות גדולות יותר של התחרות בין הזכרים לחברים^{בגיל 20}. התייחסות לשאלות אלה מחייבת שיטות לבדיקת התרומות היחסיות של גליקוליזיס ואוקפוס במהלך מדרכיכים זרע.

Tourmente ואח ' להחיל מנתח השטף היטב של ממרור כדי להשוות את חילוף החומרים של האנרגיה של מינים העכבר קשור היטב עם פרמטרים שונים באופן משמעותי ביצועי זרע²¹. במקום לדווח על הערכים ECAR בסיס ו-OCR של זרע non-capacitated, כאן, אנו להתאים את השיטה שלהם באמצעות 96-היטב מנתח השטף לעקוב אחר שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך זרע העכבר מדרכיכים בזמן אמת. פיתחנו שיטה המאפשרת במקביל לניטור גליקוליזיס ו oxphos בזמן אמת בזרע עם הכאת הדגל של עד 12 מצבים ניסיוניים שונים על ידי מדידת שטף של חמצן (O₂) ו פרוטונים (H⁺) (איור 1a). בשל פירוק של פירובט כדי לקטט במהלך גליקוליזיס וייצור של CO₂ באמצעות tca-מחזור, non-capacitated ו capacitated זרע הבלטה⁺ לתוך מדיה היכולת אשר מזוהים על ידי מנתח השטף החילוץ באמצעות H⁺-רגיש fluorophores לקצה בדיקה של מחסנית חיישן. במקביל, O₂ הצריכה על ידי זרחון חמצוני מזוהה באמצעות fluorophores₂-רגיש לקיבוע לאותו קצה בדיקה (איור 1b). זיהוי אפקטיבי של H⁺ ו נצרך O₂ דורש מאגר זרע שונה עם קיבולת אגירה נמוכה ללא ביקרבונט או פנול אדום. כך, כדי לגרום מדרכיכים בהעדר ביקרבונט, אימצנו את השימוש במחנה חדיר מחנה אנלוגי מוזרק יחד עם טווח רחב PDE מעכבי IBMX²². שלוש יציאות הזרקה עצמאיות נוספות מאפשרות הזרקה של מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי, אשר מקלה על זיהוי בזמן אמת של שינויים בנשימה התאית ובקצב גליקוליזיס עקב טיפול ניסיוני.

Protocol

הזרע נאסף מ-8-16 בן שבוע-CD-1 עכברים גברים. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של וייל קורנל וועדת השימוש (IACUC).

1. יום לפני השיטת התיאום

1. הכנת מחסנית חיישן ומנתח השטף של מסחטות כאשר
   1. כדי לימה את מחסנית החיישן, להסיר את מחסנית חיישן מן השטף XFe96 מגלויה מערכת שיטת ומניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
   2. מילוי מאגר הפתרונות עם 25 מ ל של כפול מזוקקים H₂o באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 200 μl של h₂o כדי כל טוב של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת כלי השירות ו-דגירה לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO₂ .
      הערה: צריך לשתות מחסנית לפחות 4 h.
   3. מחלק 25 מ ל של מנתח השטף מתוך הזרם מכייל את שפופרת 50 mL ומודלת אותו לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO₂ .
2. הכנת מיקרופלטות מצופות לקונה
   1. לפזר 2.5 מ"ג של קונה ב 5 מ ל של כפול מזוקקים H₂O כדי להכין 0.5 Mg/mL (w/v) מניות.
   2. באמצעות הצינורות רב ערוצי, למלא כל היטב של מנתח השטף מגלותאי 96-צלחת לוחית עם 50 μL של הפתרון ה0.5 mg/mL Con A. השאירו את המכסה פתוח ותנו לצלחת להתייבש לילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: לוחות מרובים יכולים להיות מצופים בבת אחת ומאוחסנים ב 4 ° צ' עד ארבעה שבועות עד מוכן לשימוש.
3. הכנת מאגר זרע
   1. להכין 250 mL של מאבחן השטף מנתח TYH עם הHEPES נמוך המכיל 138 Mm הנאקל, 4.7 Mm kcl, 1.7 Mm cacl₂, 1.2 mm KH₂הפו₄, 1.2 mm mgso₄, 5.6 מ"מ גלוקוז, ו 1 מ"מ hepes. מחממים את החוצץ ל37 ° c ומתאימים את ה-pH ל-7.4.

2. יום השיטת הזמן

1. הכנה לכיול מחסנית
   1. החלף את ה-H₂O ב צלחת השירות עם 200 μl של XF מכייל לטוב ומודלת עבור לפחות 1 H ב שאינו CO₂ 37 ° c חממה.
      הערה: במקום כיונמלה, מסוננים מסונן PBS, pH 7.4 ניתן להשתמש.
   2. חום 50 mL של מאגר TYH ב 37 ° c.
2. יצירת תבנית גל עבור מנתח השטף החילוץ
   1. להפוך את מנתח השטף החילוץ על ולאפשר את הטמפרטורה לייצב 37 ° c.
   2. פתח את תוכנת הגל ועצב תבנית חדשה על-ידי פתיחת תבנית ריקה (ראה קובץ משלים 1, תבנית גל).
   3. פתח את הכרטיסיה הגדרות קבוצה . הגדרת מדיית שיטת הגדרה כ-tyh; pH 7.4 וסוג תא כמו זרע העכבר, להשאיר אסטרטגיות הזרקה ולקדם טיפולים ריקים. צור קבוצות שונות עבור כל תנאי שיטת הפעולה; בדוגמה זו, יש 6 קבוצות שונות (TYH, TYH + db-מחנה/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-מחנה/IBMX, נמלה/ריקבון, נמלה/Rot + db-מחנה/IBMX); מחנה מחנאות (db-cAMP) ו-3-איזובוטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) כדי לגרום מדרכיכים, 2-deoxyglucose (2-DG) כמו מעכב גליקוליזיס, antimycin A (antA) ו rotenone (להירקב) כמעכב של השלישי המורכב והראשון של רשת התחבורה אלקטרון.
      הערה: כדי להתחשב בהבדלים בין בארות, לפחות 7-8 בארות לכל תנאי יש למדוד במקביל.
   4. פתחו את הכרטיסייה של מפת הצלחות והגדירו את מפת הצלחות על-ידי הקצאת קבוצות לבארות ספציפיות.
      הערה: ארבע הבארות הפינתיות (A1, A12, H1, H12) יהיו מלאות במאגר TYH (ללא זרע) ומאוחר יותר ישמשו לחיסור רקע.
   5. פתחו את הכרטיסייה ' פרוטוקול ', הוסיפו 4 מחזורי מדידה שונים, בחרו ביציאה המתאימה וערכו את פרטי המדידה (איור 2, טבלה 1). הדגש מדידה לאחר הזרקה ואין להדגיש את השפה.
   6. שמור את תבנית המילוי, מלא את סיכום הפרוייקט והגדר את מיקום השמירה עבור קובץ התוצאות.
3. הכנת תרכובות להיטען לתוך מחסנית חיישן
   1. להכין 2 מ ל של 50 mM db-מחנה ידי המסת 9.8 mg של תרכובת במאגר TYH ולהוסיף IBMX לריכוז הסופי של 5 מ"מ.
      הערה: IBMX יש נטייה לזרז לאחר מדולל במאגר TYH. מאיצים יכולים להיות מומס על ידי vortexing ו-הדגירה של TYH/db-מחנה/IBMX פתרון בלוק חום 37 ° c עבור 5 דקות.
   2. להכין 1 מ ל של 500 mM 2-DG ידי המסת 82.1 mg של תרכובת במאגר TYH.
   3. הכינו 1 מ ל של 5 μM של AntA/Rot על ידי דילול שתי התרופות במאגר TYH.
      הערה: תרכובות הם מדולל 10-קיפול על ידי הזרקה לתוך המחסנית מנתח השטף הזרם; לכן, ודא כי פתרונות ההזרקה מרוכזים יותר ב-10x.
4. בידוד זרע של עכבר
   1. מורדם 3 עכברים זכרים בין 8 ו 16 שבועות על ידי isofלאנה ולהקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר שום תגובה צובט הבוהן זוהה. הסר את מיכל ה, היותרת והמידה
   2. מקום כל תסמונת ב 500 μl של מאגר מראש tyh ב 24-באר צלחת היטב, לשתק את תסמונת לתחתית הצלחת באמצעות זוג מלקחיים ולפתוח את הרקמה על ידי ביצוע 5-7 חתכים קטנים עם מספריים נוצה.
   3. להעביר את הצלחת מיד לתוך החממה₂ 37 ° c, ולתת לזרע להתפזר עבור 15 דקות.
5. טעינת מחסנית החיישן
   1. שני מדריכים לטעינת יציאות עבור יציאה A ו-D ויציאה B ו-C מסופקים בערכת השטף מסחטות. לטעינת יציאה מסוימת, הסר את המכסה ממחסנית החיישן ויישר את האות של מדריך הטעינה המתאים של היציאה עם הפינה השמאלית העליונה של המחסנית. בזמן הזרקת, השתמשו בקצות האצבעות של הידיים שאינן מזריקים כדי להחזיק את קו הטעינה של היציאה במקום והכניסו את קצות הפיפטה אנכית לתוך הנמל וטעינת חורי העזר.
   2. יציאה A: שימוש בפיפטה רב-ערוצית, הכנס 20 μL של מאגר TYH לכל עמודה.
   3. Port B: הכנס 22 μL של מאגר TYH לטור 1-4, הכנס 22 μL של 500 mM 2-DG לטור 5-8, ו -25 μL של 5 μM AntA/Rot לעמודה 9-12.
   4. פורט C: להזריק 25 μL של מאגר TYH לתוך כל עמודה עם מספרים אי-זוגיים, להזריק 25 μL של 10 מ"מ db-cAMP/500 μM IBMX לכל עמודה עם מספרים זוגיים.
   5. מניחים את מחסנית חיישן עם לוחית כיול לתוך מנתח השטף החילוץ ולהתחיל את השיטת. כיול לוקח 10-15 דקות.
6. הכנת לוחות זרע
   1. התמוססות 45 מ"ג של BSA ב 15 מ ל של מאגר TYH (3 מ"ג/mL w/v) ולהכין שלוש שעות של שלושה מ"ל של 3 mL BSA/TYH פתרון כל אחד ב 5 שפופרות צנטריפוגה mL.
   2. לשלב שתי בארות זרע כל אחד 1.5 mL צנטר שפופרת, לספור את הזרע באמצעות המטציטוטומטר ולדלל את הזרע לריכוז של 2 x 10⁷ זרע/mL.
      הערה: השתמשו בטיפים חתוכים לחיתוך זרע כדי למנוע פגיעה בתאים.
   3. צנטריפוגה את הזרע עבור 3 דקות ב 700 x g, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר tyh. חזור על צנטריפוגה step, הסר את הסופרנטאנט, והעבר את כל השעיית הזרע לצינור צנטריפוגה אחד של 5 מ ל עם 3 מ ל של BSA/TYH.
   4. מקום 180 μL של מאגר TYH לכל פינה היטב (A1, A12, H1, H12) של צלחת מצופה קונה. מקום 180 μL של השעיית זרע לתוך כל באר ריקה של הלוח מצופה קונה (1.2 x 10⁶ זרע/טוב).
   5. צנטריפוגה את צלחת הזרע ב 250 x g עבור 1 דקות, לסובב את הצלחת על ידי 180 °, ו צנטריפוגה שוב ב 250 x g עבור 1 דקות (הבלם הנמוך ביותר 1).
   6. להסיר את לוחית הכיול ממנתח השטף החילוץ ולהוסיף את לוחית הזרע. המשך בסדר.
7. מיצוי וניתוח מידע
   1. לאחר שסיימת את העיבוד, הסר את המחסנית, פתח את קובץ התוצאות, לחץ על הכרטיסיה ייצוא וייצא את ההפעלה הושלמה כקובץ של מנסרה (קובץ משלים 2: נתונים לדוגמה ראשוניים המשמשים לאיור 3).
   2. שכפל את הקובץ ECAR ו-OCR על-ידי לחיצה על הכרטיסייה החדשה ולאחר מכן את משפחה כפולה . ... tab (איור 3א).
   3. מחק את 7 השורות הראשונות של הנתונים (איור 3ב).
   4. נרמל את נקודת הנתונים לפני הזרקת המחנה/IBMX באמצעות החסרה שורה 1. לחץ על הכרטיסיה ניתוח ולאחר מכן על הכרטיסיה הסר מתמטיקה בסיסית ועמודה . סמן שורות נבחרות: שורה ראשונה, חישוב: יחס: ערך/בסיס ועמודות משנה: התעלם מעמודת משנה. לחץ על אישור (איור 3ג).

תוצאות

שיטה זו משתמשת במנתח השטף מתוך לעקוב אחר שינויים בזמן אמת בקצב של גליקוליזיס ו oxphos במהלך מדרכיכים זרע העכבר. איור 4 מראה ניסוי מופתי בו הזרע הcapacitated בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו-2-DG ו antimycin rotenone כמו מאפלוטורים תרופתי. המצע האנרגיה במאגר מנתח השטף TYH וא...

Discussion

אובדן של זרע מדרכיכים בהיעדר מצעים מטבולית מסוימים או אנזימים מטבולית קריטיים חשף את חילוף החומרים של האנרגיה כגורם מפתח התומך הפריה מוצלחת. מתג מטבולית במהלך הפעלת התא הוא מושג היטב בסוגי תאים אחרים, עם זאת, אנחנו רק מתחילים להבין איך זרע להתאים את חילוף החומרים שלהם לביקוש האנרגיה הגובר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Animal Health	1169567761	Isoflurane
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL	eppendorf	ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL	vwr	613-5257
37 °C, non-CO2 incubator	vwr	1545
5 mL cetrifuge tubes	eppendorf	30119380
50 mL conical centrifuge tubes	vwr	76211-286
Centrifuge with plate adapter	Thermo Scientific	IEC FL40R
Dissection kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.