JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

Abstract

כלמידיה trachomatis היא פתוגן מחייב-תאיים כי כבר קשה היסטורית כדי לתמרן גנטית. התקדמות מוחלטת בהסבר המנגנונים כי C. trachomatis להשתמש כדי ליצור ולתחזק נישה תאיים מיוחסת הוגבלה בשל חוסר כלים גנטיים. למרבה המזל, לאחרונה היו מספר פיתוחים חדשים בטכניקות מניפולציה גנטית. בין השאר מדובר בהתפתחות של מוטסיס allelic exchange שדווחו על ידי קרינה פלואורסצנטית (FRAEM). שיטה זו מאפשרת מחיקה גנטית ממוקדת יחד עם החדרת קלטת בחירה קידוד עמידות לאנטיביוטיקה וחלבון פלורסנט ירוק (GFP). הסתמכות על אסטרטגיה זו יכולה להיות מסובכת בעת המיקוד גנים בתוך האופריונים polycistronic בשל הפוטנציאל של השפעות הקוטב על הגנים במטה. קסטה מallelic exchange מוטזיס (FLAEM), הפרוטוקול אשר מתואר כאן, פותחה כדי להקל על אפקטי הקוטב של הקלטת. FLAEM מנצל את הגנום לloxp העריכה כדי להסיר את הקלטת הבחירה לאחר ממוקד המחיקה על ידי allelic exchange. הזנים וכתוצאה מכך מכילים מחיקות גנים ללא מרסן של רצפי קידוד אחד או יותר. טכניקה זו מקלה על הערכה ישירה של פונקציית הגן ומרחיבה את הרפרטואר של כלים לטיפול גנטי ב- C. trachomatis.

Introduction

כלמידיה טרכוטיס היא הגורם המוביל למחלה מינית חיידקית ומהווה נטל משמעותי לבריאות האדם. מעל 100,000,000 אנשים נגועים בכל שנה עם C. trachomatis1. כ 70% של זיהומים בנשים הם אסימפטומטיים למרות השפעות בריאות הרבייה מזיקה, כגון מחלה דלקתית האגן, הריון חוץ רחמי, ו/או פוריות. סקוויה מחלה קשורים ישירות immunopathology ביוזמת C. trachomatis זיהום2. חיסון יעיל עדיין לא התפתח; לכן, הבנת הפונקציה של גורמים התקפה אלימה חיידקים ומוצרים אחרים גנים בקטריאליים היא שאלה חשובה ודחופה מחקר.

כמו חיידקים תאיים, הפלישה תא מארח, שכפול תאיים, שחרור של צאצאים, והתחמקות של תגובות אימונולוגיים מארח הם תהליכים קריטיים. ג. טראכוטיס יוצר קרום פרזיטוהורבי מאוגד, הנקרא הכללה, עבור פיתוח תאיים. הקמת הכללה ותהליכים קריטיים רבים אחרים מושגת על ידי הפרשת חלבונים של אפקטור דרך מערכת הפרשה מסוג III (T3SS)3. להבהיר את התפקודים של העריקים המופרשים הללו הוגבלה במשך שנים רבות בשל הצורך הגנטי של ה -trachomatis. בניגוד ל -E. coli, טכניקות שיבוט קלאסיות רבות אינן חלות על כלמידיה. מספר מגבלות גדולות כרוכות ביעילות שינוי, חוסר כתבים נגד כגון Sacb ותחזוקת פלביניים. בעוד E. coli החיידק יכול בדרך כלל להישמר ללא הגבלה עם מקור של שכפול והלחץ סלקטיבי המתאים, C. trachomatis פלמידים דורש שמונה נוספים מסגרות קריאה פתוחות (pgp1-8) עבור תחזוקה שנמצאו על הילידים pL2 פלמיד ב-L2 serovar4.

בשנים האחרונות היו כלים גנטיים מרובים שנוצרו המתאימים ביולוגיה ייחודית של כלמידיה , עדיין יש מגבלות עדיין5,6,7. מוטגנזה כימית על ידי הטיפול אתיל מתיונין (EMS) יכול להציג מוטציות missense, או (בתדירות נמוכה יותר) יכול לגרום מעברים נוקלאוטיד היכרות מוקדמת להפסיק קודון להניב מוטציה שטויות8. החדרת טרנספסון היא יעילה לשיבוש גנים, אך הטכנולוגיה הנוכחית של כלמידיה מחקר היא מפרך וגוזלת זמן9. הן שיטות הטיפול ב-EMS והן הטרנספסון מחוללים מוטציות אקראיות ודורשות שיטות סינון קפדניות לבידוד זנים מוטנטים. שיטה לשבש את הגנים על ידי החדרת introns קבוצה II (למשל, היעד) מאפשר מוטסיס מונחה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על-ידי יעילות, ואתר ההכנסה אינו צפוי תמיד10.

קרינה פלואורסצנטית דיווחו allelic exchange מוטגנזה (FRAEM) היא אסטרטגיה המשמשת עבור מחיקה גנטית ממוקדת בשילוב עם החדרת קלטת בחירה מתן עמידות לאנטיביוטיקה וכתבת פלואורסצנטית11. עם זאת, FRAEM הוא מסובך על ידי הפוטנציאל של השפעות הקוטב בקלטת המושרה על הגנים במורד הזרם, במיוחד כאשר מיקוד גנים בתוך האופרונים polycistronic. קסטה מallelic exchange מוטזיס (FLAEM) היא גישה גנטית הרומן שפותחה כדי להקל על השפעות הקוטב המושרה קלטת בעבר נצפתה עם קלטת בחירת FRAEM12. FLAEM מנצל את הגנום לloxp העריכה כדי להסיר את הקלטת בחירה ושחזור ביטוי של גנים במורד הזרם. הקלטת הבחירה המכילה עמידות לאנטיביוטיקה וחלבון פלורסנט ירוק (GFP) מהונדסים מחדש עם האגף Loxp אתרים. אתרים אלה Loxp יכול לשלב מחדש בנוכחות של הrecombinase היצור והתוצאה של כריתה של הקלטת מן הגנום13. אסטרטגיה זו הוכח להקל על משפיע הקלטת אפקטים קוטביים כאשר מיקוד tmea עבור מחיקה12,14.

הן FRAEM ו-FLAEM שיטות לנצל את אותו וקטור התאבדות, pSUmC 4.0, אשר ניתן לשמור באופן מותנה דרך inducible ביטוי של pgp6. ביטוי של pgp6 יש בעבר הוכח להיות הכרחי עבור החזקת פלסטלינה, ולכן ממונפת כדי לשלוט בתחזוקה הפלמיד11,15. כאשר C. trachomatis גדל בתקשורת בתוספת טטרציקלין הידרלי (האווירית) כדי לגרום pgp6 ביטוי, וקטור נשמר. בהיעדר האווירית, הווקטור אובד. מחיקת גנים ממוקדת מושגת באמצעות allelic exchange של הגן עבור הקלטת בחירה. האזורים 3 kb ישירות במעלה ובמורד הזרם של הגן המיועד לשמש כזרועות הומולוגיה עבור שילוב מחדש. זרועות אלה משוכפלות לתוך pSUmC 4.0 וקטור מאגף את הקלטת הבחירה. מוצלח C. trachomatis ואירועים שילוב מחדש הם נצפו באמצעות דיווח פלואורסצנטית. ביטוי של שרי על השדרה הווקטורית ו gfp בתוך הקלטת בחירה להניב פלורסנט אדום וירוק הכללות. לאחר הסרת התקשורת האווירית הוסר מן המדיה התרבותית, ירוק בלבד הכללות לציין אירועים מוצלחים שילוב מוצלח עם אובדן וקטור ההתאבדות ואינטגרציה של הקלטת הבחירה לתוך הגנום חיידקי.

FLAEM מייצג הרחבה של FRAEM באמצעות שינוי הבאים של recombinase ביטוי וקטור, pSU-היצור, לתוך זן מוטציה חדש שנוצר. היצור recombinase מאפשר שילוב מחדש בין אתרי Loxp לבין כריתה של קלטת הבחירה. אירועים שילוב מחדש מצוינים באמצעות דיווח על קרינה פלואורסצנטית. מקודד וקטורי בטעםpsu; לפיכך, שינוי מוצלח מצוין על-ידי הוספת פלואורסצנטית אדום ל- gfp-הבעת הכללות. טיפוח בהעדר לחץ סלקטיבי לתוצאות הקלטת בשילוב מחדש באתרי Loxp , ואובדן הקלטת מצוין על ידי הכללות אדומות בלבד. כמו עם pSUmC-4.0, ביטוי inducible של pgp6 משמש לשמור מותנה psu-היצורים. ברגע שהאווירית והבחירה האנטיביוטיים מוסרים, הפלסמיד נרפא, והזן המתקבל של מחיקת המחיקה אינו פלורסנט. שיטה זו מטפלת בנושא של אפקטי הקוטב המושרה בקלטת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. עיצוב והרכבה של pSUmC-4.0 עם כלי נשק הומולוגיה ספציפית לגנים המעניינים

  1. זהה ~ 3 kb אזורים ישירות במעלה ובמורד הזרם של הגן המיועד למחיקה כדי לשמש 5 ' ו 3 ' הומולוגיה הזרועות לשילוב מחדש הומוולוגי (איור 1).
  2. עיצוב PCR התחל 1) להגביר את 3 kb 5 ' הומולוגיה הזרוע מ-DNA לא גנומית ו 2) מכילים 15 – 30 bp לתלות מסוים pSUmC-4.0 כאשר מתעכל באתר האנזים הגבלת סל. ודא כי האזורים הפריימר חופפים עם pSUmC-4.0 יש טמפרטורות התכה של 55 ° c והטמפרטורה ההיתוך לאורך כל התחל הם < 35 ° c.
  3. עיצוב PCR התחל 1) להגביר את 3 kb 3 ' הומולוגיה זרוע מ-DNA לא גנומית ו 2) מכילים 15 – 30 bp לתלות מסוים pSUmC-4.0 כאשר מתעכל באתר האנזים הגבלת SbfI. ודא כי האזורים הפריימר חופפים עם pSUmC-4.0 יש טמפרטורות התכה של 55 ° c והטמפרטורה ההיתוך לאורך כל התחל הם < 35 ° c.
  4. עיצוב PCR הקרנה התחל כי להגביר את ההכנסה של כל זרוע הומולוגיה לתוך pSUmC-4.0 וקטור לאחר תגובת הרכבה DNA16. לעצב את הצבעי היסוד האלה כדי לספח ~ 500 bp מחוץ לאתרי ההגבלה כדי לאפשר הדמיה קלה של מוצר ה-PCR גם אם ההכנסה לא הצליחה (איור 1).
  5. להגביר את 3 kb 5 ' ו 3 ' מוולוגיה הזרועות מן שחולצו טרי DNA לא גנומית על ידי ה-PCR באחד לשתי תגובות כדי להניב מספיק רסיס להרכבת DNA מאוחר יותר. בצע את הפרוטוקול של יצרן ה-DNA פולימראז עבור תגובה ספציפית הגדרת תנאי אופניים.
  6. ודא כי שני מוצרי ה-PCR הם הגודל הנכון וכי התגובות אינן מכילות להקות מזהם. הפעל 5 μL של כל תגובת ה-PCR על 1% דנ א ג'ל.
  7. לטהר ולרכז את חלקיקי ה-PCR על ידי הוצאת פנול/כלורופורם ומשקעים אתנול.
    1. בריכת כל 3 ' PCR תגובות יחד בצינור 1.5 mL ולהביא נפח סופי של 200 μL עם nuclease-H חינם2O. חזור על תהליך זה עבור 5 ' התגובות PCR.
    2. הוסף 200 μL של פנול לכל צינור ומערבולת עבור 30-60 s. ספין כל צינור במיקרוצנטריפוגה ב > 21000 x g עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. להעביר את השכבה העליונה השלב העליון של כל צינור לתוך שפופרת 1.5 mL חדש, להוסיף עשירית הנפח של 3 M נתרן אצטט לכל צינור, ואז קפיצי כדי לערבב.
    4. הוסף 3 כרכים של 100% אתנול לכל שפופרת ו קפיצי לערבב. מודקון שתי הצינורות ב-80 ° c עבור 20 דקות.
    5. גלולה ה-DNA על ידי ספינינג כל צינור ב > 21000 x g עבור 5 דקות ב-RT. להיפטר supernatant.
    6. לשטוף את הגלולה DNA עם 100 μL של 70% אתנול. ספין כל צינור ב > 21000 x g עבור 5 דקות ב RT. לבטל את הסופרנטאנט.
    7. לשטוף את הגלולה DNA שוב עם 100 μL של 100% אתנול. הספין כל צינור ב > 21000 עבור 5 דקות ב RT.. תבטל את הסופרנטאנט
    8. תן את הגלולה במלואה אוויר יבש, ואז בעדינות להשעות מחדש את ה-DNA ב 12 μL של nuclease-H חינם2O על ידי הצליף לערבב.
  8. לעכל 500 ng pSUmC-4.0 וקטור ב 20 μL תגובה עם 1 יחידה של סל ו 1 יחידה של SbfI לפי הפרוטוקול של הייצור. דגירה התגובה עבור כ 3 h או לילה כדי להבטיח את העיכול המלא של הווקטור.
  9. לטהר ולרכז את עמוד השדרה מתעכל על ידי הוצאת פנול/כלורופורם ומשקעים אתנול כמתואר קודם (שלב 1.7.1 – 1.7.9).
  10. לשלב את psumc מתעכל-4.0 וקטור ושניהם 5 ' ו 3 ' הומולוגיה זרוע PCR מוצרים יחד ביחס של 0.01 p, psumc-4.0 כדי 0.09 pמול כל זרוע הומולוגיה. הכנס את השברים בתגובת הרכבת DNA על פי פרוטוקול הייצור.
  11. שינוי הצורה 50 μL של האיי קולי אלקטרומוסמך עם 1 μl של תגובת ההרכבה של הדנ א. צלחת החיידק שהפך את ה-coli אל ליברות אגר צלחות המכילות 100 μg/mL spectinomycin על-ידי הפצת 150 μl לכל צלחת. מודאת הצלחות ב 37 ° c בלילה.
  12. למחרת, מושבות מסך עבור זריחה ירוק ואדום באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפייתי. סך של 5 – 30 מושבות לכל צלחת אגר צפוי.
  13. בחר 5 – 10 מושבות לאיחסן 4 mL של מרק LB שיושלם עם 100 μg/mL spectinomycin. תרבות הדגירה ב 37 ° c לילה עם טלטול ב 250 סל ד.
  14. באמצעות התרבויות E. coli לילה, לבצע טיהור בקנה מידה קטן DNA. ליוט ה-DNA עם 50 μL של nuclease-H חינם2O.
  15. לאשר את ההוספה של כל זרוע הומולוגיה לתוך pSUmC-4.0 וקטור באמצעות ה-PCR הקרנת התחל (תוכנן בשלב 1.4) כדי להגביר כל הכנסה. אם הרכבת DNA מצליחה, a ~ 4 kb מוצר PCR יש לצפות ב 1% DNA agarose ג'ל עבור שני אזורי הזרוע 5 ' ו 3. מוצר ה-PCR של ~ 1 kb מציין חוסר הכנסה.
    הערה: אם החדרת הזרועות ההומנילוגיה אינה מוצלחת בתגובת הרכבה כפולה, בצע שתי תגובות הרכבה כדי להכניס את הזרוע של 5 ואז 3, בנפרד. לעכל את הווקטור עם רק סל לפני הרכבת עם הזרוע 5, ואז לעכל את וקטור עם SbfI להרכיב את 3 ' זרוע.
  16. שינוי הסכר-/dcm- המוסמכת E. Coli עם 200 ng של psumc-4.0 התאספו עם שתי זרועות הומולוגיה. צלחת חיידקים שהפכו על ליברות אגר לוחות המכילים 100 μg/mL spectinomycin ידי הפצת 25 μL לכל צלחת. מודאת הצלחות ב 37 ° c בלילה. סך של 20 – 200 מושבות צפויים.
  17. המסך את הצלחות עבור מושבות פלורסנט אדום וירוק כמתואר בשלב 1.13.
  18. הגדרת תרבות עבור טיהור בקנה מידה גדול של DNA על ידי הנלווה 100 mL של מרק LB המכיל 100 μg/mL spectinomycin עם מושבות אדום וירוק. מודאת התרבות ב 37 ° c לילה עם טלטול ב 250 סל ד.
  19. לקצור את התרבות ולטהר את ה-DNA באמצעות טיהור בקנה מידה גדול DNA.
    1. השהה מחדש את הדנ א הטהור ב-100 μL של NF-H2O. התשואה הכוללת של DNA של לפחות 2 μg/μL הוא אידיאלי עבור שינוי C. trachomatis .
    2. רצף the 5 ' ו 3 ' הומולוגיה באזורים הזרוע כדי להבטיח הרכבה נכונה לתוך pSUmC-4.0 לפני הפיכת C. trachomatis.

2. טרנספורמציה של C. trachomatis עם psumc 4.0 + הומולוגיה זרועות למחיקה גנטית על ידי Allelic Exchange

  1. תאי מקוי זרעים, העכבר משמש לעיבוד כלמידיה, לתוך שני 6 היטב צלחות (1 x 106 תאים/גם) עם מדיה צמיחה #1. מודאת הצלחות ב 37 ° c עם 5% CO2 עד המונאולייר הוא שוטף (כ 24 שעות).
  2. בצינור 1.5 mL, להוסיף נפח של C. trachomatis WT הגופים היסודיים L2 (בס) כי הוא מספיק כדי להדביק 12 בארות של 6 צלחת לוחית במשרד משרד הבית של 2. גלולה הבס ב > 20000 x g עבור 30 דקות, ואז להיפטר supernatant.
  3. הפעל שינוי לא על-ידי השעיית מחדש בעדינות של בס ב-600 μL של CaCl2 מאגר, ולאחר מכן להוסיף 24 μg של pSUmC-4.0 + הומולוגיה זרועות לצינור. בעדינות לערבב את הפתרון על ידי מצליף. מודלת את הצינור ב RTfor 30 דקות ותנועה לערבב כל 10 דקות.
  4. הוסף את פתרון השינוי ל 24 מ ל של הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) ולערבב ידי בעדינות ליטוף. העברה 2 מ ל של האיתיות לכל טוב של תאים מקוי confluent ב 6 היטב צלחות ולהדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c.
  5. הסר את האירשת והחלף ב-2 mL/RPMI מדיית גידול ב#2. מודטה את לוחיות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  6. לאחר מינימום של 7 שעות, אך לא יותר מ-12 שעות, החלף את המדיה עם 2 מ ל/באר של מדיית בחירה #1. המשך הדגירה ב 37 ° c עבור 48 h מן הזמן של זיהום.
  7. הקציר ומעבר החיידקים על מונאולייר טרי של תאים מקוי.
    1. מגרד בעדינות את המונאולייר. כדי להרים את התאים לתוך המדיה העבירו את החומר מכל הבאר לתוך צינור 2 מ ל. גלולה את החומר התא ב > 20000 x g ב מיקרוצנטריפוגה עבור 30 דקות ב 4 ° c.
    2. הסר והשמט את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של HBSS על ידי ליטוף בעדינות.
    3. גלולה פסולת תא ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטנט אל הבאר מחדש של תאים מקקוי של קונשוטפת. הוסף בנוסף 1 מ ל של HBSS לקבלת נפח כולל של 2 מ"ל/ועוד.
    4. להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c. החלף את האפשרות במדיית בחירה #1 מיד לאחר ההדבקה.
  8. המשך לפרק את החיידקים על מונרוייר טרי של תאים מקוי (סעיף 2.7) כל 48 h עבור שלושה או יותר קטעים עד ההכללות אדום וירוק מזוהים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה epiפלואורסצנטית 24 שלאחר זיהום (24 hpi).
  9. לאחר זיהוי הכללות אדומות וירוקות, המשך לפרק את המונאולייר (סעיף 2.7) באמצעות מדיית בחירה #2.
  10. המשך מעבר הזדקנות המונרוייר עד ירוק בלבד הכללות מזוהים 24 hpi (המעבר #3 או מאוחר יותר), אשר מציין את אובדן pSUmC-4.0 וקטור ושילוב של הקלטת Loxp בחירה לתוך הגנום.
  11. בחרו באר אחת של הכללות ירוקות בלבד כדי להעשיר אותה על-ידי הפסנה. לקצור ולהקפיא כל בארות אחרות המכילות גם הכללות ירוקות בלבד בתוך מאגר של סוכרוז פוספט גלוטמט (SPG).
    1. כדי להעשיר את ההכללות ירוק-בלבד, מעבר את המונרוייר מבאר אחת של 6 צלחת הבאר כפי שנעשה בשלב 2.7, אבל לאחר הפלטינג הפסולת תא (שלב 2.7.3), להעביר את supernatant לתוך חרוט עם 12 מ ל של HBSS. השתמש באפשרות זו כדי להדביק 2 לוחות היטב על ידי הוספת 2 mL לכל טוב, ואז לסובב את לוחיות ב 900 x g עבור 60 דקות ב 20 ° c.
    2. כדי להקפיא בארות נוספות, לקצור את המונרוייר כמו בשלב 2.7.1, אבל להשעות מחדש את כדורי ב 1 מ ל של SPG במקום HBSS. גלולה פסולת תא (שלב 2.7.3) ולהעביר את supernatant לתוך 1.5 הקריו mL. הקפא את החומר ב-80 ° c.
  12. לאחר העשרת ירוק בלבד הכללות למשרד הבין של 0.5 – 1.0 (אחד לשני קטעים נוספים לאחר האיתור), הקציר monolayers לתוך SPG כמתואר בשלב 2.11.2. קבל ali, ts של 50 μL ב 1.5 מ ל צינורות ו להקפיא ב-80 ° c.
  13. Titer ירוק בלבד חיידקים כדי לקבוע הכללה, יצירת יחידות/μL, על פי פרוטוקול titer סטנדרטי17.

3. בידוד שבטים של גרין-בלבד C. trachomatis מחיקה מוטציה המכילה את הקלטות הבחירה מקיפים את ה- loxp על ידי הגבלת דילול

  1. זרעים a 384 היטב התרבות רקמה צלחת עם 50 μL של תאים מקוי ב ~ 2,000 תאים/גם במדיית הצמיחה #1. מודטה ב 37 ° c עם 5% CO2 עבור ~ 24 שעות או עד שוטפת.
  2. לדלל את סדרת מחלקים של ירוק בלבד חיידקים ב hbss כדי להשיג ~ 50 בס ל 20 מ ל. העבר את הנואת הדילול למגש של מאגר.
    1. להסיר את המדיה מ 384 צלחת הבאר על ידי מצליף בחוזקה את הצלחת כולה הפוך לתוך מכולה פסולת. שימוש בפיפטה רב-ערוצית, הוסף 50 μL של C. trachomatis . להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c.
      הערה: היה מתחשב לא לחבוט כל כך חזק שהמונאולייר מתנתק. אם התאים הם מעבר לקשר, הם מתנתק ביתר קלות.
  3. הסר את החיסונים על ידי מצליף ולהחליף עם 50 μL/היטב מדיית הצמיחה #2. לוחיות הדגירה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
    הערה: בשלב זה, שילוב של קלטת הבחירה לתוך הגנום הוא יציב, כך בחירה אנטיביוטית עם spectinomycin כבר לא נדרש.
  4. לאחר הדגירה של הצלחת עבור 5 – 12 ימים, לזהות בארות בודדות עם הכללות פלורסנט ירוק באמצעות מיקרוסקופ הפוכה epiפלואורסצנט או פלטפורמת ההקרנה תוכן גבוה.
  5. בארות הקציר עם הכללות ירוק בלבד על ידי גירוד המונרוייר עם טיפ-10 והעברת התוכן כולו של הבאר לתוך צינור המכיל 2 מ ל של HBSS. בעדינות לערבב ולהחיל את 2 מ ל של האירשת למונאולייר מקקוי מחדש ב 6 היטב צלחת לזיהום.
    הערה: כאשר מזהים בארות בודדות עם הכללות, ההכללות יהיו באשכול בשל התרחבות מההכללה הראשונית. אם הבאר יש אשכולות מרובים, סביר להניח כי יותר מאחד EB בתחילה נגוע זה היטב. בארות אלה לא צריך להיות שנקטפו, ובמקרים מסוימים, כדורים מרובים של בידוד שבטים על ידי דילול סדרתי עשוי להיות הכרחי.
  6. להדביק את 6 צלחת הבאר על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c. החלף את הנרשת באמצעות 2 mL/היטב מדיית גדילה #2. מודטה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 48 h.
  7. חזור על שלבים 2.11 – 2.13 להעשיר, להקפיא, ולאוכלוסיות שבטים.
  8. אשר מחיקה של גנים ייעודיים מclonally מבודדים C. trachomatis באמצעות qpcr כמתואר בעבר12.

4. טרנספורמציה של C. trachomatis החשבונאי עם psu-היצורים ליזום הסרת loxp מוקף מסגרות בחירה

  1. חזור על תהליך השינוי בצלחת 6 היטב כפי שמתואר בעבר (שלבים 2.1 – 2.8) באמצעות clonally מבודדים C. trachomatis fraem, וקטור psu, ובחירה מדיה #3.
    הערה: שינוי מוצלח מצוין על-ידי הכללות הינן פלורסנט אדום וירוק.
    1. מעבר למונאולייר עד שההכללות האדומות בלבד מזוהות באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפייתי, המציין אובדן של קלטת הבחירה (שניים עד שלושה מעברים). המשך בהמשך הזדקנות המונאולייר עד שההכללות האדומות מועשר למשרד משרד הבמה של ~ 0.5.
  2. Clonally לבודד אדום בלבד הכללות על ידי הגבלת דילול בצלחת 384 היטב כמתואר בעבר (שלבים 3.1 – 3.8); עם זאת, השתמש במדיית בחירה #3 עבור כל השלבים.
  3. העשרת אוכלוסיות שבטים על ידי הפסנה עד משרד ה0.1. ברגע שהוא מועשר, החלף מדיית מקטע עם מדיית צמיחה #2 ליזום אובדן של וקטור pSU-הספק (בערך שלושה עד ארבעה מעברים).
  4. Clonally בידוד חיידקים שאינם פלורסנט (שלבים 3.1 – 3.8); עם זאת, לסרוק באופן ידני את הצלחת עם מיקרוסקופ ברייטפילד כדי לזהות הכללות. העשרת והקפאת חיידקים (שלב 2.11 – 2.12).
  5. מסך עבור זן מוטציה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת, בלוק המערבי, ואת רצפי DNA כל הגנום כמתואר בעבר12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטה עבור מחיקת גנים מרקרבלי ב -C. trachomatis באמצעות flaem מבוססת על שיבוט זהיר וטכניקות שינוי. מוצלח allelic רקומבינציה הוא צעד ראשון חיוני והוא דורש זיהוי והחדרת של זרועות הומולוגיה לתוך psumc-4.0 שיבוט וקטור (איור 1). צעד שנייה חיוני עבור מחיקת גנים markerless היא הסרת הכתב הפלואורסצנ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן עבור הדור של מחיקות גנים markerless ב- C. trachomatis ידי flaem מאפשרת מחיקה ממוקדת של גנים לא חיוניים ומבטלת המושרה קלטת אפקטי הקוטב. הפרוטוקול מסתמך על עיצוב קפדני של 5 ' ו 3 ' זרועות הומולוגיה שנוספו לתוך pSUmC 4.0 וקטור התאבדות, שינוי יעיל של C. trachomatis, והקרנה זהירה של זנים מוטנ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שירות בריאות הציבור מן המכון הלאומי לבריאות, NIAID (מענקים A1065530 ו Al124649), כדי K.A. שדות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseKSE ScientificBMK-A1705Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochlorideACROS Organics233131000
CaCl2 Buffer10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride DihydrateSigmaC7902-500GSuitable for cell culture
CycloheximideSigma7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coliNew England BioLabsC2925H
DMSOATCC4-XSterile filtered cell culture tested
Glutamic acidSigmaG8415-100GL-Glutamic acid
Growth Media #1RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)Gibco24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)GibcoA38402-02
McCoy CellsATCCCRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BioLabsT1010SSmall scale DNA purification
NaH2PO4SigmaS3139-250GSodium phosphate monobasic
Na2HPO4SigmaS5136-500GSodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli CellsNew England BioLabsC3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning KitNew England BioLabsE5520SGibson Assembly Kit
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MUBioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsM0515Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x)Gibco11875-093Containing 2mM L-glutamine
Sall-HFNew England BioLabsR3138S
Sbfl-HFNew England BioLabsR3642S
Selection Media #1RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer SolutionSigmaS7899-100ML3M
SOC Outgrowth MediumNew England BioLabsB9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture GradeAlfa AesarJ61820
SucroseSigmaS1888-1KGBioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
TrisAMRESCO0497-5KGUltrapure grade
Trypsin-EDTA (1x)Gibco25200-0560.25%
WaterSigmaW3500-500MLSterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239(2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343(2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989(2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817(2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479(2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640(2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142(2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155recombinaseFLAEMFRAEMallelic exchangeallelic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved