אימות הגנום השלם רצף Nanopore, באמצעות וירוס אוסוטו כדוגמה

Summary

בעבר שאנו אימות פרוטוקול עבור amplicon מבוסס הגנום השלם וירוס אוסוטו (אוסווי) רצף על פלטפורמת רצף nanopore. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפירוט רב יותר ולקבוע את קצב השגיאה של תא הזרימה nanopore R10.

Abstract

רצף הגנום כולו יכול לשמש לאפיון ולמעקב התפרצויות ויראליות. Nanopore מבוססי פרוטוקולים רצף שלמות הגנום תוארו עבור מספר וירוסים שונים. גישות אלה לנצל את הגישה המבוססת על המבוסס על-ידי התקרבות, אשר ניתן להשתמש בה כדי למקד וירוס ספציפי או קבוצה של וירוסים הקשורים גנטית. בנוסף אישור של נוכחות וירוס, רצף יכול לשמש למחקרים אפידמיולוגיה גנומית, כדי לעקוב אחר וירוסים ולפענח מקורות, מאגרים ומצבי שידור. עבור יישומים כאלה, חיוני להבין את ההשפעות האפשריות של שיעור השגיאה המשויך לפלטפורמה הנמצאת בשימוש. יישום שגרתי בתחום הבריאות הקליני והציבורי דורש כי הדבר מתועד בכל שינוי חשוב בפרוטוקול. בעבר, פרוטוקול עבור שלמות הגנום אוסוטו רצף וירוס על פלטפורמת nanopore רצף היה מאומת (R 9.4 flowcell) על ידי השוואה ישירה ברצף המאיר. כאן, נתאר את השיטה המשמשת לקביעת כיסוי הקריאה הנדרש, תוך שימוש בהשוואה בין תא הזרימה R10 לבין רצף המאיר כדוגמה.

Introduction

התפתחויות מהירות בטכנולוגיות הדור השלישי מאפשרת לנו לנוע קדימה לקראת קרוב לרצף בזמן אמת במהלך התפרצויות ויראליות. זה הזמינות בזמן של מידע גנטי יכול להיות שימושי כדי לקבוע את המקור ואת האבולוציה של פתוגנים ויראלי. סטנדרטים זהב בתחומים של רצף הדור הבא עם זאת, הם עדיין הדור השני של הרצף. טכניקות אלה מסתמכות על טכניקות ספציפיות וגוזלת זמן כמו הגברה של שבטים במהלך ה-PCR של אמולסיה או הגברה של גשר המשובטים. הסקואים הדור השלישי זולים יותר, מוחזקים ביד ומגיעים עם מתודולוגיות פשוטות להכנה בספרייה. במיוחד הגודל הקטן של התקן הרצף ומחיר הרכישה הנמוך הופך אותו למועמד מעניין לרצף שניתן לפריסה. זה יכול להיות מופע להיראות במהלך התפרצות הנגיף האבולה בסיירה לאונה במהלך מתמשך בחקירת התפרצות מועבר בברזיל^1,2,3. עם זאת, שיעור השגיאה הגבוה המדווח⁴ עשוי להגביל את היישומים שעבורם ניתן להשתמש ברצפי הnanopore.

רצף הNanopore מתפתח במהירות. מוצרים חדשים זמינים בשוק על בסיס קבוע. דוגמאות לכך הן למשל 1D בריבוע ערכות אשר מאפשר רצף של שני קווצות של מולקולת ה-DNA, ובכך להגביר את הדיוק של בסיסים שנקראו⁵ ואת הפיתוח של תא זרימה R10 אשר מודד את השינוי הנוכחי בשני מופעים שונים בנקבובית⁶. בנוסף, שיפור בכלים ביו-מגמטיים כמו שיפורים בבאסינג ישפרו את דיוק החיים⁷. אחד מהאולמרים הנפוצים ביותר, (לדוגמה, Albacore), עודכן לפחות 12 פעמים בפרק^{זמן של 9 חודשים.} לאחרונה, היצרן גם פרסמה basecaller רומן בשם flip-פלופ, אשר מיושם בתוכנת nanopore ברירת המחדל⁸. יחד, כל השיפורים האלה יוביל לרצפים מדויקים יותר ויקטין את שיעור השגיאה של ברצף nanopore.

וירוס אוסוטו (אוסווי) הוא וירוס שנישא נגד יתושים של המשפחה Flaויוויאן והוא בעל הגנום החיובי של RNA שנתקע סביב 11,000 נוקלאוטידים. אוסוב משפיע בעיקר על הינשופים האפורים והשחורים^9,10, למרות מינים אחרים של ציפורים רגישים גם לזיהום של אוסווי¹¹. לאחרונה, התגלתה גם מכרסמים ושתן למרות שתפקידם הפוטנציאלי בתמסורת של הנגיף נשאר לא ידוע¹². בבני אדם, זיהומים אסימפטומטיים תוארו בתורמים^{דם 13,14,15,16} בעוד זיהומים אוסווי גם דווחו להיות משויכים לדלקת קרום המוח או¹⁷דלקת קרום^{המוח 17,18}. בהולנד, אוסווי התגלתה לראשונה בציפורי בר ב-2016¹⁰ ובתורמים דם ללא תסמינים ב-2018¹⁴. מאז הגילוי הראשוני של אוסווי, התפרצויות דווחו במהלך השנים הבאות ומעקב, כולל רצף הגנום השלם, מתמשך כיום לפקח על להגיח והתפשטות של מועבר באוכלוסיה נאיבית בעבר.

בדומה למה שתואר עבור וירוסים אחרים, כגון נגיף האבולה, וירוס zika וירוס קדחת צהובה^3,19,20, פיתחנו תחל להגדיר רצף מלא באורך אוסווי²¹. זו תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוסס גישה מאפשר התאוששות באורך מלא של הגנום ה-ea v מסוג מארח מאוד מזוהם סוגים כמו דגימות המוח בדגימות עד ערך Ct של סביב 32. היתרונות של הגישה ברצף מבוססי amplicon הם רגישות גבוהה יותר לעומת רצף מטאגנאומית וספציפיות יותר. מגבלות של שימוש amplicon מבוססי גישה הם כי רצפי צריך להיות דומה כדי לעצב התאמה התחל כל הזנים, כי התחל מתוכננים על הידע הנוכחי שלנו על גיוון וירוס.

בהינתן ההתפתחויות והשיפורים הקבועים ברצף הדור השלישי, יש צורך להעריך את שיעור השגיאה של הרצף על בסיס קבוע. כאן, אנו מתארים שיטה להעריך את הביצועים של nanopore ישירות נגד רצף המאיר באמצעות ה-אוסווי כדוגמה. שיטה זו מוחלת על רצפים שנוצרו עם התא העדכני ביותר R10 flow ו-basecalling מבוצעת עם הגירסה העדכנית ביותר של basecaller flip-פלופ.

Protocol

הערה: רשימת כלי התוכנה לשימוש: usearch v 11.0.667; v 3.8.1551 שרירים; porechop 0.2.4; 2.5 הסתגלות; minimap2 2.16-r922; samtools 1.9; 0.39; bbmap 38.33; ספיידס v 3.13.1; kma-1.2.8

1. פריימר עיצוב

1. התחל עם הורדה או אחזור של ערכת התייחסות רלוונטית של רצפי הגנום כולו מאוספי נתונים ציבוריים או פרטיים. למשל, לאחזר את כל מלוא האורך של הגנום המלא (taxid64286) ממסד הנתונים של נ. ק. ו²². אוסוב מקודד גנום של סביב 11,000 נוקלאוטידים כך רק לאחזר את רצפים עם אורך רצף של 8000-12000 נוקלאוטידים. בצע פעולה זו באמצעות ערך החיפוש הבא:
   - taxid64286 [אורגניזם: noexp] ו 8000 [SLEN]: 12000 [SLEN].
   1. לחץ על שלח אל | הקלטה מלאה | קובץ מסמך; השתמש בתבנית = FASTA וצור את הקובץ.
2. כדי לבטל את הגודל של ערכת רצפי ההפניות, הסר רצפים כפולים או רצפים עם למעלה מ-99% הזהות של הנתונים. בצע פעולה זו באמצעות האפשרות המהירה של האשכול מ-usearch²³. בשורת הפקודה הזן:
   - חיפוש-cluster_fast All_USUV. fasta-id 0.99-מAll_USUV_dedup
3. כדי ליצור את התחל, יש ליישר רצפים. זה נעשה באמצעות שריר²⁴. בשורת הפקודה הזן:
   - שרירים בתוך All_USUV_dedup fasta-out All_USUV_dedup_aligned. fasta-יומן רישום log_muscle. txt
   הערה: חיוני לבדוק ידנית את היישור כדי לבדוק אם יש אי-התאמות. אלה ניתן לתקן באופן ידני במידת הצורך ואת הקצוות ניתן לגזוז בהתאם לאורך של רוב רצפי הגנום כולו.
4. ראשוני משמש כדי לבצע טיוטה הבחירה של התחל אשר ניתן להשתמש עבור אמפליקון אורך מלא ברצף¹⁹. להעלות את היישור לאתר הראשוני (http://primal.zibraproject.org/) ולבחור את הצורה אמפליקון המועדף ואת אורך חפיפה בין הגברה שונים. עבור אל primal.zibraproject.org, מלא את שם הערכה, טען את קובץ ה-fasta המיושר, בחר באורך אמפליקון, בגודל חפיפה וצור את הערכה.
5. יישר את הערכה המלאה של רצפי ה-אוסוב המלא הזמינים (ולא את הערכה המשוכפלת). בשורת הפקודה הזן:
   - שרירים בתוך All_USUV fasta-out All_USUV_aligned. fasta-יומן רישום log_muscle. txt
   הערה: למפות את התחל שנוצר נגד היישור המלא (לא להשתמש ביישור משוכפל), לתקן באופן ידני שגיאות ולכלול מקסימום 5 עמדות ניווניות.

2. מולטיפלקס

1. בצעו את מגוון ה-PCR בעזרת הnanopore התחל והעיצוב המאיר. המגה-ביפלקס עבור אוסווי בוצע¹⁹כמתואר^{לאחרונה 19,21}.
2. לבצע basecalling עם היפוך-פלופ גרסה 3.0.6.6 + 9999d81.

3. ניתוח נתונים להפקת רצפי הסכמה מנתונים nanopore

1. מספר דגימות ניתן לריבוב על הפעלת רצף nanopore יחיד. לאחר ביצוע הרצף להפעיל את הנתונים nanopore. . השתמש בPorechop²⁵ בשביל זה כדי למנוע זיהום ולשפר את הדיוק, השתמש בדגל require_two_barcodes . בשורת הפקודה הזן:
   . porechop-. אני Run_USUV-Run_USUV_demultiplex-require_two_barcodes
2. לאחר deריבוב, להסיר רצפים פריימר (המצוין בקובץ Primers_Usutu. fasta בשני הכיוונים) באמצעות הסתגלות²⁶. בנוסף, להסיר רצפים עם אורך קצר יותר מ 75 נוקלאוטידים. יש להסיר את התחל מאחר שהם יכולים להחדיר ביוסים מלאכותיים ברצף הקונצנזוס. בשורת הפקודה הזן:
   - הסתגלות-b קובץ: Primers_USUV. fasta-o BC01_trimmed. FASTQ BC01. fastq-m 75
3. כיצד ניתן למפות רצף של הפניות מופקות מראש כנגד פאנל של זנים התייחסות נפרדים באמצעות minimap2²⁷ ורצף הסכמה ניתן ליצור באמצעות samtools²⁸. בצע את הדוגמה שלהלן המציגה את השגרה של יישור מבוסס הפניה ויצירת רצף הקונצנזוס של מדגם אחד: BC01. בשורת הפקודה הזן:
   - minimap2-ax מפה-ont Random_Refs_USUV BC01_trimmed. fastq > BC01. bam
   - samtools מיון BC01. bam > BC01_sorted. באם
   - bcftools mpileup-Ou-f Random_Refs_USUV. fasta BC01_sorted. באם | bcftools קריאה-mv-Oz-o BC01. vcf. gz
   - bcftools מדד BC01. vcf. gz
   - cat Random_Refs_USUV-fasta | bcftools קונצנזוס BC01. vcf. gz > BC01_consensus. fasta
4. עבור יישור מבוסס-הפניה, חיוני שנעשה שימוש ברצף התייחסות הקשור באופן הדוק. לכן, בצע חיפוש BlastN עם רצף הקונצנזוס שנוצר כדי לזהות את זן ההפניה הקרוב ביותר. לאחר מכן, חזור על יישור מבוסס הייחוס עם זן ההפניה הקרוב ביותר כהפניה (שלב 3.3 ו-3.4). בשורת הפקודה הזן:
   - minimap2-ax מפה-ont Ref_USUV_BC01 BC01_trimmed. fastq > BC01_ref. bam
   - samtools מיון BC01_ref. bam > BC01_sorted_ref. באם
   - bcftools mpileup-Ou-f Ref_USUV_BC01. fasta BC01_sorted_ref. באם | bcftools קריאה-mv-Oz-o BC01_ref. vcf. gz
   - bcftools אינדקס BC01_ref. vcf. gz
   - החתול Ref_USUV_BC01. fasta | הסכמה בקונצנזוס BC01_ref. vcf. gz > BC01_ref_consensus. fasta

4. ניתוח נתוני המאיר

1. רצפים אלה מקטעי באופן אוטומטי לאחר ביטול הרצף. הקריאות יכולות להיות מבוקרות באיכות באמצעות trimmomatic²⁹. עבור רצפי מזווג בקצה מאוחד, השתמש בציון PHRED החציוני הנפוץ של 33 ואורך קריאה מינימלי של 75 כדי לקבל קריאה מדויקת, איכות גבוהה. בשורת הפקודה הזן:
   - מphred33-מ9_S9_L001_R1_001. fastq. gz 9_S9_L001_R2_001. fastq. gz 9_1P. fastq 9_1U. fastq 9_2P. fastq 9_2U. fastq המוביל: 3 נגרר: 3 החלון: 3:15 מינילן: 75
2. הסר את התחל (המצוין בקובץ Primers_Usutu. fasta בשני הכיוונים), שכן הם יכולים להציג הטיות מלאכותיות, באמצעות הסתגלות²⁶. בנוסף, להסיר רצפים עם אורך קצר יותר מ 75 נוקלאוטידים באמצעות הפקודות להלן. בשורת הפקודה הזן:
   - הסתגלות-b o 9_1P_trimmed. fastq-p 9_2P_trimmed. fastq 9_1P. fastq 9_2P. fastq-m 75
3. לפני ההרכבה דה נובו, הרצף קורא יכול להיות מנורמל עבור כיסוי אפילו על פני הגנום. הדבר חיוני מאז הרכבת דה נובו כמו ספיידס לקחת את כיסוי הקריאה בחשבון בעת הרכבה הרצף קורא. נרמול קורא לכיסוי קריאה של 50 באמצעות BBNorm מתוך חבילת Bbnorm³⁰. בשורת הפקודה הזן:
   - bbmap/bbmap. sh יעד = 50 ב = 9_1P_trimmed. fastq in2 = 9_2P_trimmed. fastq out = Sample9_FW_norm. fastq out2 = Sample9_RE_norm. fastq
4. הקריאות המנורמלות הן דה נובו שנאסף באמצעות ספיידס³¹. הגדרות ברירת המחדל משמשות עבור ההרכבה באמצעות כל המטרות השונות (21, 33, 55, 77, 99 ו-127). בשורת הפקודה הזן:
   - spades.py-k 21, 33, 55, 77, 99127-o Sample9-1 Sample9. qc. f. fq-2 Sample9. qc. r. fq
5. מפת ה-QC קוראת כנגד רצף הקונצנזוס המתקבל באמצעות minimap2 ותוכניות כמו Geneious, Bioedit או Ugene כדי לצמצם את היישור. חשוב לבדוק את ההתחלה והסוף של הקונטיג.
   1. יישור ה-QC קורא כנגד רצף ההסכמה המתקבל באמצעות minimap2.
   2. יבא את היישור ב-Geneious/Bioedit/UGene.
   3. בדוק באופן ידני, נכון ו כומר במיוחד את ההתחלה ואת סוף הגנום.

5. קביעת כיסוי הקריאה הנדרש כדי לפצות על פרופיל השגיאה ברצף nanopore באמצעות נתוני המאיר כסטנדרט זהב

1. בחר רצף קורא מיפוי לאחד אמפליקון, במקרה זה אמפליקון 26. לאחר מכן, למפות את nanopore קורא נגד אמפליקון זה באמצעות minimap2. השתמש samtools כדי לבחור רק את מיפוי הקריאות כדי אמפליקון 26 ו כדי להמיר את הקובץ bam ל fastq. בשורת הפקודה הזן:
   - minimap2-ax מפה-ont-m 150 Amplicon26. fasta BC01_trimmed. fastq > BC01. bam
   - השקפה של samtools-b-F 4 BC01 ב> BC01_mapped-bam
   - samtools bam2fq BC01_mapped-bam | seqtk seq--> BC01_mapped. fastq
2. בחר באופן אקראי קבוצות מערכות של למשל 200 רצף קורא 1000 פעמים. לדוגמה, שינוי המנה ל-10 יגרום לבחירה האקראית של 1000 פעמים בקבוצת משנה של 10 קריאות רצף. הסקריפט מסופק כקובץ משלים 1. בשורת הפקודה הזן:
   - פיתון Random_selection. py
3. כל הקריאות הנבחרות באופן אקראי מיושרות ל-אמפליקון 26. השתמש ב-KMA³² כדי למפות את הרצף הקורא וכיצד ליצור באופן מיידי רצף הסכמה. השתמש בהגדרות ממוטבות עבור רצף nanopore, המצוין על-ידי דגל bcNano. בשורת הפקודה הזן:
   מדד kma-i Amplicon26. fasta
   - עבור הקובץ בrandom_sample *; האם
   - סמליאיד = $ {קובץ%. fastq}
   - kma-i $ {סמלאיד}. fastq-o $ {סמליאיד}-T_db Amplicon26. fasta-mem_mode-mp 5-גברת 0.0-bcNano
   . נעשה
4. בדוק את רצפי הקונצנזוס שנוצרו בשורת הפקודה באמצעות:
   - חתול *. fsa > All_genomes fsa
   - minimap2-ax מפה-Ont Amplicon26. fasta All_genomes. fsa > All_genomes. bam
   - samtools מיון All_genomes. באם > All_genomes_sorted. באם
   - הנתונים הסטטיסטיים של samtools All_genomes_sorted. באם > נתונים סטטיסטיים. txt
   1. שיעור השגיאה מוצג ב-stats. txt תחת שיעור שגיאת הכותרת #mismatches/בסיסים ממופים. הצג אותו על המסך עם הפקודה הבאה:
      - grep ^ SN סטטיסטיקת. txt | גזור-f 2-
   2. כמות האינדלים מוצגת תחת הכותרת #Indels לכל מחזור. הצג אותו על המסך עם הפקודה הבאה:
      - grep ^ IC סטטיסטיקה. txt | גזור-f 2-

תוצאות

לאחרונה, גרסה חדשה של הגרסה תא הזרימה (R10) שוחרר והציע שיפורים basecaller להשתמש כדי להמיר את האות הנוכחי אלקטרונית רצפי DNA (מה שנקרא flip-פלופ basecaller). לכן, יש לנו מחדש את ה-"א-וי-בי" מרקמת מוח של ינשוף שהיה מאוד חיובי, שהיה בעבר בתוך תא זרימה של R 9.4^ובכליהארה ב. כאן, תיארנו את השיטה המשמשת כדי לקבוע את כיסוי הקריאה הנדרש לקונצנזוס אמין הקורא בהשוואה ישירה לרצף המאיר.

באמצעות תא הזרימה החדש בשילוב עם basecaller flip-פלופ אנו מראים כי כיסוי קריאה של 40x תוצאות התוצאות זהה לעומת רצף המאיר. כיסוי קריאה של 30x תוצאות בשיעור שגיאה של 0.0002% אשר מתאים לשגיאה אחת בכל 585,000 נוקלאוטידים ברצף, בעוד כיסוי קריאה של 20x תוצאות בטעות אחת בכל 63,529 נוקלאוטידים ברצף. כיסוי לקריאה של 10x תוצאות בטעות אחת בכל 3,312 נוקלאוטידים ברצף, כלומר, מעל שלושה נוקלאוטידים לכל הגנום המלא של ה-אוסווי מכונים שגויים. עם כיסוי לקריאה מעל 30x, לא הבחינו הטינולים. כיסוי לקריאה של 20x הביא לזיהוי של מיקום indel אחד בעוד כיסוי קריאה של 10x הביא לטינודלים ב 29 תנוחות. מבט כולל על שיעור השגיאה באמצעות קיצוץ כיסוי שונה של עיתוד קריאה מוצג בטבלה 1.

כיסוי	שגיאות איטראציה 1	איטראציה של קצב שגיאות 1	כלים מנודלים:	שגיאות איטראציה 2	איטראציה של קצב שגיאות 2	כלים מנודלים:	שגיאות איטראציה 3	איטרציה של קצב שגיאות 3	כלים מנודלים:
10 ×	100	0.0274%	4	116	0.0297%	18	110	0.0282%	7
20 ×	4	0.0010%	0	6	0.0015%	1	7	0.0018%	0
30x	2	0.0005%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0
40x	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0
50 ×	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0

טבלה 1: מבט כולל על קצב השגיאה של רצף nanopore. כל איטראציה מייצגת 1000 דגימות אקראיות.

קובץ משלים 1: בחירה אקראית. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Discussion

רצף Nanopore מתפתחת כל הזמן ולכן יש צורך בשיטות כדי לפקח על שיעור השגיאה. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לפקח על שיעור השגיאה של nanopore רצף. הדבר יכול להיות שימושי לאחר שחרורו של תא זרימה חדש, או אם מהדורות חדשות של הביתא משוחררות. עם זאת, פעולה זו עשויה להיות שימושית גם עבור משתמשים המעוניינים להגדיר ולאמת את פרוטוקול הרצף שלהם.

כלי תוכנה ויישור שונים יכולים להניב תוצאות שונות³³. בכתב יד זה, כיוונו להשתמש בחבילות תוכנה זמינות באופן חופשי, המשמשות בדרך כלל, ובהן תיעוד ברור. במקרים מסוימים, ניתן להעניק העדפה לכלים מסחריים, שבדרך כלל יש ממשקים ידידותיים יותר למשתמש, אך יש לשלם עבורם. בעתיד, שיטה זו יכולה להיות מוחלת על אותו מדגם במקרה של שינויים גדולים בטכנולוגיית רצף או התוכנה basecalling נג מוצגים המועדפת באופן זה צריך להיעשות לאחר כל עדכון של basecaller או הזרימה, עם זאת בהתחשב במהירות של ההתפתחויות הנוכחיות זה יכול להיעשות גם לאחר עדכונים גדולים.

הפחתת שיעור השגיאה ברצף מאפשרת מספר גבוה יותר של דגימות להיות מרובב. ובכך, רצף nanopore מתקרב להחלפת בדיקות קונבנציונאלי בזמן אמת האבחון האבחוני, אשר כבר במקרה של אבחון וירוס שפעת. בנוסף, הפחתת שיעור השגיאה מגבירה את השימושיות של רצף הטכניקה הזה, למשל לקביעת גרסאות משניות ולקביעת רצף מטגנאומית בתפוקה גבוהה.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא שניתן להשיג רצפי הפניות אמינים ומהימנים. התחל מבוסס על הידע העדכני על גיוון וירוס וייתכן שיהיה צורך לעדכן מדי פעם. נקודה קריטית נוספת בעת הגדרת הגישה המבוססת על הרצף של אמפליקון היא האיזון של הריכוז הפריימר כדי לקבל איזון זוגי באמפליפי עומק. פעולה זו מאפשרת ריבוב של דגימות נוספות ברצף ומעלה הפחתת עלות משמעותית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
dNTPs	Qiagen	201900
FLO-MIN106 R10 flowcell	Nanopore	R10 flowcell
KAPA Hyperplus libarary preparation kit	Roche	7962436001
Library Loading Bead Kit	Nanopore	EXP-LLB001
Ligation Sequencing Kit 1D	Nanopore	SQK-LSK109
Native Barcoding Kit 1D 1-12	Nanopore	EXP-NBD103
Native Barcoding Kit 1D 13-24	Nanopore	EXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	NEB	M0367S
NEB Next Quick Ligation Module	NEB	E6056
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module	NEB	E7546S
Protoscript II Reverse Transcriptase	NEB	M0368X
Q5 High-Fidelity polymerase	NEB	M0491
Qubit dsDNA HS Assay kit	Thermo Fisher	Q32851
Random Primers	Promega	C1181
RNAsin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111