בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

Summary

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

Abstract

אבני בניין מותאמות פרוטטינואאוס הם מועמדים מגוונים עבור הרכבה של מבנים supraמולקולריים כגון תאים מינימליים, כלי רכב של משלוחי סמים והאנזים פיגומים. עקב תאימות תאימות שלהם על הרמה הגנטית, החלבונים כמו אלסטין (למשל) הם אבני בניין אידיאלי עבור יישומים ביו טכנולוגיים ביו-רפואיים. אף על פי כן, ההרכבה של מבנים supraמולקולריים מבוססי חלבון עם תכונות פיזיוכימיות ברורים ופוטנציאל מעטפת טוב נשאר מאתגר.

כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים יעילים עבור הרכבה עצמית מודרך של elps אמפיפילי לתוך ארכיטקטורות חלבון סופרא מולקולרית כגון כדורי כדורית, סיבים ושלפוחיות יציבה. פרוטוקולי ההרכבה שהוצגו ליצור תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) מבוסס על ELPs עם תכונות הסתגלות פיסיוכימיקלים. PMBCs להפגין התנהגות הפרדת הפאזה וחשיפת שיטת היתוך ממברנה תלוי ומסוגלים לכמסים מגוון כימית מולקולות מטענים פלורסנט. PMBCs וכתוצאה מכך יש פוטנציאל יישום גבוה כמו ניסוח התרופה ופלטפורמת המסירה, תא מלאכותי, וחלל התגובה מידור.

Introduction

הרכבת של מבנים supraמולקולריים ליישומים ביוטכנולוגיים הופכת להיות חשובה יותר ויותר^1,2,3,4,5. עבור ההרכבה של ארכיטקטורות פונקציונלי כגון מאכאוטים, ושלפוחיות, וסיבים עם תכונות פיסיוכימיקלים הרצוי חשוב להבין ולשלוט על המאפיינים הפיזיקליים והקונפורמציה של הרכיבים. בשל הדיוק המולקולרי של מולקולות שנמצאו בטבע, אבני בניין עבור מבנים supraמולקולריים מבוססים יותר ויותר על שומנים, חומצות גרעין או חלבונים. לעומת פולימרים סינתטיים, אבני הבניין פרוטטינואאוס לאפשר שליטה מדויקת על מבנה סופרא מולקולרית מתהווה⁶ ברמה הגנטית. החומצה האמינית העיקרית (aa) הרצף של אבני בניין חלבון בודדים מקודד את המידע עבור פוטנציאל ההרכבה שלהם מן המולקולרי עד רמת מאקרוסקופי, כמו גם את הצורה תלת מימדי ותכונות פיזיות של מבנה סופרא מולקולרית הסופי⁷.

שיטות מדווחות להרכבת מבנים מולקולריים שונים מעורבות לעתים קרובות בחלבונים מסוג שונות, כגון אלסטין עם חלבונים רגישים בטמפרטורה.^{מיכל 5,8,9}, רקומביננטי oleosin¹⁰ומטבעוניים של חלבון מלאכותי¹¹. הטמפרטורות שגרמו לשיטות הובילו להרכבת מיקרולים^4,10,12, סיבים¹³, סדינים¹⁴ושלפוחיות^9,15,16. שיטות הכוללות ממיסים אורגניים הוחלו על היווצרות חלבון דינאמי מבוסס שלפוחיות^8,11,14. עד כה, פרוטוקולים שהוחלו עבור היווצרות שלפוחית לעיתים קרובות חסרים בקרת הרכבה על הרכבות בגודל מיקרומטר^16,17או שיהיה ברשותך תפוקת הרכבה מוגבלת^{מיכל 5}. בנוסף, יש המדווחים על מספר שלפוחיות של המבוסס על היכולת לפגום בפוטנציאל¹²או יציבות מוגבלת לאורך זמן⁹. הטיפול בחסרונות אלה, הפרוטוקולים המוצגים מאפשרים הרכבה עצמית של מבני מיקרומטר ומיקרומטר מולקולרי בגודל תת-מיקרומטר עם תכונות פיזיוכימיות ברורים, פוטנציאל מעטיפת טוב ויציבות זמן רב. מותאם במיוחד להרכיב מבנים מולקולריים, המשתרעים על-ידי מגוון כדורי וחבילות סיבים מעוותים לunilamellar שלפוחיות בהתאם לפרוטוקול המוחל ולתנאי הסביבה הקשורים. חלבון וממברנה גדול מבוססי קרום התאים (PMBC) לחשוף את כל פנוטיפים הראשי כגון פיוז'ן ממברנה התנהגות הפרדת פאזה אנלוגית ליפוזומים. PMBCs מכמס ביעילות מולקולות מטענים פלורסנט מגוונת אשר ניתן לפקח באמצעות מיקרוסקופ epiפלואורסצנטי פשוט. הדומיינים החוזרים ונשנים בשימוש במחקר זה הם אבני בניין אטרקטיבי עבור ארכיטקטורות מבוססות חלבון סופרא מולקולרית¹⁸. יחידת החזרה הפנטדית של סיוע (vpgvg) ידועה לסבול aa שונה מלבד פרולין בעמדה הרביעית (valine, V), תוך שמירה על מאפיינים מבניים ופונקציונלי¹⁹. העיצוב של ELPs אמפיפילי המכיל תחומים הידרופיפילית והידרופובי ייחודיים התממשו על ידי החדרת שאריות האורחים aa (X) ב VPGXG חזרה עם הידרופוטטי ברורים, קוטביות, טעינה²⁰. בתחומים שונים של הידרופובי (F) או איזולאוצין (I) בעוד התחום ההידרופילי הכיל גלוטמית חומצה (E) או ארגינין (R) כפסולת אורחים. ניתן למצוא רשימה של בנייה מתאימה של מבנים למען הילד ורצפי ה-aa במידע המשלים והפניות^8,21. כל אבני הבניין שבו מצוידים או עם צבעי פלורסנט קטנים או חלבונים פלורסנט עבור ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ ניאון. מגה-בוקס וחלבונים פלורסנט אחרים היו N-סופני התמזגו לתחומים הידרופילי של האמפיפינרס. הצבעים האורגניים היו מצוענים באמצעות מאמץ לקדם את הנחושת, לאחר שהוא הציג את חומצת האמינו הטבעית (UAA). התאגדות השיתוף המשותף של ה-UAApara-azidophenאלצין²²מתיר את השינוי של מסוף N. של התחום ההידרופילי בדרך זו צבע פלורסנט ירוק BDP-FL-יתד₄-DBCO (BDP) או כל מולקולה פלורסנט קטנה עם cyclooctyne מתוח יכול לשמש לווין פלורסנט. התאגדות מוצלחת של ה-UAA פזגז ו ציקלותוספת של הצבע באמצעות ספאץ ניתן לאשר בקלות באמצעות LC-MS/MS בשל אינון יעיל של פפטידים טריפטיים המקביל⁸. צבע אורגני קטן זה הוחל כדי להרחיב את בחירת הממס עבור פרוטוקולי ההרכבה, מאז חלבונים פלורסנט אינם תואמים את רוב המיסים האורגניים. שני פרוטוקולי ההרכבה היעילים ביותר עבור מבנים מולקולריים שפותחו במעבדה שלנו מתוארים להלן. שיטת הנפיחות THF תואם רק עם צבע אורגני שונה למען הטוב ביותר. לעומת זאת, 1-butanol (BuOH) שיטת ההבלטה תואמת חלבונים רבים כמו בדיקה פלורסנט לדוגמה mEGFP, מאז השיטה המתוארת משמר באופן מלא את הזריחה של אלה חלבונים היתוך. בנוסף, כימוס של מולקולות קטנות התנהגות היתוך vesicular עובד הטוב ביותר על ידי שימוש בשיטת BuOH שחול.

Protocol

1. עיצוב ושיבוט של לאלסטין שונים, כמו חלבונים (ELPs)

1. לשכפל ולעצב את המבנים כמתואר במקום אחר^8,20. המלון מציע שירותי פלמידים על פי בקשה.

2. ביטוי חלבון, טיהור והכנה

1. ביטוי של F20E20-מגלית וF20E20-מדובדבן
   1. החזר תרבות הביטוי העיקרי מן הלילה טרום תרבות עד OD₆₀₀ של 0.3. מודטה ב 37 ° c, 200 סל"ד ב סטרילי 400 mL ליברות בינונית בתוספת של אנטיביוטיקה מופקעים 2 L בקבוקון.
   2. הכינו פתרון מניות IPTG (1 מ ') עבור אינדוקציה של תרבות הביטוי במים באולטרטהורים.
   3. כאשר ה-OD₆₀₀ 0.5-0.8, הוסיפו לתרבות הביטוי iptg לריכוז סופי של 1 מ"מ והפחת את טמפרטורת הדגירה ל-20 ° c. אפשר ביטוי ב -20 ° c עבור כ 20 h ב 200 סל ד.
2. התבטאות בעלי משפט ומשפט המכיל את ה-UAA פזף
   1. ביטוי התרבות העיקרית של הביטוי הראשי של E. coli לפני התרבות המכילה את שני הפלמידים Pevol pET28 ו למשל-NMBL-(תג) R40F20-שלו כדי OD₆₀₀ של 0.3 (ראה מידע משלים עבור רצפי חומצות אמינו). מודטה ב 37 ° c, 200 סל"ד ב סטרילי 400 mL ליברות בינונית בתוספת עם kanamycin ו כלוראמאנקול בבקבוקון 2 L.
   2. הכינו מניות 100 מ"מ לפתרון מלאי של פזגז במים באולטרטהורים. עבור 10 מ ל של פתרון מניות של פזגז, שוקלים 206.2 מ"ג פזגז ולהשעות אותו ב 8 מ ל של מים אולטרה טהורים. כדי לפזר את פזגז להעלות את ה-pH של הפתרון עם 3 M NaOH ומערבבים במרץ. כאשר פזגז מומס, הנמך בזהירות את ה-pH כדי 10.5 ולהוסיף מים באולטרטהורים לנפח הסופי של 10 מ"ל. השתמש במסנן סטרילי (0.22 μm) ו-סדרת מחלקים הפתרון ב 2 שפופרות תגובה mL.
   3. להכין פתרון מלאי iptg 1 M במים באולטרטהור ו 20% אראבינוז מניות פתרון ב-אלקטרופורזה מים.
   4. כאשר מגיעים OD₆₀₀ 0.5-0.8, הוסיפו את התרבות הבהבעה לריכוז הסופי של 2 מ"מ. התרבות הדגירה עבור 10 דקות, 37 ° c, 200 rpm כדי לאפשר ספיגה של פזף.
   5. לגרום לביטוי של חלבון מטרה וביטוי של trna/t-RNA הצורך הדרוש באמצעות תוספת בו של iptg (1 מ"מ) ו אראבינוז (2%) ומפחיתים את טמפרטורת הדגירה ל-20 ° c.
   6. אפשר ביטוי ב -20 ° c עבור כ 20 h ב 200 סל ד. ביטוי הקציר תרבות על ידי צנטריפוגה ב 4 ° צ', 4000 x g, 40 דקות.
3. פירוק תאים וטיהור חלבונים
   1. השהה מחדש את גלולה ה-coli במאגר הליזה (10 מ ל לליטר התרבות; 50 mm טריס-HCl pH 8, 500 מ"מ הנאל, 4 מ שתנן, 0.25% טריטון X-100) המכיל ליזוזים (0.1 mg/mL) ו pmsf (0.1 mM). דגירה של 30 דקות על הקרח להקפיא ולהפשיר פעמיים לאחר מכן על ידי מיזוג המדגם בחנקן נוזלי.
   2. Sonicate ההשעיה (30%, 15 פעמים, 30 s: 10 s לשבור) ולנקות את הליפוסט דרך צנטריפוגה (4 ° צ', 10,000 x g עבור 40 דקות).
   3. טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה (למשל על עמודת ניקל בגובה 1 מ ל באמצעות מערכת FPLC המחוברת לאספן שברים; ראו טבלת חומרים). אליוט חלבון עם מאגר להתחמק (50 mM טריס-HCl, 500 מ"מ הנאל, 4 מ אוריאה, 250 – 500 מ"מ הסרפיזציה) ולחנות ב 4 ° צ' עד לעיבוד נוסף.
   4. לנתח את יעילות הטיהור באמצעות SDS-PAGE.

3. צבען-שינוי של ELPs באמצעות ספאץ

1. מעריכים בערך את הריכוז. של פתרון המענה העצמי  ₂₈₀ הקליטה להערכת הריכוז אינה חשובה מאז הרצף של פזגז-R40F20 הוא חסר חומצות אמינו קליטת בטווח UV. לכן, ניתן להשתמש באפשרות זו בתור התייחסות להשוואת הלהקה של SDS PAGE. באמצעות השוואה בין שווי הערך האפור הסוכם של להקות העמודים של SDS באמצעות ריכוזים ידועים והדגימה שלך, ניתן להעריך את הריכוז הגולמי של המדגם.
2. להוסיף 1 μL של צבע פלורסנט BDP-FL-PEG4-DBCO (10 מ"מ פתרון במניה; 20 הריכוז הסופי μM) עד 500 μL של פתרון לתמיסת הסקה (~ 20 μM). מודגנת את התגובה על 10 h ב 15 ° c, תוך טלטול ומוגן מפני אור.
3. לשימוש נוסף, dialyze התגובה להסרת BDP מוגזם.
   1. מקלדת קרום דיאליזה (כגון הפסקת כמות של 12 מטרים) במים אולטרה טהורים במשך 10 דקות. חותכים את קרום הדיאליזה לגודל הנכון כדי להיות ממוקם על גבי הפתיחה של צינור התגובה המכיל את הפתרון בקליק. כדי לתקן את קרום דיאליזה בפתח, מניחים מכסה צינור התגובה עם אגרוף ליבה על הפתח, ובכך לסגור את הצינור.
   2. מניחים את צינור התגובה הפוך במאגר שנבחר. להחליף את המאגר (2 – 5 L) פעמיים אחרי דיאליזה עבור לפחות 3 h בכל פעם. הסר את בועות האוויר לכוד בין קרום הדיאליזה לחיץ כדי להבטיח דיאליזה מוצלחת.

4. פרוטוקול נפיחות של THF

1. Dialyze פתרון הומוגנית לתמיסת מלח נגד פוספט או טריס מאגר (10 מ"מ) עם 7.5 יציב pH כדי להסיר מלחים והשאר תרכובות מתוך טיהור תג שלו.
2. הכן את הליאופליזר והקר את הטמפרטורה כדי להתחיל בייבוש.
3. מחלקים את תמיסת החלבון דיאליזה בצינורות התגובה 1.5 mL (50 – 500 μl לצינור) והקפאת זעזועים בחנקן נוזלי. כדי למנוע ערבוב לא רצויים של פתרונות חלבון שונים במהלך הקפאת לייבוש, כובעים עם חור קטן ניתן לשים על גבי צינור התגובה כדי לאטום אותו באופן חלקי.
4. קחו את דגימות החלבון הקפוא מתוך החנקן הנוזלי ומיד מניחים אותם בליאופליזר כדי להתחיל בייבוש. ייבוש ההקפאה הוא סיים כאשר המדגם יבש לחלוטין (כ 24 – 48 h). לאחר מכן, באופן מיידי לסגור את שפופרת התגובה היבשה עם N₂יבש, ולאחר מכן סגרו מיד את עפעפיו של הריאקציה כדי למנוע מגע עם לחות האוויר.
5. הוסיפו THF טהורה לדגימות הלינולים (לדוגמה, 5 – 10 μM) ומניחים את הפתרון באמבט מים sonicator המכיל מי קרח במשך 15 דקות כדי לאפשר נפיחות של הטוב ביותר ב THF.
6. מחממים את הציקלל1 עד 30 – 60 ° צ' עבור היווצרות שלפוחית המים או עד 90 ° c עבור היווצרות סיבים ולהכין צינורות תגובה חדשה המכילה או בדקה אלקטרופורזה או מאגר (50 mm ארנה₂פו₄/Na₂hpo₄, 50 מ"מ הנאקל, pH 5 – 13). הרכב כדורי התאספו בעיקר ב -20 ° c בתוך pH 9-13. היווצרות שלפוחית הוא המועדף על 50-60 ° צ' בין pH 7 ו -9. היווצרות סיבים המושרה בעיקר מעל 60 ° צ' בין ה-pH 5 ו 12.
7. לאחר השלב הsonication, מניחים את התמיסה לשתיה/THF, כמו גם את הפתרון המוכן במיוחד למים או לאגירה בתוך הציקלהטרטרנר ומחממים עד לטמפרטורה הרצויה במשך 5 דקות. כאשר הטמפ ' מגיעה לפתרון של מחמם המים החמים והמחוממים, יש למלא את התמיסה הגבוהה ביותר באמצעות מיים או מאגר. הפרדה ברורה של שני השלבים עם ממשק ייחודי צריכה להיות גלויה.
8. מניחים את התערובת בתוך הציקלייט שוב ו-דגירה עבור 20 דקות כדי לאפשר שלפוחית או היווצרות סיבים בממשק. לאחר מכן, תנו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לפני הניתוח באמצעות מיקרוסקופ קרינה או דיאליזה.
9. הפתרון dialyze המכיל את המבנים supraמולקולריים נגד מים באולטרסאונד או מאגר (50 mM ארנה₂פו₄/Na₂Hpo₄, 50 מ"מ הנאל, pH 7 – 10).

5. פרוטוקול BuOH שחול

1. להכין 1 – 50 μM פתרון לתמיסת מיים במים או במאגר (50 mM PB pH 7.5, 100 mM הנאקל, עשוי להכיל עד 4 M אוריאה). הריכוז של הפתרון האמפיבי F20R20-mEGFP ו F20R20-mCherry ניתן לקבוע באמצעות מקדמים מהכחדה מולרי (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 m^- 1^{ס"מ-1 ו F20R20} -Mcherry a₂₈₀ = 34380 m^-1 ס"מ^-1) (ראה מידע משלים עבור רצפי aa).
2. הוסף 10% – 20% (v/v) 1-butanol ומיד לערבב את הפתרון על ידי ליטוף למעלה ולמטה או לצייר אותו באמצעות מזרק מספר פעמים. 100 משותף μL הפיפטה או מזרק המילטון מצויד המחט 0.25 x 25 מ"מ ניתן להחיל. העכירות של הפתרון במהלך ערבוב צריך להגדיל, המציין היווצרות שלפוחית. 1-octanol 5% – 15% (v/v) ניתן להשתמש גם עבור שחול ושלפוחית במקום 1-butanol.
3. על מנת להשיג התפלגות בגודל צר, הבלטת שלפוחיות באמצעות משטח הבלטת ממד דרך קרום עם גודל נקבובית של 1 יקרומטר בטמפרטורת החדר. גודל הממברנה המשמש להבלטה קובע את החיתוך בגודל העליון של השלפוחיות.
4. Dialyze השלפוחית כפי שתוארה לעיל (שלב 3.3) כדי להסיר שיורית 1-butanol.

6. עטיפת צבע עם פרוטוקול BuOH ההבלטה

1. מערבבים כ 40 μL פתרון בערך 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8 עם 1 μL Dextran טקסס אדום (0.0025 mg/mL הריכוז הסופי).
2. הוסף 10 μL של BuOH לפתרון ואת הבלטת 5 – 10 פעמים דרך מזרק מצויד במחט 0.25 x 25 מ"מ.

7. ניתוח מבנים מולקולריים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

1. מניחים טבעת חיזוק על שקופית זכוכית ולחץ בחוזקה על הצד הדביק לזכוכית.
2. הוסף 5 μL של המדגם לתוך החלק הפנימי של טבעת חיזוק ולמקם שובר כיסוי על גבי.
3. חותם את המדגם עם לק ציפורניים בקצות שובר הכיסוי כדי למנוע אידוי של המדגם במהלך הניתוח.
4. לבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטית כמתואר בעבר⁸.

תוצאות

פיתוח פרוטוקולים לייצור ושלפוחית
איור 1 מתווה את שתי שיטות ההכנה השונות של שלפוחית הדעת. שיטת הנפיחות THF בצד שמאל מורכב משלושה שלבים רצופים ותוצאות הרכבות supraמולקולריים שונים של הטוב ביותר בהתאם לטמפרטורה. באיור 1A תמונות מיקרוסקו...

Discussion

תקלה בזמן השימוש בפרוטוקולים המתוארים להרכבת מבנים מולקולריים מוגדרים, מובילה בעיקר להיווצרות אגרגטים לא ספציפיים (איור 2, IV) או להפצת הומוגנרים. שלבים קריטיים של הפרוטוקול נדונים להלן:

בעבור התשואה הגבוהה של המידע האמפיבי, טמפרטורה נמוכה יחסית של 20 ° c היא א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth