JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן היא פלטפורמה מיקרוסקופית multiphoton עבור הדמיית פני השטח עינית עכבר חי. עכבר טרנסגני פלורסנט מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב ונימים בתוך פני השטח עינית. אותות לא ליניאריים של הדור ההרמוני השני הנגזרים ממבנים קולגניים מספקים הדמיה ללא תוויות עבור ארכיטקטורות סטרומה.

Abstract

ניתוח היסטולוגי קונבנציונלי ומערכות תרבות תאים אינם מספיקים כדי לדמות בדינמיקה פיזיולוגית ופתולוגית vivo לחלוטין. Multiphoton מיקרוסקופית (MPM) הפך לאחד מנודות ההדמיה הפופולריות ביותר עבור מחקר ביו רפואי ברמות התא vivo, היתרונות כוללים רזולוציה גבוהה, חדירה לרקמות עמוקות וphototoxicity מינימלי. עיצבנו פלטפורמת הדמיה MPM עם מחזיק עיניים מותאם אישית של העכבר ושלב סטריאו-קסי להדמיית משטח עיני ב-vivo. עכבר כתב חלבון פלואורסצנטי כפול מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב, ונימים בתוך פני השטח עינית. בנוסף לאותות פלואורסצינליים מרובי פוטון, רכישת הדור ההרמוני השני (SHG) מאפשרת בו זמנית אפיון של ארכיטקטורת סטרומה קולגנית. פלטפורמה זו יכולה להיות מועסקת עבור הדמיה תוך-ויטלית עם מיקום מדויק על פני כל פני השטח עינית, כולל קרנית ולחמית.

Introduction

מבני פני השטח עינית, כולל הקרנית והלחמית, להגן על רקמות עיניות עמוקות אחרות מפני הפרעות חיצוניות. הקרנית, החלק הקדמי השקוף של העין, מתפקדת הן כעדשה שבירה להכוונון האור לתוך העין והן כמחסום מגן. אפיתל הקרנית הוא השכבה החיצונית ביותר של הקרנית ומורכב שכבות נפרדות של תאים שטחיים, תאי כנף ותאי בסיס. הקרנית סטרומה מורכבת מלמלה קולגניים ארוזה ומתוחכמת המשובצת בקרטוציטים. אנדותל קרנית, שכבה אחת של תאים משושים שטוחים, יש תפקיד חשוב בשמירה על השקיפות של הקרנית על ידי שמירה על סטרומה הקרנית במצב מיובש יחסית באמצעות פונקציות השאיבהשלה 1. לימבוס יוצר את הגבול בין הקרנית ללחמית, והוא מאגר תאי גזע אפיתל קרנית2. הלחמית עם כלי הדם מסייעת לשמן את העיניים על ידי ייצור ריר ודמעות3.

דינמיקת התא של מבני פני הקרנית נחקרים באופן קונבנציונלי על ידי ניתוח היסטולוגי או בתרבות תא במבחנה, אשר לא יכול לדמות כראוי את הדינמיקה בתא vivo. גישה לא פולשנית של הדמיה חיה יכולה, לפיכך, לגשר על הפער. בשל יתרונותיו, הכוללים רזולוציה גבוהה, פוטו-חום מינימלי ועומק הדמיה עמוק יותר, MPM הפך לעוצמתיות רבה בתחומיםשונים של מחקר ביולוגי 4,5,,6,7,8. עבור הדמיית קרנית, MPM מספק מידע סלולרי משפעת אוטומטית פנימית הנגזרת מ- NAD(P)H התוך תאי. הדור ההרמוני השני (SHG) אותות נגזרים מסוג שאינו centrosymmetric אני סיבי קולגן תחת סריקת לייזר femtosecond מספק מבנים סטרומה קולגניים ללא הליכי כתמים נוספים9. בעבר, אנחנו וקבוצות אחרות ניצלנו MPM להדמיה של קרניות בעליחיים ואדם 9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.

קווי עכבר טרנסגניים המציגים חלבוני פלורסנט באוכלוסיות תאים ספציפיים שימשו באופן נרחב עבור מחקרים שונים בביולוגיה של תאים, כולל פיתוח, הומוסטאזיס רקמה, התחדשות רקמות, קרצינוגנזה. השתמשנו זנים עכבר transgenic עם תווית עם חלבונים פלורסנט עבור הדמיית vivo שלקרניות 9,,10,זקיקישיער 10 ו אפידרמיס10 על ידי MPM. זן העכבר הפלואורסצנטי הכפול עם קרום התא המסומן ב- tdTomato וגרעין התא המתויג ב- EGFP גדל משני זנים של העכבר: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA )26סורtm1Ytchn/J, #021847)16 ו- mT-mG (GT(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. קו העכבר הטרנסגני R26R-GR מכיל מבנה כפול של כתב חלבון פלורסנט, כולל גן היתוך H2B-EGFP והגן היתוך אות עוגן mCherry-GPI, מוכנס לתוך Gt (ROSA)26Sor לוקוס. הזן הטרנסגני mT-mG הוא קרום תא ממוקד tdTomato ו EGFP פלורסנט Cre-כתב עכברים. לפני Recombination Cre, חלבון קרום התא עם ביטוי פלואורסץ tdTomato קיים באופן נרחב בתאים שונים. זן עכבר טרנסגני זה מאפשר לנו לדמיין גרעין-EGFP וממברנה עם tdTomato ללא עירור Cre. שתי נקבות (R26R-GR+/+) וזכר אחד (mT-mG+/+) חוברו יחד כדי לייצר עכברים מספיקים לניסויים. צאצאיהם עם R26R-GR+/-;mT-mG+/- גנוטיפ, זן עכברים פלורסנט כפול, שימשו במחקר זה. בהשוואה לקו עכבר אחד כתב פלורסנט כפי שתוארקודם לכן 9,10, זן עכבר פלורסנט כפול זה מספק לנו 50% רכישה מופחתת של זמן הדמיה.

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול טכני מפורט להדמיית vivo של פני השטח עינית באופן שלב אחר שלב באמצעות פלטפורמת ההדמיה שלנו ועכברים טרנסגניים פלואורסצנטי כפול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת טייוואן הלאומית ו בית החולים צ'אנג גאנג ממוריאל.

1. הגדרת מיקרוסקופים מולטיפוטונים

  1. לבנות מערכת המבוססת על מיקרוסקופ זקוף עם טבילה מים 20x 1.00 NA המטרה (איור 1A).
  2. השתמש Ti: לייזר ספיר (עם אורך גל tunable) כמקור העירור. הגדר את אורך הגל של פלט הלייזר ב- 880 nm עבור EGFP ו- 940 נה"מ עבור tdTomato (איור 1A).
  3. כלול שתי מראות דיקרויות (495 נק' ו- 580 נה"מ) להפרדה בין SHG/EGFP ו- EGFP/tdTomato(איור 1A). ספקטרלי להפריד את אותות SHG, EGFP ו tdTomato על ידי מסנני bandpass 434/17nm, 510/84nm ו 585/40nm (איור 1A).
  4. על מנת לייעל את איכות התמונה ולהימנע מצילום ונזק לרקמות, להגדיר את כוח הלייזר להיות על 35 mW עבור הקרנית הדמיה ו 50 mW עבור לימבוס. למדוד את כוח הלייזר לפני הלייזר עובר את המערכת האופטית. כוח הלייזר המדויק על דגימות הוא על 8-9 mW. העיצוב המיקרוסקופי המלא מוצג באות 1A.
    הערה: הגבול העליון של כוח לייזר מוגדר 70 mW כדי למנוע הלבנת תמונה ונזק לרקמות.

2. הכנת בעלי חיים להדמיה חיה

  1. השתמש בעכברים בני 8-12 שבועות לניסוי. תוך שרירי להזריק 50-80 מ"ג/ק"ג של אריחים HCl ו HCl zolazepam להרדמה כללית. בדוק אם חוסר תגובה רפלקס נסיגה על ידי צביטת בהון. חינוי מספיק חשוב כדי לאפשר ניטור קצב נשימה יציב.
    הערה: עכברים בגיל 8 שבועות ומעלה מומלצים מכיוון שהעין שלהם התבגרה.
  2. מניחים את העכבר תחת הרדמה על במה מחוממת והכניסו את הגשוש לניטור טמפרטורה לפי הטבעת.
    התראה: יש להכניס את הגשוש במלואו לחלל האנאלי ללא חשיפה לאוויר, כדי להימנע מהתחממות יתר של התנור והשראה של מכת חום.

3. מחזיק עין להדמיה חיה של פני עינית

  1. להדמיה חיה של פני השטח העיניים, השתמשו במחזיק העכבר הסטריאו-מסה מותאם אישית המורכב משני חלקים: מחזיק ראש כדי לייצב את הראש ומחזיק עיניים כדי למשוך את העפעפיים ולחשוף את כל משטח העינית(איור 1B-D).
  2. הכנס את אטמי האוזן לתוך המיטוס השמיעתי החיצוני ולשמור על קיבעון של שלוש נקודות של בעל הראש (איור 1ב', ד).
  3. Topically להחיל פתרון של 0.4% אוקסיבופרוקאין הידרוכלוריד בתמיסת מלח ולהשאיר אותו במשך 3 דקות כדי להנימה את פני השטח עינית.
  4. ודא שגלגל העין בולט על ידי נסיגה ידנית נכונה של העפעפיים. אחרת, איסכמיה ודימום של גלגל העין יכול להתרחש.
  5. בזהירות למקם לולאה של צינור פוליאתילן של מחזיק עיניים לאורך שולי העפעף כדי לחשוף את פני השטח עינית. לייצב את גלגל העין עם מחזיק העין מורכב מ מקצות דומונט מס ' 5 עם קצותיה מכוסים בלולאה של צינור פוליאתילן (איור 1C,D).
  6. בורג מקצות באמצעות ידית במקציצות דיסטלי של מחזיק עיניים כדי לשמור על גלגל העין יציב(איור 1D).
  7. למרוח ג'ל עיניים עם אינדקס שבירה של 1.338 על פני השטח הקרנית כמדיום טבילה כדי לשמור על הלחות של פני השטח עינית בכל שעה. בנוסף, יישום קבוע של ג'ל העין בכל שעה להימנע מענן בקרנית במהלך ההדמיה.
  8. לסובב את גלגל העין עם המחזיק הנעול על השלב הממונע צעד להדמיה על פני פני הקרנית כולה מן הקרנית המרכזית לאזור ההיקפי(איור 1C,D).
    התראה: הן כמויות עודפות והן כמויות לא מספיקות של ג'ל עיניים יכול להשפיע על איכות התמונות במהלך ההדמיה. לכן, השלמת ג'ל עיניים כל שעה כדי לשמור על פני השטח לחים באופן קבוע חשוב להדמיה.

4. רכישת תמונה טורית Z

הערה: הגדר את השקופית הראשונה והאחרון בכל מחסנית כדי להפחית את חפצים תנועה שחרור.

  1. לפני צילום התמונות, צלם את שדה המטרה עם מקור אור כספית.
  2. לחץ על הסמל של תוכנת המיקרוסקופ כדי להפעיל את התוכנה.
  3. בחר רווח PMT נכון רווח דיגיטלי כדי לדמיין את המבנה התאי במשטח עינית.
  4. הגדר את השקופית הראשונה ואת השקופית האחרונה כדי להשיג מחסנית.
  5. הזן ערכים מספריים עבור רזולוציית תמונה ו- z-step, לדוגמה, 512 x 512 ו- μm אחד כ- z-step.
  6. לחץ על לחצן התחל כדי לאסוף תמונות z-serial.
  7. לרכוש תמונות חיות פעמיים באותו אזור, הראשון ב 880 נארם excitation עבור אוסף אותות SHG / EGFP והשני ב 940 צפון צפון מטרים עבור איסוף אותות EGFP / tdTomato.
    הערה: השילוב של שתי ערימות מספק 3 תמונות ערוצים. רזולוציית התמונה וגודל תבנית הסריקה היו 512 x 512 פיקסלים ו- 157 μm x157 μm, בהתאמה.

5. עיבוד תמונה ושחזור תלת-ממדי

  1. טען את התמונות z-serial לתוך תוכנתפיג'י 18.
  2. בחר את המסנן 3D חציון תוסף בפיג'י כדי להפחית את רעשי הרקע.
  3. בחר במסנן 'בטל ערפד מסיכה חבילה' בפיג'י כדי לחדד את התמונות.
  4. לחץעל" אוטומטי " בבהירות /ניגודיות כדי למטב באופן אוטומטי את איכות התמונות.
  5. שמור את התמונות כרצף תמונות כדי שתוכל לייצא את התמונות z-serial.
  6. טען תמונות z-serial לתוכנות מסחריות (לדוגמה, Avizo lite) לשחזור תלת-ממדי באמצעות עיבוד אמצעי אחסון.
  7. בכל תמונות MPM, הצג אותות EGFP, tdTomato ו- SHG בצבע פסאודו-ירוק, אדום וציאן בהתאמה.
  8. לכוד תמונות מבנה תלת-מית-די לפי התמונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות פלטפורמת הדמיה חיה זו, ניתן לדמיין את משטח עיני העכבר ברמות התא. כדי לדמיין תאים בודדים בודדים במשטח עינית, העסקנו את העכברים הטרנסגניים הפלואורסצנטיים הכפולים עם EGFP המבוטא בגרעין וב-tdTomato המתבטאים בממברנה התאית. סטרומה הקרנית העשירה קולגן היה מודגש על ידי אותות SHG.

?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פלטפורמת הדמיה MPM מותאמת אישית זו עם תוכנת בקרה שימשה להדמיה תוך-ויטלית של איברי אפיתל עכבר,כולל עור 10,זקיק שיער 10 ומשטחעינית 9,10 (איור 1A). המערכת הבנויה בהתאמה אישית שימשה לגמישותה בשינוי הרכיבים האופטיים לניסויים ש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לתמיכת המענק ממשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), בית החולים הלאומי של אוניברסיטת טייוואן (NTUH108-T17) ובית החולים צ'אנג גאנג ממוריאל, טייוואן (CMRPG3G1621, CMRPG3G16222, CMRPGPG3G1623).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite softwareThermo Fisher ScientificVersion: 2019.3.0
Bandpass filtersSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrorsSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO control softwareSouthPort CorporationJade BIO
Oxybuprocaine hydrochlorideSigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Polyesthylene TubeBECTON DICKINSON427401
Stereotaxic mouse holderStep Technology Co.,Ltd000111
Ti: Sapphire laserSpectra-PhysicsMai-Tai DeepSee
Upright microscopyOlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013(2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171(2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159MPM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved