אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

Summary

עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.

Abstract

התרבויות העובנותיות בכליות, ובעיקר בתאי גזע מסוג pluripotent, הם כלים מצוינים לטיפול בתהליכים ההתפתחותיים ובמחלת כליות הדוגמנות. עם זאת, המודלים מוגבלים על ידי חוסר vascularization ופונקציונליות. כדי לענות על כך, פרוטוקול משופר עבור השיטה של השתלת תאים ורקמות של xenooallאנטומי הקרום (CAM) של העובר העופות לקבל vascularization ושחזור זרימת הדם פותחה. השתלים מצופים בהתאמה אישית מיני מאגרים כי לתקן את הדגימות כדי CAM ולספק להם במדיום התרבות המגנה על השתלים מייבוש. שיטת התרבות המשופרת מאפשרת לגדל שתלי xenografts עד 9 ימים. כתב היד גם מתאר כיצד לספק תנאים אופטימליים לדימות ממוקד לטווח ארוך של מארגני כליות ותרבויות אורגאוטימית באמצעות שיטת הפעולה שפורסמה בעבר כיוון Z (FiZD). שיטה זו דוחסת בעדינות איבר עובריים או אורגנואיד בין שמיכות זכוכית ממברנה בכמות גדולה של בינונית ומספק תנאים מצוינים לדימות עד 12 ימים. ביחד, שיטות אלו מאפשרות זרימת הדם והזרמת דם לאורגנואידים כליות ולתרביות כליות אורגאוטיאית עם הדמיה משופרת של מיקוד. השיטות המתוארות כאן הן מועילות מאוד ללימוד פונקציות בסיסיות ומוחלות של כליות לשעבר vivo. שתי השיטות חלות על סוגים שונים של רקמות ואורגנואידים.

Introduction

התרבות האורגנותית של הכליות העובריים הפכה למודל חשוב ללמוד נפרוגנזה לפני עשורים^1,2,3. אורגנואידים כליות מייצגים מערכת מודל מתקדמת לחקר התפתחות של כליות בריאה וחולה⁴. עם זאת, החיסרון העיקרי בשתי השיטות הוא שהשיטה אינה משנה את התפקוד העיקרי של הכליה: סינון דם. הנליות והכליות מתפתחות בתרביות כליות ובתרבויות אורגנואיות, בדומה לשלב מוקדם בפיתוח vivo; עם זאת, הפקולי הנוצרת בתוך מבחנה, נשארות נמק העצם⁵. Vascularization לשעבר הכליות העובריים ואורגנואידים הכליה הפגינו בעבר ניסויים השתלת רק תחת בתנאים vivo. לדוגמה, השתלת תא גזע בעוצמה האנושית של כליות מתחת לקפסולה העכבר מאפשר פיתוח של הנליות בארגון האורגנואיד לשלב פונקציונלי⁶.

גישה ביניים בין גרידא בתרבויות מבחנה ובשיטות השתלת vivo הוא xenotransplantation שתלת כדי מצלמת עוברי העופות. Vascularization של כליה כליות העכבר השלם הוכח בעבר באמצעות מערכת זו^7,8. עם זאת, זה הוכח גם כי הכליות כליות בכליה murine המושתלים היה נגזר מהמארח אנדותל, לא את השתל⁹. התבוננות זו הפחיתה באופן משמעותי את הפוטנציאל של מודלים של כליה עובריים (העופות-יונקים) של כלייה מתחלקים ללמוד פיתוח של הכליות כליות, כי התנאים הניסיוניים היו לא מתירני להישרדות של תאים שמקורם בתורמים.

המוצגים בחלק הראשון של פרוטוקול זה היא שיטה משופרת לטיפוח של כליות עובריים של העכבר על מצלמת ביצי עופות, שילוב של תנאים מיקרו סביבתיים של תרבות ארגונית ו-xenotransplantation שתלת. השיפור העיקרי השיטות הקודמות היא כי במקום למקם את הכליות מעובריים וכליות אורגנואידים ישירות על מצלמת הרשת, אזור ההשתלה מצופה במיני מאגרים חדיר מלאים במדיום התרבות כי לספק את הרקמה המושתלת עם חומרים מזינים ולהגן עליו מפני ייבוש. שיעור ההצלחה של הניסויים גדל באופן משמעותי והתנאים לפיתוח של ואסיקובלטורה המופק על ידי תורמים משפרים. היישום של שיטה זו לתרבויות xenotransplant שתלות תוצאות בפיתוח של בנייה של הפקלותתיל מורכב של תאים אנדוגאל אנדוסוגאל מכליות התורמים.

ניתוח מפורט של הסלולר מורפולגנזה הוא יישום נוסף חשוב של מודלים תרבות הכליה. שיטות שדווחו בעבר על רכישת תמונות בזמן הקפיצה של תרביות כליות מספיקות רק לניתוח של מורפולוגיה כוללת ומחקר של כליה עובריים, אך לא למעקב אחר תאים בודדים¹⁰. לאחרונה, הרומן קבוע Z-כיוון (fizd) שיטה שמטרתה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית וקד 3d זמן הדמיה של מאורגנואידים כליות ותרבויות אורגאוטימית תוארה¹¹. בשיטה זו, אורגנואידים והאיברים העובריים דחוסים בעדינות בין שמיכות זכוכית קרום חדיר של הכנס transwell בלוח מעוצב מותאם אישית עד עובי המדגם מגיע 70 μm, מתן תנאים אופטיים אופטימליים עבור הדמיה. בחלק השני של השיטות, פרוטוקול מפורט לייצור של צלחת מעוצב מותאם אישית והכיוונון של הניסויים FiZD עבור הדמיה לטווח ארוך של אורגנואיד מתואר.

Protocol

טיפול בבעלי חיים ונהלים היו בהתאם לחקיקה הלאומית הפינית לשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, האמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשות למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות (ETS 123), והוראת האיחוד האירופי 86/609/EEC.

1. ייצור מיני מאגרים לטיפוח הכליות העכבר מעובריים כליות אורגנואידים על מצלמת עוף והגדרת ניסויים xenotransplantation שתלת

1. השתמש מוסיף תרבות התא המיועדים 6 טוב או 12 צלחות היטב.
   הערה: בהתאם לניסוי המסוים, ניתן להשתמש במינימאגרים גדולים או קטנים. עדיף להשתמש במיני מאגרים קטנים עבור השתלה של שתלה עד שמונה כליות עובריים או כאשר מיני מאגרים יהיה להציב על אותו עובר עוף (g., ניסוי ובקרה דגימות על אותו מצלמת עוף).
2. חותכים את הצדדים של התוספות באמצעות מרובה רוטרי עם להב מסור עגול או יד מסור ליצור טבעת 2 מ"מ פלסטיק גבוהה עם קרום חדיר המצורפת אליו.
3. להבריק את הקצוות של מיני מאגרים אלה עם אזמל או סכין חדה.
4. לחטא את המינימאגרים ב 70% אתנול לפחות 1 h.
5. רוחצים את מיני המאגרים במים מזוקקים כפולים, ומאפשרים להם להתייבש בשכונה שכבתית.
6. שטפו את מיני המאגרים ב-PBS ובמדיום התרבותי (מדיום גבוה/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין).
7. מניחים את המאגר בצלחת פטרי, על גבי טיפה (600 μL/400 μL) של מדיום התרבות עם הקרום פונה כלפי מעלה.
8. לסדר את הכליות vivo עובריים או כליות אורגנואידים באופן שווה על הקרום בעזרת פיפטה או צינור נימי זכוכית. להימנע מהשארת הרבה נוזל סביב הכליות.
9. תנו לדגימות להתחבר לקרום עבור 2 – 24 שעות בחממה לתרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
   הערה: עד שמונה כליות העכבר העובריים 11.5 או אורגנואידים כליה ניתן לארגן על הכנס הקטן. התוספת גדול מומלץ אם חתיכות גדולות יותר של רקמה עובריים ישמש עבור xenotransplant שתלה או שילוב תא הידרוג'ל על אזור גדול יותר של מצלמת.
10. לקחת שמונה ימים-לשעבר העופות העובריים מתורבת הוכנו על פי שיטות שפורסמו בעבר מתוך חממה תרבות התא^12,13.
11. להעביר את המינימאגרים כדי CAM כך את השתלים פונים מצלמת, ואת הקרום שכבות אותם. מניחים את המיני מאגרים בפריפריה של CAM, כך שהם לא מכסים את העובר עוף.
    הערה: כאשר משתמשים מיני מאגרים קטנים מפוברק מוסיף transwell עבור 12 לוחות היטב, עד שלושה minireservoirs ניתן להציב על מצלמת אחד.
12. הוסף 500 μL (6 הכנס היטב) או 300 μL (12 הוספה טובה) של התרבות הבינונית למינימאגרים.
13. לטפח דגימות על עוף CAM עבור מקסימום של 9 ימים. החלף את מדיום התרבות במינימאגרים מדי יום.
    הערה: Vascularization של הדגימות ניתן לצפות ברגע 24 – 48 h לאחר ההשתלה.

2. ייצור צלחות מותאמות אישית והגדרת תרבויות FiZD

1. מקדחה 20 מילימטר חורים בקוטר בחלק התחתון של 6 צלחת הבאר.
   הערה: עבור ניסויים FiZD, השתמש 6 צלחות טוב עם עומק 16 מ"מ היטב (מצוין בטבלה של חומרים).
2. להבריק את החישוקים של החורים (בעיקר בצד העליון) באמצעות מקדחה חשמלית עם סיבית מקדחה כיור, אזמל, או סכין חדה.
3. לחטא את הצלחות ב-70% אתנול לפחות 1 h.
4. רוחצים את הצלחות במים מזוקקים כפולים, ומאפשרים להם להתייבש בתנאים סטריליים.
5. לשטוף ביסודיות 22 מ"מ x 22 מ"מ שמיכות זכוכית עם 70% אתנול או לנקות אותם על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי זארזלה ואח '¹¹.
6. הדבק את הכיסויים בצד העליון של החורים ב 6 צלחות היטב באמצעות דבק רקמות לא רעיל. החלת דבק סביב החור ובעדינות למקם את coverslip כדי לכסות אותו. . תן לדבק להתייבש
7. בדוק את לוחיות תחת stereomicroscope ולהסיר דבק מיובש עודף מפני השטח של הכיסויים במידת הצורך.
   הערה: בדוק כי אין דבק מעל coverslip כדי להבטיח אפילו דחיסה של דגימות.
8. מערבבים פוליסטירן מוקצף (70 יקרומטר בגודל חלקיק) עם נפח שווה של הידרוג'ל. נפח של 50-100 μL לכל טוב הוא מספיק.
   הערה: שמרו על התערובת של הידרוג'ל ומחרוזות פוליסטירן על קרח.
9. מניחים הוספת העברה מתחת למיקרוסקופ מבתר עם הקרום למעלה.
10. לסדר את הדגימות (למשל, לשעבר vivo עובריים כליות או אורגאונואידים כליות) באופן שווה על הקרום.
11. הוסיפו את ההידרוג'ל/פוליסטירן מוקצף לצד הדגימות בזהירות כדי למנוע נזק לרקמות שבירות.
12. הפוך את התותב להוסיף כך את הקרום עם דגימות שנאספו עליו הוא פונה כלפי מטה.
13. בעדינות למקם את ההכנסה לתוך באר של שונה 6 צלחת הבאר בעדינות ללחוץ אותו למטה כך דגימות נדחסים לרמת החרוזים.
    הערה: בצע את ההתקדמות של הדחיסה באמצעות מיקרוסקופ.
14. לשמור על הוספת לחצה מעט לבאר עם יד אחת ולתקן אותו לצלחת על ידי ההיתוך פלסטיק עם ברזל הלחמה בשלוש נקודות בפריפריה של הכנס.
15. כאשר ההכנסה מתוקנת לצלחת, להוסיף 2 מ ל של תרבות בינונית (DMEM/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין) ולהמשיך להרכיב את שאר הבארות בצלחת באותו אופן.
16. העבר את הצלחת המוגמר לחממה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך לדימות זמן.
17. בצע הדמיה בזמן הדמייה של דגימות באמצעות הגדרות ניסוי מתאים.
    הערה: שינוי מדיום התרבות בבארות הצלחת במהלך ניסויים בזמן, אינו נדרש, אך ניתן לעשות זאת בקלות דרך החורים בצידי התותב.

תוצאות

פרוטוקול התרבות פקה הציג כאן איפשר והוא יעיל מאוד vascularization של כליות אורגנואידים וכליות עובריים כתוצאה של xenotransplantation שתלת על עוף מצלמת (איור 1, סרט 1). מיני מאגרים המכילים בינונית תרבותית שסופקו חומרים מזינים לרקמת תורם והגנה אותו מפני ייבוש במהלך תקופת הזמן לפני vascu...

Discussion

שני פרוטוקולים מפורטים מוצגים המחדד את שיטת התרבות הקלאסית כליות אורגנותמית, ולאפשר vascularization, התפתחות מורחבת, ו 4D אופטימלי (כלומר, 3D תמונה וזמן) הדמיה של כליות vivo עובריים ואורגנואידים. סעיף זה מדגיש את השלבים הקריטיים בשיטות ודן בפתרון בעיות.

ההבדל המשמעותי בין שיטות אחרות ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610